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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Adaptation de l’hybridation prise de protéines associées à la chromatine pour la protéomique pour les cellules de mammifères

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/57140
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 3, 3, 1,2
1Department of Genetics, Texas Biomedical Research Institute, 2Department of Internal Medicine-Molecular Medicine, Wake Forest University School of Medicine, 3Department of Chemistry, University of Wisconsin

Summary

Il s’agit d’une méthode pour identifier de nouvelles protéines interagissant avec ADN loci cible spécifique, en s’appuyant sur la capture de séquences spécifiques de chromatine réticulée pour analyses protéomiques ultérieures. Aucune connaissance préalable de protéines de liaison potentielle, ni modifications cellulaires ne sont nécessaires. Initialement développé pour la levure, la technologie a été adaptée pour les cellules mammifères.

Abstract

La capture de l’hybridation des protéines associées à la chromatine de technologie protéomique (HyCCAPP) a été initialement développée pour découvrir de nouvelles interactions ADN-protéine dans la levure. Il permet l’analyse d’une zone cible d’intérêt sans besoin de connaissances préalables sur les protéines probables lié à la région cible. Ceci, en théorie, permet HyCCAPP à utiliser pour analyser n’importe quelle région génomique d’intérêt, et il fournit suffisamment de souplesse pour travailler dans les systèmes cellulaires différentes. Cette méthode n’est pas destinée à étudier des sites de liaison connue des facteurs de transcription, une tâche mieux adaptée à l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et les méthodes de type puce. La force de HyCCAPP réside dans sa capacité à explorer des régions d’ADN pour lesquels il existe peu ou aucune connaissance sur les protéines lié à elle. Il peut également être une méthode pratique pour éviter les biais (présent dans la puce comme méthodes) introduits par un enrichissement de la chromatine à base de protéines en utilisant des anticorps. Potentiellement, l’HyCCAPP peut être un outil puissant pour découvrir véritablement nouvelles interactions ADN-protéines. A ce jour, la technologie a été principalement appliquée aux cellules de levure ou de séquences répétées de copie élevée dans les cellules de mammifères. Pour devenir un outil puissant que nous envisageons, HyCCAPP approches doivent être optimisées pour capturer efficacement les loci de l’exemplaire unique dans les cellules de mammifères. Ici, nous présentons notre adaptation de la levure initiale HyCCAPP protocole de lignées cellulaires humaines de capture et montrent que les régions de chromatine exemplaire unique peuvent être efficacement isolées avec ce protocole modifié.

Introduction

Au cours de la dernière décennie, il a vu une amélioration spectaculaire des technologies de séquençage, ce qui permet l’étude d’un large éventail des génomes dans un grand nombre d’échantillons et avec une résolution étonnante. Le Consortium de l’Encyclopédie des éléments de l’ADN (Encoder), un effort de plusieurs établissement à grande échelle mené par le National Human Genome Research Institute de la National Institutes of Health, a permis de mieux comprendre comment les facteurs de transcription et autres protéines régulatrices lient à et d’interagissent avec le génome. L’effort initial caractérise les interactions ADN-protéines spécifiques, tels qu’évalués par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour plus de 100 connus de protéines de liaison à l’ADN1. Les méthodes alternatives comme la DNase empreinte2 et formaldéhyde assistée isolement des éléments régulateurs (FAIRE)3 ont également été utilisés pour localiser les régions spécifiques du génome en interaction avec les protéines, mais avec la restriction évidente qui ces approches expérimentales n’identifient pas les protéines qui interagissent. Malgré les efforts considérables au cours des dernières années, aucune technologie n’est apparu qu’efficace permet la caractérisation complète des interactions protéine-ADN en chromatine et l’identification et la quantification des protéines associées à la chromatine.

Pour répondre à ce besoin, nous avons développé une approche originale qui nous qualifiées de protéines de Hybridization Capture of Chromatin-Associated pour la protéomique (HyCCAPP). Initialement développée en levure4,5,6, l’approche isole des régions de chromatine réticulée d’intérêt (avec des protéines de liés) à l’aide de capture de séquences spécifiques hybridation. Après l’isolement des complexes protéine-ADN, approches telles que la spectrométrie de masse peuvent être utilisés pour caractériser l’ensemble des protéines liées à la séquence d’intérêt. Ainsi, la HyCCAPP peut être considéré comme une approche impartiale pour découvrir de nouvelles interactions ADN-protéine, en ce sens qu’il ne s’appuie pas sur les anticorps et il est complètement agnostique sur les protéines qui se trouvent. Il existe d’autres approches capables de découvrir roman interaction ADN protéines7, mais s’appuient plus sur puce comme méthodes8,9,10, plasmide insertions11,12, 13,14, ou régions à haute copie numéros15. En revanche, HyCCAPP peut être appliqué aux régions de multi - et unique-copy, et il ne nécessite aucune information préalable sur les protéines dans la région. En outre, bien que certaines des méthodes mentionnées ci-dessus ont des caractéristiques précieuses, notamment en évitant la nécessité pour des réactions de réticulation ADN-protéine, la caractéristique unique de HyCCAPP est qu’il peut être appliqué aux régions de la simple copie de non modifié cellules et sans aucune connaissances préalables sur les protéines de liaison putatif ou anticorps disponibles.

À ce stade, HyCCAPP a surtout été appliquée à l’analyse des différentes régions génomiques de levure4,5,6et a récemment été utilisée pour analyser les interactions protéine-ADN dans l’ADN de l’alpha-satellite, une région de répétition dans le génome humain16. Dans le cadre de nos travaux en cours, nous avons adapté la méthode de capture hybridation initialement développée pour la chromatine de levure être applicable à l’analyse des cellules humaines et vous présente ici un protocole modifié qui permet la capture sélective de la simple copie cible régions du génome humain avec des rendements similaires à nos premières études chez les levures. Ce nouveau protocole optimisé permet maintenant l’adaptation et l’utilisation de la technologie pour interroger des interactions protéine-ADN dans le génome humain, à l’aide de la spectrométrie de masse ou d’autres approches analytiques.

Il est important de souligner que la méthode HyCCAPP est destinée à l’analyse des régions cibles spécifiques et n’est pas encore adaptée aux analyses du génome. La technologie est particulièrement utile lorsqu’il s’agit avec les régions pour lesquelles il y a des informations limitées sur les protéines qui interagissent, ou lorsque vous souhaitez une analyse plus détaillée et approfondie des protéines qui interagissent dans un locus de génome spécifique. HyCCAPP est destiné à découvrir les protéines de liaison à l’ADN, mais pas caractériser avec précision les sites de fixation de protéines spécifiques dans l’ADN génomique. Dans son implémentation actuelle, la méthode ne fournit pas d’informations sur les séquences d’ADN ou des motifs pour protéines individuelles. Donc, il bien complète des technologies existantes telles que FAIRE et peut permettre l’identification des protéines liant le roman en régions génomiques identifiés par une analyse initiale de la FAIRE.

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Protocol

1. capturer oligonucléotide Design

  1. Concevoir un panneau d’oligonucléotides à utiliser lors de la prise de l’hybridation de la région cible/s.
    1. Visent à concevoir des oligonucléotides de 4 à 8 par région cible, mais au moins, au moins un oligonucléotide ciblant chaque extrémité de la région cible de conception.
    2. Si la séquence cible est longue (> 500 paires de bases), concevoir les oligonucléotides comme étalé que possible pour assurer l’enrichissement efficace de la chromatine dans toute la région de l’ensemble de la cible.
      NOTE : Nous avons observé une capture optimale avec des oligonucléotides de 4 – 8. Même si ce processus peut bien fonctionner avec plus d’oligonucléotides, il n’est pas rare d’observer une diminution des rendements d’enrichissement lorsque trop d’oligonucléotides sont utilisés.
  2. Concevoir des oligonucléotides avec des températures de fusion semblables et assurez-vous qu’ils ne pas former des épingles à cheveux forts ni ont des interactions fortes (tenant compte du fait que les hybridations seront effectuera à 42 ᵒC).
    Remarque : Si une élution de pied est choisie (4.12.3), une séquence de base 8 externe additionnelle doit être ajoutée à l’oligonucléotide et exigera des oligonucléotides complémentaires « release » lors de l' élution17. Plusieurs outils de logiciels commerciaux permet de sélectionner et analyser les oligonucléotides. 25 mers ont donné de bons résultats, mais selon la taille du génome et de la séquence, les oligonucléotides de capture peuvent contenir quelque part entre 20 et 80 bases. En général, capture oligonucléotides ont une température de fusion à proximité de 62 ᵒC, mais qui peuvent changer en fonction de leur longueur. Les températures de fusion compatibles et/ou longueur oligonucléotide tout au long de la combinaison de la capture peut aider à éviter des distorsions indésirables dans l’enrichissement.
  3. Concevoir les oligonucléotides de capture avec une portion de la biotine (préférence séparée par une cale d’espacement de la séquence de capture) sur l’extrémité 3'.

2. Culture cellulaire

  1. Croissance des cellules lymphoblastoïdes humaines (par exemple GM12878 ci-contre) ou autres lignées cellulaires en milieu RPMI 1640 additionné de 1 % la pénicilline-streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 5 % sérum fœtal (SVF), 37 ᵒC et 5 % de CO2.
    1. Semences initiales congelés aliquotes (2 – 5 x 105 cellules) dans une fiole de T-25 avec 6 mL de médias RPMI 1640, préparé en 2.1.
    2. Surveiller la densité cellulaire et la viabilité.
      1. Prenez un représentant aliquote de cellules et colorer avec un colorant approprié tels que trypan bleu.
      2. Mesurer la densité des cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisées.
    3. Avant que la cellule atteint la densité de 1 x 106 cellules/mL, tourner les cellules vers le bas à 100 x g pendant 5 min et transférer les cellules dans une fiole de T-75 avec 25 mL de médias RPMI 1640, préparé en 2.1. Cultiver les cellules jusqu'à ce que la densité des cellules s’approche 1 x 106 cellules/mL.
    4. Transférer les cellules dans une fiole de T-150 en 38 mL du milieu RPMI 1640 médias (2.1) et pousser les cellules pour une période supplémentaire de deux jours.
      Remarque : Les cellules lymphoblastoïdes poussent en suspension. Lignes directrices générales pour la culture de cellules lymphoblastoïdes recommandent la densité des cellules à maintenir entre 0,2 – 1 x 106 cellules/mL. En raison de la grande quantité de matériel nécessaire à cette technologie, le présent protocole est délibérément écrit à cultiver des cellules à une densité cellulaire au-delà de ce qui est couramment utilisé. Protocoles de croissance cellulaire peuvent être révisés et adaptés par le lecteur selon les types de cellules à utiliser.
    5. Filer les cellules vers le bas à 100 x g pendant 5 min, remettre en suspension les cellules dans 10 mL de milieu RPMI 1640 médias (2.1) et versez la suspension dans un flacon de rouleau de2 850 cm contenant 500 mL de médias. Incuber les cellules dans les mêmes conditions comme avant, mais à ce stade, commencer à l’aide de rotation constante (~0.5 tr/min).
    6. Surveiller la croissance des cellules et modifier les médias si nécessaire (généralement tous les 3 à 4 jours). Laisser les cellules poussent à une densité aussi près que possible de 2 x 106 cellules/mL (de 1 x 109 cellules au total).
    7. Une fois que le nombre de cellule désiré est atteint, récolter les cellules en faisant tourner les cellules vers le bas à 100 x g pendant 5 min et remettre en suspension les cellules de 36 mL du milieu RPMI 1640 médias (2.1). Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 mL. Prenez de petites parties aliquotes pour cellule de comptage et d’extraction de l’ADN.
  2. Crosslink en ajoutant 1 mL de formaldéhyde de 37 % pour atteindre une concentration finale de 1 %.
    ATTENTION : Le formaldéhyde est cancérigène et doit être manipulé sous une hotte.
    1. Incuber les cellules avec rotation (~ 30 à 60 tr/min) pendant 10 min à température ambiante (RT).
    2. Étancher la réaction crosslink en ajoutant 2 mL d’une solution de glycine de 2,5 M, pour une concentration finale de 125 mM.
    3. Incuber les cellules avec rotation (~ 30 à 60 tr/min) pendant 5 min à température ambiante.-Pellet les cellules par centrifugation à 100 x g pendant 5 min et laver les cellules deux fois avec du PBS 1 x contre le rhume de glace.
  3. Continuez à l’étape suivante ou Resuspendre le culot dans 5 mL de tampon de lyse cellulaire (5 mM Hepes, 85 mM KCl, 0,5 % Igepal, inhibiteurs de protéase (IP)) et clin d’oeil-gel la suspension goutte à goutte dans l’azote liquide. Stocker les échantillons à-80 ᵒC.
    Remarque : Se préparer > 25 mL de tampon de lyse cellulaire sans Igepal et PI et ajouter les réactifs frais lorsque vous êtes prêt à utiliser. Éviter le stockage à long terme de tampon de lyse cellulaire une fois Igepal et PI ont été ajoutés. Conserver le tampon de lyse cellulaire à ᵒC 4 jusqu'à 3 mois. Igepal est un détergent non ionique, non dénaturants. NP-40 est potentiellement utilisable comme une alternative à Igepal, mais nous le n'avons pas utilisée dans ce contexte que NP-40 n’est pas recommandé lorsque les échantillons sont analysés par la suite par spectrométrie de masse pour caractériser les protéines de liaison de l’ADN.

3. lyse et cisaillement

  1. Se préparer > 15 mL de tampon de lyse des noyaux (10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8,0, 1 % SDS, PI).
    NOTE : Ajouter PI frais, juste pour les quantités à utiliser. Éviter le stockage à long terme de tampon de lyse des noyaux une fois PI a été ajouté. Tampon de lyse des noyaux peut être stocké à ta jusqu'à 1 mois.
  2. Resuspendre le culot dans 20 mL de tampon de lyse cellulaire (contenant Igepal et PI). Laissez les pellets décongeler sur glace et mélangez bien après décongélation. Laisser des échantillons pendant un 10 min supplémentaire sur la glace. Centrifuger les cellules à 400 x g à 4 ᵒC pendant 5 min.
  3. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 6 mL de tampon de lyse des noyaux avec PI (volume peut être augmenté si les cellules ne forment pas une suspension).
  4. En prévision de la sonication, diviser l’échantillon uniformément dans ~ 6 – 8 microtubes (µL de 600 à 1 000 pour chaque tube).
    1. Placer les échantillons sur glace ou une grille froide et laisser agir l’échantillon en utilisant un sonicateur avec un microtip. Utiliser l’amplitude 65 % avec rafales de la constante de s 5 x 20, permettant la suspension se refroidir pendant au moins 40 s entre les impulsions.
      Remarque : Si les volumes augmentent > 10 mL par exemple, un verre, cellule de refroidissement peut être utilisé à la place. Rafales de plus et plus longtemps il faudrait ensuite. Sonicateurs diffèrent grandement. Conditions pourraient avoir à être optimisé par le lecteur. Autres solutions de rechange sonication peuvent être utilisées aussi bien.
  5. Centrifuger les cellules à 12 000 x g pendant 10 min à 4 ᵒC, transférer le surnageant dans un nouveau tube et éliminer les pellets.
  6. Estimation totale récupération à l’aide de la méthode fluorimétrique.
  7. Continuer à l’étape suivante ou snap-gel et conserver l’échantillon à ᵒC-80.
  8. En option : Prendre un crosslinks aliquote, retour en incubant du jour au lendemain il à ᵒC 67 à 0,3 M de NaCl. Nettoyer les ADN et exécutez-le dans Bioanalyzer pour déterminer la longueur de fragment. La majeure partie des fragments doit être entre 500 et 1 000 bp.
    Remarque : Il est OK pour arrêter à ce stade et stocker les échantillons à-80 ᵒC.

4. hybridation Capture

  1. Préparer 500 mL de 2 x tampon d’hybridation (Hyb) (200 mM MES, 2 M NaCl, 40 mM EDTA, 0,02 % Tween-20) et 500 mL de tampon de lavage (200 mM NaCl, 0,2 % SDS, 50 mM Tris pH 8). Conserver les Hyb et tampons de lavage à 4 ᵒC à température ambiante, respectivement, jusqu'à 3 mois. La moitié de la mémoire tampon de x Hyb 2 permet de préparer un 1 x tampon d’hybridation. Également le stocker à 4 ᵒC jusqu'à 3 mois.
    Remarque : Le volume total de la capture de l’hybridation sera deux fois le volume de l’échantillon obtenu à l’étape précédente (comme décrit jusqu’ici, le volume de l’échantillon serait environ 6 mL et le volume total de l’hybridation serait donc 12 mL).
  2. Mettre de côté perles égal à 5 % du volume total d’hybridation capture (600 µL dans ce cas). Un aimant approprié et adapté est nécessaire pour travailler avec les perles dans les étapes suivantes.
  3. Laver les perles trois fois avec 1 x Hyb tampon à l’aide de deux fois le volume de billes (1200 µL). Remettre en suspension les perles dans 1 200 µL de 2 x Hyb Buffer. Placer les tubes sur l’aimant jusqu'à ce que la solution efface et enlever le tampon.
  4. Effectuer des réactions de compensation avant dans des microtubes de 1,5 mL avec un maximum de 700 µL de l’échantillon par tube. Ajouter suffisamment perles (5 %) et 2 x Hyb tampon pour diluer le tampon Hyb 1 x (10 tubes avec 600 µL de l’échantillon, 120 µL de perles lavés resuspendues dans 2 x Hyb tampon et 480 µL de 2 x Hyb Buffer). Les incuber pendant 10 min à 31 ᵒC avec fin sur la rotation de fin (~ 30 à 60 tr/min).
  5. Placer les tubes sur un aimant jusqu'à ce que les perles sont immobilisés et transférer les échantillons dans de nouveaux tubes. Jeter les perles.
    Remarque : À ce stade, les tubes de liaison faible sont recommandés.
  6. Remettre en suspension les oligonucléotides de capture à une solution de 10 pmol/µL et ajouter 4 µL de cette solution dans chaque tube.
    NOTE : Différentes régions peuvent agir en tant que contrôle les uns des autres, mais il est recommandé d’inclure un oligonucléotide de capture avec sa séquence brouillé pour servir un vrai témoin négatif.
  7. Incuber les tubes pendant 40 min à 42 ᵒC avec fin sur la rotation de fin (~ 30 à 60 tr/min).
  8. Pendant l’incubation, mettre de côté les perles nécessaires (0,3 µL/pmol d’oligonucléotide de capture). Se laver trois fois les perles comme indiqué au point 4.3, mais remettre en suspension les cellules 1 x tampon de Hyb.
  9. Ajouter les perles lavés à l’échantillon et incuber les échantillons pendant 30 min à RT avec fin sur la rotation de fin (~ 30 à 60 tr/min). Placer les tubes sur l’aimant et retirer le surnageant après que les perles ont été immobilisés.
  10. Les perles de lavage
    1. Ajouter 1,2 mL de tampon de lavage et incuber l’échantillon pendant 5 min avec fin sur la rotation de fin (~ 30 à 60 tr/min) à tubes RT. Place l’aimant et attendez quelques min jusqu'à solution efface. Retirez le tampon et répétez cette étape.
    2. Ajouter 1,2 mL de tampon de lavage et il incuber pendant 1 h avec fin sur la rotation de fin (~ 30 à 60 tr/min) à température ambiante. Placer les tubes sur l’aimant et attendre quelques min solution efface. Retirez le tampon et répétez cette étape, réduisant le temps d’incubation à 30 min, la deuxième fois.
    3. Ajouter 200 µL de tampon de lavage et il incuber pendant 15 min avec fin sur la rotation de fin (~ 30 à 60 tr/min) à 31 ᵒC. Placer les tubes sur l’aimant et attendre quelques min solution efface. Retirer le tampon.
    4. Ajouter 200 µL de PBS et il incuber pendant 5 min avec fin sur rotation de fin (~ 30 à 60 tr/min) à température ambiante. Placer les tubes sur l’aimant et attendre quelques min solution efface. Retirez le tampon et répétez cette étape.
  11. Élution simple
    1. Ajouter 40 µL d’eau moléculaire de catégorie aux talons et il incuber à 94 ᵒC pendant 5 min.
    2. Placer les tubes sur l’aimant et attendre quelques minutes jusqu'à ce que la solution efface.
    3. Transvaser le surnageant dans un nouveau tube. Jeter les perles.
    4. Procéder à l’analyse protéomique ou stocker l’échantillon à ᵒC-80.
      Remarque : Ce type d’élution fonctionne bien pour l’analyse ultérieure de qPCR et certaines mesures de protéomique, mais dans d’autres cas deux autres approches décrites ci-dessous éluats de rendement « nettoyeur ».
  12. Élution de DNase.
    1. Ajouter 40 µL de 1 x tampon de DNase et 2 U de DNase dans chaque tube.
    2. Incuber les tubes à 37 ᵒC pendant 15 minutes.
    3. Placer les tubes sur un aimant et attendre quelques min, jusqu'à ce que la solution efface.
    4. Retirer les échantillons éluées les perles et placer les échantillons dans un nouveau tube de liaison faible.
    5. Incuber le tube à 94 ᵒC pendant 7 minutes inactiver les enzymes et procéder aux analyses protéomiques.
      Remarque : Des concentrations plus faibles de DNase peuvent être utilisées si des interférences avec les analyses protéomiques sont observée. Il ne sera pas possible de calculer les enrichissements de la capture de qPCR si cette méthode d’élution est utilisée car le traitement de la DNase détruit complètement la matière de l’ADN dans l’échantillon.
    6. Procéder à l’analyse protéomique ou stocker l’échantillon à ᵒC-80.
  13. Pied d’élution17.
    Remarque : Cette méthode n’est pas recommandée pour des oligonucléotides plus longues (> 40 bases). Cette méthode nécessite pour les capture des oligonucléotides contenir une bases 8 supplémentaires qui ne se chevauchent pas avec la séquence génomique et oligonucléotides complémentaires libération afin de déplacer la cible des capture des oligonucléotides.
    1. Diluer 2 nanomoles de libération oligonucléotides dans 40 µL de tampon de la SSC.
    2. Il incuber pendant 20 min à température ambiante.
    3. Placer les tubes sur un aimant et attendre quelques minutes jusqu'à ce que la solution efface.
    4. Retirez les perles de la solution.
    5. Procéder à l’analyse protéomique ou stocker l’échantillon à ᵒC-80.

5. evaluation des Capture d’obtenir par qPCR avec des amorces pour la région de Capture cible d’intérêt

  1. Utiliser un logiciel approprié ou un outil en ligne pour concevoir des amorces et des sondes pour la région cible.
    Remarque : Dans cette expérience, la région promotrice de le DUSP3 et DUSP5 ont été ciblés. Les amorces et les sondes utilisées sont les suivantes : DUSP3: apprêt 1 - GTG TTT AGG TTC TDC GAT CC, apprêt 2 - CGG AAT GTC TGC CTT CG, sonde marquée par FAM - TCC ATG CCC GAA TTG TGA CGG CGT ; DUSP5: apprêt 1 - TGA GAA AGC TDC GAT GTG TC, apprêt 2 - GCC TTC AGA AAC CCC AAA AG, sonde marquée par FAM TGC ATT TAG AGC AGC CAG ATG AGG TT.
  2. Prélever une partie aliquote de l’éluat (pas plus de 10 µL) et diluer à 01:10 avec grade moléculaire H2O.
  3. Extraire l’ADN de l’un des prélèvements à l’étape 2.1.7 et utiliser cet échantillon d’ADN pour faire une courbe d’étalonnage en faisant cinq série 01:10 dilutions dans moléculaire classe H2O.
  4. Préparer un mélange maître qPCR (grande variété de solutions de rechange commerciales), ajouter des amorces et des sondes et répartir la quantité appropriée (15 µL si exécute une réaction de 20 µL) dans chaque puits.
  5. Ajouter 5 µL de soit : a) dilué échantillon, b) la courbe d’étalonnage ou des grade c) moléculaire H2O (pour servir d’aucun contrôle de modèle) dans chaque puits.
  6. Sceller la plaque et il centrifuger à 100 x g pendant 1 min.
  7. Sous un système de qPCR avec les paramètres suivants : 5 min à 95 ᵒC suivie de 40 cycles de ᵒC 95 pendant 20 s, 59 ᵒC pour 20 s et 72 ᵒC pour 25 s.
  8. La courbe d’étalonnage à rendements d’ânes et brouillé capture permet d’évaluer la spécificité de la capture.

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Representative Results

En raison de la nécessité pour les grandes quantités d’entrée de la chromatine de HyCCAPP réussir, les cellules sont cultivées à des niveaux relativement élevés de confluence. Trypan coloration bleu est utilisée pour confirmer que le taux de mort cellulaire sont modérés (< 10 %). Dans les expériences de l’exemplaire unique, contenu de chromatine avant l’hybridation capture doit être dans la plage de femtomolar, qui exige habituellement au moins 109 cellules comme matériau de départ. Avant les expériences de la pleine échelle, il est recommandé de tester les performances d’oligonucléotide de capture dans des lots plus petits. Captures d’hybridation à l’aide d’un titrage d’oligonucléotides sont indiquées à la Figure 1. Le nombre de capture oligonucléotides augmente progressivement tandis que la concentration totale reste constante. Cette expérience montre clairement les trois aspects clés. Tout d’abord, il permet de déterminer, pour cette région particulière, oligonucléotides combien sont nécessaires pour atteindre l’efficacité hybridation optimale (et maximale). Deuxièmement, il révèle s’il y a des interactions néfastes évidentes entre un ensemble particulier d’oligonucléotides. Enfin, il indique s’il y a des oligonucléotides avec spécificité médiocre qui transportent des quantités importantes de fond (dans ce cas mesurée par analyse de qPCR avec amorces ciblant d’autres régions dans le génome).

Les rendements de l’hybridation de capture apparaissent modestes en raison de la nature réticulée de l’échantillon de la chromatine. Une grande proportion de fragments dans la chromatine réticulée ne sera pas prête pour la capture de l’hybridation. Des expériences d’hybridation série démontrent cette (Figure 2). Si la capture de l’hybridation est exécutée avec succès, une expérience de capture ultérieure de la même matière de chromatine en utilisant un ensemble différent d’oligonucléotides de capture se traduira par des rendements comparables (légèrement plus faible) que lorsque vous utilisez la chromatine fraîche (environ 11 % de moins sur en moyenne). Mais si la même région s’adresse encore une fois avec le même ensemble d’oligonucléotides dans une seconde expérience de capture à l’aide de l’échantillon de chromatine restant après la capture de première expérience, le rendement diminue environ 90 %, confirmant que la majeure partie de la hybridation-prêtent matériel a été capturé. Si une telle diminution dans la capture n’est pas observée après les captures suivantes avec le même ensemble d’oligonucléotides, cela indique un problème technique lors de l’étape de capture de l’hybridation.

Dans les systèmes simples comme la levure, nous avons observé capture efficacités approchant 4 %5, qui a conduit à l’identification de 9 protéines différentiellement enrichi dans 2 régions lorsque la levure est cultivée dans des conditions différentes. Dans les cellules humaines Toutefois, ayant un génome ~ 250 fois plus grand que la levure, les rendements de l’hybridation sont généralement inférieurs à 1 % (Figure 3). Comme le montre la Figure 3 , une seule expérience peut générer des quantités insuffisantes pour l’analyse protéomique. Dans ce cas, plusieurs échantillons capturés devront être mises en commun afin d’effectuer une analyse de spectrométrie de masse ultérieures. Alternativement, des concentrations plus faibles de la chromatine région cible capturé peuvent être utilisées pour l’analyse ciblée des approches telles que western blot et basé sur la spectrométrie de masse de réaction sélectionnée suivi des essais.

Figure 1
Figure 1 : représentation intrigue boîte de titration oligonucléotide capture. Augmenter le nombre de capture oligonucléotides ont été testés et analysés par qPCR. Fond fait référence aux déterminations de qPCR ciblant d’autres régions dans le génome. Changement de pli de la capture de l’hybridation à l’aide d’un oligonucléotide unique sont indiqués. Moustaches représentent les valeurs minimales et maximales. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : représentation graphique boîte de captures serial. Captures d’hybridation séquentiel avec le même ensemble d’oligonucléotides (salima) montrent une forte baisse d’enrichissement par rapport à l’hybridation séquentielle capture en utilisant un jeu différent d’oligonucléotides (A_B) (p = 3,88 e-5). L’enrichissement est mesuré par qPCR et valeurs sont indiquées par rapport aux captures à l’aide de chromatine fraîche. Moustaches représentent les valeurs minimales et maximales. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : capture de l’hybridation à l’aide de cellules humaines. Hybridation capturer des régions situées dans différents chromosomes. Chaque région sert comme témoin négatif pour l’autre. En outre, une capture de l’hybridation est effectuée avec la séquence (Scr) brouillée comme un vrai contrôle négatif. Barres d’erreur représentent déviation standard. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

La méthode HyCCAPP décrite ici a plusieurs caractéristiques uniques qui en font une approche puissante pour découvrir les interactions ADN-qui resteraient autrement insaisissables. La nature du processus donne HyCCAPP la possibilité de travailler dans divers organismes et régions du génome. Il s’agit d’une méthode, mais qui a plusieurs limites à prendre en considération.

HyCCAPP est une méthode qui évite toute modification de la cellule afin qu’il peut potentiellement être appliqué dans les cellules primaires, systèmes de cultures cellulaires ou des échantillons de tissus de même. À cause de cela, cependant, elle nécessite des échantillons pour être réticulé, qui réduit la sensibilité de l’analyse protéomique et donc exige de grandes quantités d’entrée. Il sont de nouvelles approches qui s’appuient sur CRISPR et biotinylation des protéines qui peuvent fonctionner sans réactions de réticulation12,13,14,18. Ces approches peuvent être très puissants si les insertions de plasmide ne représentent pas une contrainte, mais ne peuvent être utilisées dans les systèmes de cultures cellulaires. Autres approches conviennent très bien à identifier les protéines générales associations basées sur un état de la chromatine ou sur la présence de des facteurs de transcription particulière, mais ne sont pas destinées à étudier chaque locus9,10,19 .

L’approche de HyCCAPP présente une approche alternative dont l’applicabilité est large, mais il est probable que les applications dans les systèmes cellulaires ou organismes exigera optimisation. L’étape d’optimisation plus critique de l’approche comprend la conception et la sélection des oligonucléotides de capture. Une série d’essais à petite échelle devrait indiquer si les oligonucléotides conçues sont appropriées et si la séquence de la région est effectivement capturée. Il y a plusieurs facteurs qui devraient être considérés dans l’élaboration et l’essai des oligonucléotides de capture, comme la longueur de l’oligonucléotide, degré de spécificité de la région cible et les interactions parmi l’ensemble des oligonucléotides à utiliser. Toutes ces interactions peuvent être testées facilement à l’aide d’un dosage de qPCR spécifiques à la région cible. Si vous le souhaitez, un workflow de ChIP-Seq-like permet de séquencer les fragments d’ADN obtenus et s’assurer que la spécificité de l’enrichissement est satisfaisante dans l’ensemble du génome entier5.

Enfin, les conditions de réticulation sont aussi très importantes dans la procédure HyCCAPP, et nous avons observé des différences notables entre les différents systèmes, obtenir les meilleurs résultats dans les cellules humaines par réticulation avec 1 % de formaldéhyde, tandis que chez les levures, réticulation avec 3 % de formaldéhyde ont donné des résultats plus reproductibles. Il est possible que la réticulation plus intense avec 3 % de formaldéhyde dans les cellules humaines avec une structure plus complexe de la chromatine n’offre pas une accessibilité suffisante pour hybridation capture oligonucléotides. Il est également concevable que la présence d’une paroi cellulaire chez la levure entrave l’accès du formaldéhyde dans les cellules, augmentant la quantité de formaldéhyde nécessaire à des niveaux de réticulation réussie dans la chromatine.

Exécution de puce et autres approches de capture ciblant les humains chromatine réticulée, nous avons observé que seulement environ 1 % de l’ADN cible peut effectivement être capturé. Pour la plupart des approches basées sur l’ADN et des analyses, ce n’est pas un facteur limitant. Cependant, contrairement à la puce, où l’affichage final est basé sur l’ADN amplifiable, HyCCAPP s’appuie sur la teneur en protéines pour la lecture finale. En raison de cette limitation intrinsèque, de grandes quantités de matières entrantes (cellules cultivées dans les expériences présentées ici) sont nécessaires : cette contrainte doit être examiné attentivement avant d’explorer cette méthodologie, en particulier lorsqu’il est appliqué aux régions de l’exemplaire unique. Pas tous les systèmes seront en mesure de produire le nombre de cellules nécessaires, ou le coût de plus en plus le nombre de cellules nécessaire peut être prohibitif. Les montants d’entrée que la HyCCAPP nécessite (~ 109 cellules) est comparable à d’autres méthodes qui s’appuient sur le matériau réticulé avec d’entrée variant entre 108 et 1011 cellules9,11,15. Des modifications futures de la technologie HyCCAPP explorera les approches visant à augmenter artificiellement le nombre de copies des régions ciblées, afin de rendre cette méthode plus largement applicables. Dans le même temps, nous travaillerons pour continuer à accroître l’efficacité globale du processus qui, avec les progrès continus en spectrométrie de masse, devrait réduire les quantités d’entrée nécessaire et rendre cette technologie réalisable dans plusieurs systèmes.

Approches biotinylation basée CRISPR, comme enCHiP18 et d’autres13,14, ont montré pour être très efficace en éliminant le besoin de matériel réticulé, accroître les rendements et réduire considérablement l’entrée exigences. Le traitement complexe de cellules dans ces méthodes ne permet cependant pas ces techniques à appliquer aux échantillons de tissus, une orientation que nous avons commencé à poursuivre avec HyCCAPP et qui donne des résultats prometteurs.

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Disclosures

Il n’y a aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les NIH subventions P50HG004952 et R01GM109099 à Mo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PrimerQuest tool IDT
OligoAnalyzer 3.1 IDT Analyze capture oligonucleotids
PairFold UBC Analyze interactions
RPMI 1640 media Thermo Fisher 11875093
Penicillin-streptomycin Thermo Fisher 15140122
L-Glutamine  Thermo Fisher 25030081
Fetal bovine serum Thermo Fisher 26140079
Countess automated cell counter Thermo Fisher
850 cm2 roller bottle  Greiner Bio-one 680058
Roller system Wheaton 22-288-525
37 % formaldehyde  Sigma-Aldrich F8775
Glycine Sigma-Aldrich
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I3021
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P4380
HEPES Thermo Fisher 15630080
Branson digital sonifier SFX 150 Emerson
Qubit 3.0 fluorometer Thermo Fisher
Qubit dsDNA BR assay kit Thermo Fisher Q32850
Bioanalyzer 2100 Agilent
Agilent DNA 1000 kit Agilent 5067-1504
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
NaCl 5M Thermo Fisher AM9760G
EDTA Sigma-Aldrich
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher 12321D
DynaMag-15 magnet Thermo Fisher 12301D
Dynabeads M-280 atreptavidin Thermo Fisher 60210
Low binding tubes Eppendorf 22431081
Hybridization oven SciGene
Tube shaker and rotator Thermo Fisher 415110Q
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303
SSC buffer 20× concentrate Sigma-Aldrich S6639

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References

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Génétique numéro 136 HyCCAPP protéomique interactions protéine-ADN la chromatine spectrométrie de masse NFκB DUSP3 DUSP5
Adaptation de l’hybridation prise de protéines associées à la chromatine pour la protéomique pour les cellules de mammifères
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Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K.,… More

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K., Perumalla, D. S., Montoya, M. J., Jadhav, A. Y. L., Shortreed, M. R., Smith, L. M., Olivier, M. Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57140, doi:10.3791/57140 (2018).

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