Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Tilpasning af hybridisering fange af kromatin-associerede proteiner for Proteomics til pattedyrceller

doi: 10.3791/57140 Published: June 1, 2018

Summary

Dette er en metode til at identificere nye DNA-interagere proteiner på specifikke mål loci, afhængige af sekvens-specifikke erobringen af crosslinked kromatin for efterfølgende proteom analyser. Ingen forudgående viden om potentielle-bindende proteiner, og heller ikke celle ændringer er nødvendige. Oprindeligt udviklet til gær, er teknologien nu blevet tilpasset for pattedyrsceller.

Abstract

Hybridisering erobringen af kromatin-associerede proteiner for proteomics (HyCCAPP) teknologi blev oprindeligt udviklet for at afdække nye DNA-protein interaktioner i gær. Det giver mulighed for analyse af et målområde af interesse uden behov for forudgående viden om sandsynlige proteiner bundet til regionen mål. Dette, i teorien, mulighed for HyCCAPP skal bruges til at analysere nogen genomisk region af interesse, og det giver tilstrækkelig fleksibilitet til at arbejde i forskellige celle systemer. Denne metode er ikke beregnet til at studere bindingssteder af kendte transkriptionsfaktorer, en opgave, der er bedre egnet til kromatin Immunoprecipitation (ChIP) og ChIP-lignende metoder. HyCCAPP styrke ligger i dens evne til at udforske DNA regioner hvor der er begrænset eller ingen viden om de proteiner, der er bundet til det. Det kan også være en praktisk metode til at undgå bias (til stede i ChIP-lignende metoder) indført af protein-baserede kromatin berigelse ved hjælp af antistoffer. Potentielt, kan HyCCAPP være et effektivt redskab til at afdække virkelig roman DNA-protein interaktioner. Til dato, har teknologien blevet overvejende anvendes til gærceller eller høj kopi gentagne sekvenser i pattedyrsceller. For at blive den kraftfulde værktøj vi forestiller, skal HyCCAPP tilgange være optimeret til effektivt fange enkelt-kopi loci i pattedyrsceller. Her præsenterer vi vores tilpasning af den oprindelige gær HyCCAPP capture protokol til menneskelige cellelinjer, og vise at enkelt-kopi kromatin regioner kan isoleres effektivt med denne ændrede protokol.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I det sidste tiår, har set en dramatisk forbedring i sekventering teknologier, giver mulighed for undersøgelse af en bred vifte af genomer i stort tal af prøver og med forbløffende opløsning. Encyklopædi af DNA elementer (INDKODE) konsortium, en omfattende multi institutionelle indsats med National Human Genome Research Institute af National Institutes of Health, i spidsen har givet indsigt i hvordan de enkelte transkriptionsfaktorer og andre regulerende proteiner binder til og interagere med genomet. Den indledende indsats karakteriseret specifikke DNA-protein interaktioner, som vurderet af kromatin immunoprecipitation (ChIP) for mere end 100 kendte DNA-bindende proteiner1. Alternative metoder såsom DNase footprinting2 og formaldehyd assisteret isolation af regulerende elementer (FAIRE)3 er også blevet brugt til at finde specifikke regioner i genomet interagere med proteiner, men med den indlysende begrænsning, disse eksperimentelle metoder kan ikke identificere de interagerende proteiner. Trods de omfattende bestræbelser i de seneste år, er der opstået ingen teknologi, der effektivt giver mulighed for omfattende karakterisering af protein-DNA interaktioner i kromatin, og identifikation og kvantificering af kromatin-associerede proteiner.

For at imødegå dette behov, udviklet vi en ny metode, som vi betegnes som Hybridization Capture of Chromatin-Associated proteiner for Proteomics (HyCCAPP). I første omgang udviklet i gær4,isolerer5,6, fremgangsmåde crosslinked kromatin regioner af interesse (med bundne proteiner) ved hjælp af sekvens-specifikke hybridisering capture. Efter isolering af protein-DNA komplekser, kan tilgange såsom massespektrometri bruges til at karakterisere sæt af proteiner er bundet til sekvensen af interesse. HyCCAPP kan således betragtes som en ikke-partisk tilgang til at afdække nye DNA-protein interaktioner, i den forstand, at det ikke stole på antistoffer, og det er fuldstændig agnostisk om de proteiner, der kan findes. Der er andre tilgange i stand til at afdække roman DNA-interagere proteiner7, men mest afhængige af ChIP-lignende metoder8,9,10, plasmid indsætninger11,12, 13,14, eller områder med høj kopi numre15. Derimod HyCCAPP kan anvendes til multi - og single-kopi regioner, og det kræver ikke nogen forudgående oplysninger om proteiner i regionen. I tilføjelse, mens nogle af metoderne, der er nævnt ovenfor har værdifulde funktioner, især undgå behovet for DNA-protein crosslinking reaktioner, den enestående indslag i HyCCAPP er, at det kan anvendes til enkelt-kopi regioner i umodificerede celler og uden nogen forudgående viden om formodede bindende proteiner eller tilgængelige antistoffer.

På dette tidspunkt HyCCAPP er overvejende blevet anvendt til analysen af forskellige genomisk regioner i gær4,5,6, og for nylig blev brugt til at analysere protein-DNA interaktioner i alpha-satellit DNA, en Gentag region i det menneskelige genom16. Som en del af vores igangværende arbejde, har vi tilpasset hybridisering capture tilgang i første omgang udviklet til gær kromatin gælder for analysen af humane celler, og præsenterer her en modificeret protokol, der giver mulighed for selektiv fangst af enkelt-kopi mål regioner i det menneskelige genom med effektivitet svarer til vores indledende undersøgelser i gær. Denne nye optimeret protokol giver nu mulighed for tilpasning og udnyttelse af teknologi til at afhøre protein-DNA interaktioner på tværs af det menneskelige genom, ved hjælp af massespektrometri eller andre analytiske tilgange.

Det er vigtigt at understrege, at HyCCAPP metoden er beregnet til analyse af specifikke målområder og er endnu ikke egnet til genome-wide analyser. Teknologien er især nyttig, når der beskæftiger sig med områder, som der er sparsomme oplysninger om interagerende proteiner, eller når en mere omfattende dybdegående analyse af interagerende proteiner på en bestemt genom locus ønskes. HyCCAPP er beregnet til at afdække DNA-bindende proteiner men ikke karakterisere præcist bestemt protein bindingssteder i genomisk DNA. I sin nuværende gennemførelse indeholder metoden ikke oplysninger om DNA bindende sekvenser eller motiver for individuelle proteiner. Derfor, det pænt supplerer eksisterende teknologier såsom FAIRE, og kan give mulighed for identifikation af nye bindende proteiner i genomisk regioner identificeret ved første FAIRE analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. fange oligonukleotid Design

  1. Designe et panel af oligonukleotider skal anvendes ved hybridisering erobringen af target region/s.
    1. Formål at designe 4 – 8 oligonukleotider pr. målområde, men som minimum, design mindst én oligonukleotid målretning hver ende af regionen mål.
    2. Hvis målet sekvens er lang (> 500 basepar), design af oligonukleotider som spredt ud som muligt for at sikre effektiv berigelse af kromatin på tværs af regionen hele målet.
      Bemærk: Vi har observeret, optimal indfanger med 4-8 oligonukleotider. Selvom denne proces kan arbejde godt sammen med flere oligonukleotider, er det ikke ualmindeligt at observere et fald i berigelse udbytter, når alt for mange oligonukleotider bruges.
  2. Designe oligonukleotider med lignende smeltende temperaturer, og sørg for, at de ikke danne stærke Hårnåle eller har stærke interaktioner (under hensyntagen til at der gennemføres hybridizations på 42 ᵒC).
    Bemærk: Hvis en fodfæste eluering er valgt (4.12.3), en ekstra ekstern 8 base sekvens skal føjes til oligonukleotid og vil kræve supplerende 'release' oligonukleotider ved eluering17. Flere kommercielle software-værktøjer kan bruges til at vælge og analysere oligonukleotider. 25 mers har vist gode resultater, men afhængigt af genom størrelse og rækkefølge, fange oligonukleotider kan indeholde et sted mellem 20-80 baser. Typisk, fange oligonukleotider har et smeltepunkt temperatur tæt på 62 ᵒC, men det kan ændre sig afhængigt af deres længde. Konsekvent smeltende temperaturer og/eller oligonukleotid længde hele capture mix kan bidrage til at undgå uønskede afvigelser i berigelse.
  3. Design capture oligonukleotider med biotin gruppe (helst adskilt af en spacer fra capture sekvens) på 3'-enden.

2. celle kultur

  1. Vokse humane lymphoblastoid celler (såsom GM12878 vist her) eller andre cellelinjer i RPMI 1640 media suppleret med 1% penicillin-streptomycin, 2 mM L-glutamin og 5% føtal bovint serum (FBS), 37 ᵒC og 5% CO2.
    1. Frø første frosne delprøver (2-5 x 105 celler) i en T-25 kolbe med 6 mL af RPMI 1640 medier udarbejdet i 2.1.
    2. Overvåge celle tæthed og levedygtighed.
      1. Tage en repræsentant alikvot af celler og bejdse dem med en passende farvestof som trypan blå.
      2. Måle celle tætheden ved hjælp af en hemocytometer eller en automatiseret celle counter.
    3. Før cellen når tæthed af 1 x 106 celler/mL, spin cellerne ned ved 100 x g i 5 min og overføre cellerne til en T-75 kolbe med 25 mL af RPMI 1640 medier udarbejdet i 2.1. Vokse celler, indtil cellen tæthed nærmer sig 1 x 106 celler/mL.
    4. Overføre cellerne til en T-150 kolben i 38 mL RPMI 1640 medier (2.1) og vokse i cellerne for yderligere to dage.
      Bemærk: Lymphoblastoid celler vokse i suspension. Generelle retningslinjer for voksende lymphoblastoid celler anbefale celle tætheder skal holdes mellem 0,2 – 1 x 106 celler/mL. På grund af den store mængde af materiale, der kræves i denne teknologi, skrives denne protokol bevidst at dyrke celler til en celle massefylde ud over hvad er almindeligt anvendt. Celle vækst protokoller kan revideret og tilpasset af læseren afhængigt af celletyper skal anvendes.
    5. Spin cellerne ned ved 100 x g i 5 min, resuspend celler i 10 mL af RPMI 1640 medier (2.1) og hæld suspension i en 850 cm2 roller flaske med 500 mL af medier. Inkuber celler på samme vilkår som før, men på dette tidspunkt begynder at bruge konstant rotation (~0.5 rpm).
    6. Overvåge cellevækst og ændre medierne efter behov (typisk hver 3-4 dage). Lad celler vokse til en tæthed, så tæt som muligt på 2 x 106 celler/mL (1 x 109 celler i alt).
    7. Når den ønskede celletal er nået, høste cellerne ved at dreje cellerne ned på 100 x g i 5 min og resuspend celler i 36 mL af RPMI 1640 medier (2.1). Overføre cellesuspension til en 50 mL konisk slange. Tage små prøver til celle optælling og DNA-ekstraktion.
  2. Bitmapgenkendelse ved tilsætning af 1 mL af 37% formaldehyd til nå frem til en endelig koncentration på 1%.
    Forsigtig: Formaldehyd er kræftfremkaldende og bør håndteres i et stinkskab.
    1. Inkuber celler med rotation (~ 30-60 rpm) i 10 min. ved stuetemperatur (RT).
    2. Dæmpning bitmapgenkendelse reaktion ved tilsætning 2 mL af en 2,5 M Glycin løsning, til en slutkoncentration på 125 mM.
    3. Inkuber celler med rotation (~ 30-60 rpm) i 5 min på RT. sammenpresse cellerne ved centrifugering ved 100 x g i 5 min og cellerne vaskes to gange med is koldt 1 x PBS.
  3. Fortsætte til næste trin eller resuspenderes i 5 mL af celle lysisbuffer (5 mM Hepes, 85 mM KCl, 0,5% Igepal, proteasehæmmere (PI)) og snap-freeze suspension dråbevis i flydende kvælstof. Gemme prøver på-80 ᵒC.
    Bemærk: Forberede > 25 mL af celle lysisbuffer uden Igepal og PI og tilføje disse reagenser frisk når du er klar til brug. Undgå langtidsopbevaring af celle lysisbuffer, når Igepal og PI er blevet tilføjet. Butik celle lysisbuffer på 4 ᵒC i op til 3 måneder. Igepal er en nonionisk, ikke-denatureringen vaskemiddel. NP-40 potentielt kan bruges som et alternativ til Igepal, men vi har ikke brugt det i denne sammenhæng som NP-40 ikke anbefales, når prøver analyseres i sidste ende af massespektrometri til at karakterisere DNA-bindende proteiner.

3. lysis og klipning

  1. Forberede > 15 mL af kerner lysisbuffer (10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8,0, 1% SDS, PI).
    Bemærk: Tilføje PI frisk, lige til beløbene, der skal anvendes. Undgå langtidsopbevaring af kerner lysisbuffer, når PI er blevet tilføjet. Kerner lysisbuffer kan gemmes på RT for op til 1 måned.
  2. Resuspenderes i 20 mL af celle lysisbuffer (indeholdende Igepal og PI). Lad pellets tø på is og bland godt engang optøet. Lad prøver sidde i en yderligere 10 min. på køl. Der centrifugeres celler på 400 x g på 4 ᵒC i 5 min.
  3. Supernatanten og resuspend celler i 6 mL af kerner lysisbuffer med PI (volumen kan øges, hvis celler ikke udgør en suspension).
  4. Forberedelse til sonikering, opdele prøven jævnt i ~ 6-8 mikrofuge rør (600 til 1.000 µL for hver tube).
    1. Prøveemner på is eller en kold rack og sonikeres prøven ved hjælp af en sonikator med en microtip. Bruger 65% amplitude med 5 x 20 s konstant byger, tillade suspension til køle ned til mindst 40 s mellem pulser.
      Bemærk: Hvis diskenheder øge > 10 mL per prøve, et glas køling celle kan bruges i stedet. Vil være nødvendigt med flere og længere byger derefter. Sonicators er meget forskellige. Betingelser måske nødt til at være optimeret af læseren. Andre sonikering alternativer kan bruges som godt.
  5. Centrifugeres celler ved 12.000 x g i 10 min. ved 4 ᵒC, overføre supernatanten til en ny tube, og kassér pellets.
  6. Skøn total genopretning ved hjælp af en fluorometriske metode.
  7. Fortsætte til næste trin eller snap-freeze og gemme prøve på-80 ᵒC.
  8. Valgfrit: Tage en alikvot, reverse krydsbindinger ved at inkubere det natten over på 67 ᵒC i 0.3 M NaCl. Ren DNA og køre det i Bioanalyzer til at bestemme fragment længder. Hovedparten af fragmenterne bør være mellem 500 og 1000 bp.
    Bemærk: Det er OK at stoppe på dette tidspunkt og gemme prøver på-80 ᵒC.

4. hybridisering opsamling

  1. Forberede 500 mL af 2 x hybridisering (Hyb) Buffer (200 mM MES, 2 M NaCl, 40 mM EDTA, 0,02% Tween-20) og 500 mL af vaskebuffer (200 mM NaCl, 0,2% SDS, 50 mM Tris pH 8). Opbevar Hyb og vask buffere på 4 ᵒC og stuetemperatur, henholdsvis, for op til 3 måneder. Bruge halvdelen af de 2 x Hyb buffer til at forberede en 1 x hybridisering Buffer. Også gemme det på 4 ᵒC i op til 3 måneder.
    Bemærk: Det samlede volumen af hybridisering fange bliver to gange volumen i den resulterende prøve i det forrige trin (som beskrevet hidtil, sample volumen ville være omkring 6 mL og dermed de samlede hybridisering volumen ville være 12 mL).
  2. Der er afsat perler svarende til 5% af den samlede hybridisering capture (600 µL i dette tilfælde). En hensigtsmæssig og passende magnet er nødvendig for at arbejde med perler i de følgende trin.
  3. Vaske perlerne tre gange med 1 x Hyb Buffer med dobbelt perler volumen (1200 µL). Resuspend perlerne i 1.200 µL af 2 x Hyb Buffer. Sted rør på magneten, indtil løsningen rydder og fjerne bufferen.
  4. Udføre før clearing reaktioner i 1,5 mL mikrofuge rør med et maksimum på 700 µL af prøven pr tube. Tilføje nok perler (5%) og 2 x Hyb Buffer til at fortynde Hyb buffer 1 x (10 rør med 600 µL af prøven, 120 µL af vasket perler genopslemmes i 2 x Hyb Buffer og 480 µL af 2 x Hyb Buffer). Inkuber dem i 10 min på 31 ᵒC med ende over ende rotation (~ 30-60 rpm).
  5. Sted rør på en magnet, indtil perlerne er immobiliseret og overføre prøverne at nye rør. Kassér perlerne.
    Bemærk: Fra dette punkt fremad, lav-bindende rør er anbefalet.
  6. Resuspend capture oligonukleotider til en brugsopløsning af 10 pmol/µL og tilføje 4 µL af denne løsning til hvert rør.
    Bemærk: Forskellige regioner kan fungere som kontrol for hinanden, men det anbefales at medtage en fange oligonukleotid med dets sekvens scrambled at tjene som et sandt negativ kontrol.
  7. Inkuber rør til 40 min på 42 ᵒC med ende over ende rotation (~ 30-60 rpm).
  8. Under inkubation, der er afsat perlerne nødvendige (0,3 µL/pmol af capture oligonukleotid). Vaske perlerne tre gange som beskrevet i trin 4.3, men resuspend celler i 1 x Hyb Buffer.
  9. Tilføje vasket perlerne til prøven og der inkuberes prøver for 30 min på RT med ende over ende rotation (~ 30-60 rpm). Sted rør på magnet og Fjern supernatanten Når perlerne har været immobiliserede.
  10. Vaske perlerne
    1. Der tilsættes 1,2 mL Wash Buffer og inkuberes prøve for 5 min med ende over ende rotation (~ 30-60 rpm) på RT. sted rør på magnet, og vent et par min. indtil løsning rydder. Fjerne bufferen og Gentag dette trin.
    2. Der tilsættes 1,2 mL Wash Buffer og inkuberes i 1 h med ende over ende rotation (~ 30-60 rpm) på RT. placere rørene på magneten og vent et par min. indtil løsning rydder. Fjerne bufferen og Gentag dette trin, at reducere inkubationstiden til 30 min anden gang.
    3. Tilføje 200 µL af Wash Buffer og Inkuber det i 15 min med ende over ende rotation (~ 30-60 rpm) på 31 ᵒC. Sted rør på magnet og vent et par min. indtil løsning rydder. Fjerne bufferen.
    4. Tilføje 200 µL af PBS og inkuberes det i 5 min med ende over ende rotation (~ 30-60 rpm) på RT. placere rørene på magneten og vent et par min. indtil løsning rydder. Fjerne bufferen og Gentag dette trin.
  11. Simpel eluering
    1. Tilføje 40 µL vand af Molekylær renhed til perlerne og inkuberes ved 94 ᵒC i 5 min.
    2. Sted rør på magnet og vente et par minutter indtil løsningen rydder.
    3. Overføre supernatanten ind i et nyt rør. Kassér perlerne.
    4. Fortsæt til proteom-analyse eller gemme prøve på-80 ᵒC.
      Bemærk: Denne type af eluering fungerer godt for senere qPCR analyse og nogle proteomics målinger, men i andre tilfælde to alternative tilgange beskrevet nedenfor udbytte "renere" eluater.
  12. DNase eluering.
    1. Tilføje 40 µL 1 x DNase Buffer og 2 U af DNase til hver tube.
    2. Inkuber rør til 15 min på 37 ᵒC.
    3. Sted rør på en magnet og vent et par min., indtil løsningen rydder.
    4. Fjerne de eluted prøver fra glasperler og placere prøverne i en ny low-bindende tube.
    5. Inkuber tube på 94 ᵒC for 7 min at inaktiverer enzymet og gå videre til proteom analyser.
      Bemærk: Lavere DNase koncentrationer kan bruges, hvis interferens med proteom analyser er observeret. Det vil ikke være muligt at beregne fange enrichments af qPCR, hvis denne eluering metode bruges da DNase behandling helt ødelægger DNA-materiale i prøven.
    6. Fortsæt til proteom analyse eller gemme prøve på-80 ᵒC.
  13. Fodfæste eluering17.
    Bemærk: Denne metode er ikke anbefalet til længere oligonukleotider (> 40 baser). Denne metode kræver for capture oligonukleotider skal indeholde en yderligere 8 baser, der ikke overlapper med den genomiske sekvens og supplerende release oligonukleotider for at fortrænge mål fra capture oligonukleotider.
    1. Fortyndes 2 nanomoles af udgivelse oligonukleotider i 40 µL af VSK buffer.
    2. Inkuber det i 20 min. på RT.
    3. Sted rør på en magnet og vente et par minutter indtil løsningen rydder.
    4. Fjerne løsningen fra glasperler.
    5. Fortsæt til proteom analyse eller gemme prøve på-80 ᵒC.

5. evaluering af fange udbytte af qPCR med primere for Target Capture-Region af interesse

  1. Bruge en passende software eller online-værktøj til at designe primere og sonder til regionen mål.
    Bemærk: I dette eksperiment, promotor-regionen den DUSP3 og DUSP5 blev rettet. Primere og sonder anvendes er følgende. DUSP3: Primer 1 - GTG TTT AGG TTC FTT GAT CC, primer 2 - CGG AAT GTC TGC CTT CG, FAM-mærket sonde - TCC ATG CCC GAA TTG TGA KBRT CGG; DUSP5: Primer 1 - TGA GAA AGC FTT GAT GTG TC, primer 2 - GCC TTC AGA AAC CCC AAA AG, FAM-mærket sonde TGC ATT TAG AGC AGC CAG ATG AGG TT.
  2. Tage en alikvot af eluatet (ikke mere end 10 µL) og fortyndes 1:10 med molekylær grade H2O.
  3. Uddrag DNA af en af delprøver taget i trin 2.1.7 og bruge DNA-prøven for at gøre en standardkurve ved at gøre fem serie 1:10 fortyndinger i molekylær grade H2O.
  4. Forberede en qPCR master mix (bred vifte af kommercielle alternativer), tilføje primere og sonder og dispensere passende mængde (15 µL hvis kører en 20 µL reaktion) i hver brønd.
  5. Tilføj 5 µL af enten: a) fortyndes prøven, b) den standardkurve eller c) molekylære grade H2O (til at tjene som ingen skabelon kontrol) til hver brønd.
  6. Forsegle pladen og centrifugeres det ved 100 x g i 1 min.
  7. Køre i en qPCR system med følgende parametre: 5 min. ved 95 ᵒC efterfulgt af 40 cyklusser af 95 ᵒC for 20 s, 59 ᵒC for 20 s og 72 ᵒC for 25 s.
  8. Brug standardkurven til æsler udbytter og scrambled fange for at vurdere capture specificitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

På grund af behovet for input mængder af kromatin for HyCCAPP til at lykkes, dyrkes celler til relativt høje niveauer af confluency. Trypan blå farvning bruges til at bekræfte, at celle dødelighed er moderat (< 10%). I enkelt kopi eksperimenter, kromatin indhold før hybridisering fange skal være i femtomolar området, som normalt kræver mindst 109 celler som udgangspunkt materiale. Før fuld skala eksperimenter anbefales det at teste capture oligonukleotid ydeevne i mindre partier. Hybridisering fanger ved hjælp af en titrering af oligonukleotider er vist i figur 1. Antallet af capture oligonukleotider øges gradvist, mens den samlede koncentration forbliver konstant. Dette eksperiment viser tydeligt tre centrale aspekter. Først, det hjælper til at bestemme, for dette særlige område, hvor mange oligonukleotider er nødvendige for at nå optimale (og maksimal) hybridisering virkningsgrader. For det andet viser det, hvis der er nogen indlysende negative interaktioner mellem et bestemt sæt af oligonukleotider. Den viser endelig, hvis der er nogen oligonukleotider med dårlig specificitet, der foretager betydelige mængder af baggrunden (i dette tilfælde målt ved qPCR analyse med primere rettet mod andre regioner i genomet).

Capture hybridisering udbytter vises beskeden på grund af krydsbundet karakteren af kromatin prøven. En stor del af fragmenter i crosslinked kromatin vil ikke være modtagelig for hybridisering capture. Seriel hybridisering eksperimenter viser denne (figur 2). Hvis hybridisering capture drives med succes, vil en efterfølgende opsamling forsøget med samme kromatin materiale ved hjælp af et andet sæt af capture oligonukleotider resultere i sammenlignelige (lidt lavere) udbytte end når du bruger friske kromatin (~ 11% lavere på gennemsnit). Men hvis den samme region er målrettet igen med det samme sæt af oligonukleotider i en anden fange eksperiment ved hjælp af den kromatin prøve tilbage efter den første fange eksperimentere, udbyttet vil falde ca. 90%, bekræfter, at de fleste af de hybridisering-medgørlige materiale er blevet fanget. Hvis sådan et fald i capture ikke er observeret efter efterfølgende fanger med det samme sæt af oligonukleotider, angiver det et teknisk problem i hybridisering capture trin.

I simple systemer som gær konstaterede vi, fange effektivitetsgevinster nærmer sig 4%5, hvilket førte til identifikation af 9 proteiner varierende beriget med 2 regioner når gæren blev dyrket under forskellige betingelser. I humane celler er har en genom ~ 250 gange større end gær, hybridisering udbytter dog typisk under 1% (figur 3). Som figur 3 viser, kan en enkelt eksperiment give utilstrækkelig mængder for proteomics analyser. Flere erobrede prøver vil i så fald skulle samles for at udføre en efterfølgende massespektrometri analyse. Alternativt, kan lavere koncentrationer af erobrede target region kromatin bruges til målrettet analyse tilgange som western blotting og massespektrometri-baseret valgte reaktion overvågning assays.

Figure 1
Figur 1: Box plot repræsentation af capture oligonukleotid titrering. Stigende antal capture oligonukleotider blev testet og analyseret af qPCR. Baggrund refererer til qPCR assays rettet mod andre regioner i genomet. Værdier er præsenteret som fold ændring fra hybridisering capture ved hjælp af en enkelt oligonukleotid. Whiskers repræsenterer de minimale og maksimale værdier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Box plot repræsentation af serielle indfanger. Sekventiel hybridisering fanger med det samme sæt af oligonukleotider (A_A) viser en stærk nedgang i berigelse i forhold til sekventielle hybridisering fanger ved hjælp af forskellige sæt af oligonukleotider (Camillas) (p = 3.88 e-5). Tilsætning måles af qPCR og værdier er vist i forhold til fanger ved hjælp af friske kromatin. Whiskers repræsenterer de minimale og maksimale værdier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: hybridisering capture ved hjælp af menneskeceller. Hybridisering fange af regioner, der ligger i forskellige kromosomer. Hvert område fungerer som en negativ kontrol til den anden. Derudover udføres en hybridisering fange, ved hjælp af den forvrængede (Scr) sekvens som et sandt negativ kontrol. Fejllinjer udgør standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den HyCCAPP metode beskrevet her har mange unikke funktioner, der gør det en kraftfuld tilgang til at afdække DNA-vekselvirkninger, der ellers ville forblive undvigende. Arten af processen giver HyCCAPP fleksibilitet til at arbejde i forskellige organismer og regioner i genomet. Det er en metode, der har imidlertid adskillige begrænsninger skal overvejes.

HyCCAPP er en metode, der undgår enhver celle ændringer, således at det kan potentielt kunne anvendes i primærelementer, celle kultur systemer eller endda vævsprøver. Derfor kræver det dog prøver at være crosslinked, hvilket reducerer følsomheden i proteom-analyse og derfor kræver store input mængder. Der er nye tilgange, der er afhængige af CRISPR og biotinylation af omkring proteiner, der kan fungere uden crosslinking reaktioner12,13,14,18. Disse metoder kan være meget magtfulde, hvis plasmid indsætninger repræsenterer ikke en begrænsning, men kan kun bruges i celle kultur systemer. Andre tilgange er meget velegnet til at identificere generelle protein foreninger baseret på en kromatin stat eller tilstedeværelsen af et bestemt transkriptionsfaktorer, men er ikke beregnet til at studere individuelle loci9,10,19 .

HyCCAPP tilgangen præsenterer en alternativ tilgang med bred anvendelighed, men det er sandsynligvis at programmer i forskellige celle systemer eller organismer kræver optimering. Den mest kritiske optimering trin i metoden involverer design og valg af capture oligonukleotider. En række små test skal vise hvis de designede oligonukleotider er passende og sekvens i regionen er effektivt fanget. Der er flere faktorer, der bør overvejes, når designe og teste capture oligonukleotider, såsom oligonukleotid længde, grad af specificitet til målområde og interaktioner blandt sæt af oligonukleotider skal anvendes. Alle disse interaktioner kan let testet ved hjælp af en qPCR assay specifikke mål området. Hvis det ønskes, kan en ChIP-Seq-lignende arbejdsprocessen bruges til sekvens de resulterende DNA fragmenter og forsikre, at specificiteten af berigelse er tilfredsstillende på tværs af hele genom5.

Endelig de tværbindingsmidler betingelser er også meget vigtigt i HyCCAPP proceduren, og vi har observeret mærkbare forskelle mellem forskellige systemer, opnå de bedste resultater i humane celler af cross-linking med 1% formaldehyd, boer i gær, Cross-Linking med 3% formaldehyd givet mere reproducerbare resultater. Det er muligt, mere intens cross-linking med 3% formaldehyd i humane celler med en mere kompleks kromatin struktur ikke giver tilstrækkelig tilgængelighed for hybridisering capture oligonukleotider. Det er også tænkeligt, at tilstedeværelsen af en cellevæg i gær hindrer formaldehyd adgang ind i cellerne, øge mængden af formaldehyd, der er nødvendige for vellykket crosslinking niveauer i kromatin.

Udfører ChIP og andre capture tilgange målretning crosslinked menneskelige kromatin, har vi observeret, at kun omkring 1% af target-DNA faktisk kan blive fanget. For de fleste DNA-baserede tilgange og analyser er dette ikke en begrænsende faktor. Men i modsætning til ChIP, hvor den endelige udlæsning er baseret på amplifiable DNA, HyCCAPP afhængig proteinindhold for den endelige udlæsning. På grund af denne iboende begrænsninger, store mængder råmateriale (kulturperler celler i eksperimenterne præsenteret her) er påkrævet: denne fast format bør overvejes nøje før du udforsker denne metode, især når de anvendes til enkelt-kopi regioner. Ikke alle systemer vil være i stand til at producere antallet celler brug for, eller udgifterne til voksende kræves celle numre kan være uoverkommelige. De input beløb at HyCCAPP kræver (~ 109 celler) kan sammenlignes med andre metoder, at stole på crosslinked materiale med input beløb spænder mellem 108 og 1011 celler9,11,15. Fremtidige ændringer af HyCCAPP teknologien vil undersøge metoder til at kunstigt øge kopi numre af målområder, at gøre denne metode mere generelt gældende. På samme tid, vil vi arbejde for at øge den samlede effektivitet af den proces, der sammen med løbende fremskridt inden for massespektrometri bør reducere de input beløb behov og gøre denne teknologi muligt i flere systemer.

Biotinylation baserede tilgange ved hjælp af CRISPR, som enCHiP18 og andre har13,14, vist sig for at være meget effektiv ved at eliminere behovet for crosslinked materiale, øge udbyttet og reducere input krav. Omfattende behandling af celler i disse metoder tillader imidlertid ikke disse teknikker skal anvendes til vævsprøver, en retning, som vi er begyndt at forfølge med HyCCAPP, og som giver lovende resultater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Der er ingen interessekonflikter at videregive.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud P50HG004952 og R01GM109099 at MO.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PrimerQuest tool IDT
OligoAnalyzer 3.1 IDT Analyze capture oligonucleotids
PairFold UBC Analyze interactions
RPMI 1640 media Thermo Fisher 11875093
Penicillin-streptomycin Thermo Fisher 15140122
L-Glutamine  Thermo Fisher 25030081
Fetal bovine serum Thermo Fisher 26140079
Countess automated cell counter Thermo Fisher
850 cm2 roller bottle  Greiner Bio-one 680058
Roller system Wheaton 22-288-525
37 % formaldehyde  Sigma-Aldrich F8775
Glycine Sigma-Aldrich
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I3021
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P4380
HEPES Thermo Fisher 15630080
Branson digital sonifier SFX 150 Emerson
Qubit 3.0 fluorometer Thermo Fisher
Qubit dsDNA BR assay kit Thermo Fisher Q32850
Bioanalyzer 2100 Agilent
Agilent DNA 1000 kit Agilent 5067-1504
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
NaCl 5M Thermo Fisher AM9760G
EDTA Sigma-Aldrich
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher 12321D
DynaMag-15 magnet Thermo Fisher 12301D
Dynabeads M-280 atreptavidin Thermo Fisher 60210
Low binding tubes Eppendorf 22431081
Hybridization oven SciGene
Tube shaker and rotator Thermo Fisher 415110Q
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303
SSC buffer 20× concentrate Sigma-Aldrich S6639

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, (7414), 57-74 (2013).
  2. Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 5, (9), 3157-3170 (1978).
  3. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7, (2), 256-267 (2012).
  4. Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins. Anal. Chem. 89, (15), 7841-7846 (2017).
  5. Guillen-Ahlers, H., et al. HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Genomics. 107, (6), (2016).
  6. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae. J Proteome Res. 13, (8), 3810-3825 (2014).
  7. Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins. Physiol Genomics. 46, (13), 441-447 (2014).
  8. Lambert, J. -P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. Defining the budding yeast chromatin-associated interactome. Mol Syst Biol. 6, 448 (2010).
  9. Soldi, M., Bonaldi, T. The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components. Mol Cell Proteomics. 12, (3), 764-780 (2013).
  10. Wang, C. I., et al. Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila. Nat Struct Mol Biol. 20, (2), 202-209 (2013).
  11. Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus. Cell Rep. 2, (1), 198-205 (2012).
  12. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR. Biochem. Bioph. Res. Co. 439, (1), 132-136 (2013).
  13. Liu, X., et al. In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9. Cell. 170, (5), 1028-1043 (2017).
  14. Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells. bioRxiv. (2017).
  15. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, (1), 175-186 (2009).
  16. Buxton, K. E., et al. Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 16, (9), 3433-3442 (2017).
  17. Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. Multiplexed programmable release of captured DNA. Chembiochem. 15, (16), 2353-2356 (2014).
  18. Fujita, T., Fujii, H. Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Chromatin Protoc. Third Ed. 43-52 (2015).
  19. Lambert, J. -P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks. Mol Cell Proteomics. 8, (4), 870-882 (2009).
Tilpasning af hybridisering fange af kromatin-associerede proteiner for Proteomics til pattedyrceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K., Perumalla, D. S., Montoya, M. J., Jadhav, A. Y. L., Shortreed, M. R., Smith, L. M., Olivier, M. Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57140, doi:10.3791/57140 (2018).More

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K., Perumalla, D. S., Montoya, M. J., Jadhav, A. Y. L., Shortreed, M. R., Smith, L. M., Olivier, M. Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57140, doi:10.3791/57140 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter