Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Adaptação da hibridação capturar de proteínas da cromatina associada para proteômica para células de mamíferos

doi: 10.3791/57140 Published: June 1, 2018

Summary

Este é um método para identificar novas proteínas DNA-interagindo em loci de destino específico, baseando-se na captura de sequência-específicos da cromatina de quitosana para análises subsequentes proteomic. Nenhum conhecimento prévio sobre potenciais proteínas obrigatórias, nem modificações de célula são necessários. Inicialmente desenvolvido para o fermento, a tecnologia agora foi adaptada para células de mamíferos.

Abstract

A captura de hibridação de proteínas da cromatina associada para tecnologia de proteômica (HyCCAPP) foi desenvolvida inicialmente para descobrir romance interações DNA-proteína no fermento. Ele permite a análise de uma região alvo de interesse sem a necessidade de conhecimento prévio sobre proteínas provavelmente vinculados à região de destino. Isso, em teoria, permite que HyCCAPP a ser usado para analisar qualquer região genômica de interesse, e fornece flexibilidade suficiente para trabalhar em sistemas de células diferentes. Este método não pretende estudar locais obrigatórios conhecidos de factores de transcrição, uma tarefa que valorizaria imunoprecipitação da cromatina (ChIP) e ChIP-como métodos. A força do HyCCAPP reside em sua capacidade de explorar as regiões de ADN para o qual é limitado ou nenhum conhecimento sobre as proteínas associados a ele. Também pode ser um método conveniente para evitar enviesamentos (presente no ChIP, como métodos) introduzidos pelo enriquecimento à base de proteínas da cromatina usando anticorpos. Potencialmente, HyCCAPP pode ser uma ferramenta poderosa para descobrir verdadeiramente novas interações DNA-proteína. Até à data, a tecnologia foi predominantemente aplicada para células de levedura ou sequências de repetição de cópia elevada em células de mamíferos. Para se tornar a ferramenta poderosa que montamos, abordagens HyCCAPP precisam ser otimizado para capturar eficientemente cópia única loci em células de mamíferos. Aqui, apresentamos a nossa adaptação do fermento inicial HyCCAPP capturar protocolo para linhas de células humanas e mostrar que as regiões de cromatina de cópia única podem ser eficientemente isoladas com este protocolo modificado.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Durante a última década, tem visto uma melhora dramática em tecnologias de sequenciamento, permitindo o estudo de uma ampla gama de genomas em grande número de amostras e com resolução surpreendente. O consórcio livre de elementos de DNA (ENCODE), um esforço multi-institucional em grande escala, liderado pelo National Human Genome Research Institute dos National Institutes of Health, forneceu insights individuais como fatores de transcrição e outras proteínas reguladoras ligam e interagirem com o genoma. O esforço inicial caracteriza-se interações específicas do ADN-proteína, avaliada por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) para ligação a DNA conhecido mais de 100 proteínas1. Métodos alternativos como DNase footprinting2 e formaldeído assistido isolamento de elementos reguladores (FAIRE)3 também têm sido usados para localizar regiões específicas do genoma, interagindo com as proteínas, mas com a limitação óbvia que essas abordagens experimentais não identificar as proteínas interagindo. Apesar dos esforços de extensivos nos últimos anos, nenhuma tecnologia emergiu que eficientemente permite a caracterização abrangente das interações proteína-ADN da cromatina e a identificação e quantificação de proteínas da cromatina associada.

Para atender a essa necessidade, desenvolvemos uma nova abordagem que nós denominado como Hybridization Capture of Chromatin-Associated proteínas para proteômica (HyCCAPP). Inicialmente desenvolvido na levedura4,5,6, a abordagem isola quitosana cromatina as regiões de interesse (com proteínas acopladas) usando captura de hibridação de sequência específica. Após o isolamento dos complexos proteína-ADN, abordagens como a espectrometria de massa podem ser usadas para caracterizar o conjunto de proteínas vinculada à sequência de interesse. Assim, HyCCAPP pode ser considerado como uma abordagem não-tendencioso para descobrir romance interações DNA-proteína, no sentido de que ele não depende de anticorpos e isso é completamente agnóstica sobre as proteínas que podem ser encontradas. Existem outras abordagens capazes de descobrir o romance de proteínas DNA-interagindo7, mas dependem mais de ChIP-como métodos8,9,10, plasmídeo inserções11,12, 13,14, ou regiões com alta copiar números15. Em contraste, HyCCAPP pode ser aplicado às regiões de multi e single-cópia, e não exige qualquer informação prévia sobre as proteínas na região. Além disso, enquanto alguns dos métodos mencionados acima têm recursos valiosos, nomeadamente, evitando a necessidade para reações de reticulação do ADN-proteína, a característica única de HyCCAPP é que pode ser aplicado às regiões de cópia única no não modificado células e sem qualquer conhecimento prévio sobre proteínas putativo, ou anticorpos disponíveis.

Neste ponto, HyCCAPP predominantemente foi aplicada à análise de diversas regiões genômicas em levedura4,5,6e recentemente foi usado para analisar as interações proteína-ADN no DNA alfa-satélite, uma região de repetição no genoma humano16. Como parte do nosso trabalho em curso, adaptámos a abordagem de captura de hibridização inicialmente desenvolvida por cromatina de fermento a ser aplicável para a análise de células humanas e apresento aqui um protocolo modificado que permite a captura seletiva de destino de cópia única regiões no genoma humano com eficiência semelhante ao nossos estudos iniciais no fermento. Agora, este novo protocolo otimizado permite a adaptação e utilização da tecnologia para interrogar interações proteína-ADN através do genoma humano, utilizando espectrometria de massa ou outras abordagens analíticas.

É importante ressaltar que o método de HyCCAPP destina-se a análise de regiões-alvo específicos e ainda não é apropriado para análises de todo o genoma. A tecnologia é especialmente útil quando se lida com as regiões para as quais existe escassa informação sobre proteínas interagindo, ou quando uma mais abrangente análise aprofundada das proteínas interagindo em um locus específico do genoma é desejada. HyCCAPP destina-se a descobrir proteínas DNA-ligando mas não caracterizar com precisão os sites de ligação de proteínas específicas no DNA genômico. Em sua implementação atual, a metodologia não fornece informações sobre as sequências de ADN obrigatória ou motivos para proteínas individuais. Portanto, bem complementa tecnologias existentes, como FAIRE e pode permitir a identificação de novas proteínas nas regiões genômicas identificado por uma análise inicial de FAIRE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. capturar o Design do Oligonucleotide

  1. Desenha um painel de oligonucleotídeos para ser usado durante a captura de hibridação do alvo região/s.
    1. Objetivo 4 – 8 oligonucleotides por região de destino, mas como um mínimo de design, design do oligonucleotide pelo menos um direcionamento de cada extremidade da região de destino.
    2. Se a sequência de destino é longa (> 500 pares de bases), projetar os oligonucleotides como propagação para fora quanto possível para garantir o enriquecimento efetivo da cromatina em toda a região de destino inteiro.
      Nota: Observamos que captura ideal com oligonucleotídeos de 4 – 8. Mesmo que este processo pode funcionar bem com oligonucleotídeos mais, não é incomum observar uma diminuição do rendimento de enriquecimento quando muitos oligonucleotides são usados.
  2. Design oligonucleotides com temperaturas de derretimento semelhantes e certifique-se de que eles não formam ganchos fortes nem ter interações fortes (tendo em conta que a hibridação será realizada no ᵒC 42).
    Nota: Se uma eluição de ponto de apoio é escolhida (4.12.3), uma sequência de base 8 externo adicional deve ser adicionado para do oligonucleotide e exigirá oligonucleotídeos complementares 'liberação' no momento da eluição17. Várias ferramentas de software comercial podem ser usadas para selecionar e analisar os oligonucleotides. 25 mers tem mostrado bons resultados, mas dependendo do tamanho do genoma e sequência, captura oligonucleotides podem conter em algum lugar entre 20 e 80 bases. Normalmente, captura oligonucleotides tem uma temperatura de fusão perto ᵒC 62, mas isso pode mudar dependendo de seu comprimento. Temperaturas de fusão consistentes e/ou comprimento do oligonucleotide em todo o mix de captura pode ajudar a evitar enviesamentos indesejados no enriquecimento.
  3. Desenha os oligonucleotides captura com um agrupamento de biotina (de preferência separado por um espaçador da sequência de captura) na extremidade 3'.

2. cultura de pilha

  1. Cresce células lymphoblastoid humana (tais como GM12878 mostrado aqui) ou outras linhas de células em RPMI 1640 meios suplementados com 1% penicilina-estreptomicina, 2 mM L-glutamina e 5% de soro fetal bovino (FBS), a ᵒC 37 e 5% de CO2.
    1. Semente inicial congelado alíquotas (2 – 5 x 105 células) em um balão de T-25 com 6 mL de RPMI 1640 mídia preparada no ponto 2.1.
    2. Monitorar a densidade celular e viabilidade.
      1. Tome um representante alíquota de células e manchá-las com um corante apropriado como trypan azul.
      2. Medir a densidade de células usando um hemocytometer ou um contador de célula automatizada.
    3. Antes que a célula atinge a densidade de 1 x 106 células/mL, girar as células para baixo a 100 x g por 5 min e transferir as células para um balão de T-75 com 25 mL de RPMI 1640 mídia preparada no ponto 2.1. Cresce as células até a densidade celular se aproxima de 1 x 106 células/mL.
    4. As células de transferência para um balão de T-150 em 38 mL de RPMI 1640 mídia (2.1) e crescer as células por mais dois dias.
      Nota: Lymphoblastoid células crescem em suspensão. Orientações gerais para o cultivo de células lymphoblastoid recomendam densidades de célula a ser mantida entre 0,2 a 1 x 106 células/mL. Devido à grande quantidade de material necessário nesta tecnologia, o presente protocolo escrito propositadamente crescer células para uma densidade de celular, além do que é comumente usado. Protocolos de crescimento celular podem ser revistos e adaptados pelo leitor dependendo dos tipos de célula a ser usado.
    5. Girar as células para baixo a 100 x g por 5 min, Ressuspender as células em 10 mL de RPMI 1640 mídia (2.1) e despeje uma garrafa de rolo de2 850 cm contendo 500 mL de mídia a suspensão. Incubar as células sob as mesmas condições que antes, mas neste ponto iniciar usando a rotação constante (~0.5 rpm).
    6. Monitorar o crescimento de células e alterar a mídia quando necessário (normalmente a cada 3 – 4 dias). Deixe que as células crescem a uma densidade tão perto quanto possível a 2 x 106 células/mL (1 x 109 células no total).
    7. Uma vez que a contagem de célula desejada é atingida, colher as células girando as células para baixo a 100 x g por 5 min e ressuspender as células em 36 mL de RPMI 1640 mídia (2.1). Transferi a suspensão de células para um tubo cónico de 50 mL. Tome pequenas alíquotas para contagem de células e extração de DNA.
  2. Crosslink, adicionando 1 mL de formol 37% para atingir uma concentração final de 1%.
    Cuidado: O formaldeído é uma substância cancerígena e deve ser tratado em uma coifa.
    1. Incube as celulas com rotação (~ 30 – 60 rpm) durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT).
    2. Saciar a reação de ligação cruzada adicionando 2 mL de uma solução de glicina de 2,5 M, para uma concentração final de 125 mM.
    3. Incube as celulas com rotação (~ 30 – 60 rpm) durante 5 min à RT. Pellet as células por centrifugação a 100 x g por 5 min e lavar as células duas vezes com gelo frio 1X PBS.
  3. Continue para o próximo passo ou resuspenda o pellet em 5 mL de tampão de lise celular (5 mM Hepes, 85 mM KCl, 0,5% Igepal, inibidores de protease (PI)) e snap-congelar a suspensão gota a gota em nitrogênio líquido. Armazene as amostras em ᵒC-80.
    Nota: Preparar > 25 mL de tampão de lise celular sem Igepal e PI e adicionar os reagentes frescos quando estiver pronto para usar. Evite o armazenamento a longo prazo de lise celular uma vez Igepal e PI foram adicionados. Loja lise celular em 4 ᵒC por até 3 meses. Igepal é um detergente não iônico, não-desnaturação. NP-40 potencialmente pode ser usado como uma alternativa ao Igepal, mas nós não usamos isso neste contexto como NP-40 não é recomendado quando, eventualmente, amostras são analisadas por espectrometria de massa para caracterizar as proteínas de ligação do DNA.

3. Lise e distorção

  1. Preparar > 15 mL de tampão de lise de núcleos (10mm EDTA, pH 8.0, do Tris de 50mm 1% SDS, PI).
    Nota: Adicionar PI fresco, só para os montantes a ser usado. Evite o armazenamento a longo prazo de núcleos lise uma vez PI foi adicionado. Tampão de Lise núcleos pode ser armazenado no RT até 1 mês.
  2. Resuspenda o pellet em 20 mL de tampão de lise celular (contendo Igepal e PI). Deixe as pelotas descongelar no gelo e misture bem uma vez descongelados. Deixe amostras para um adicional 10 min no gelo. Centrifugar as células a 400 x g a 4 ᵒC por 5 min.
  3. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 6 mL de tampão de Lise núcleos com PI (volume pode ser aumentado se as células não formam uma suspensão).
  4. Em preparação para sonication, dividir a amostra uniformemente em ~ 6 – 8 tubos de microcentrífuga (600 a 1.000 µ l para cada tubo).
    1. Colocar as amostras no gelo ou um rack frio e proceda à sonicação a amostra usando um sonicador com um microtip. Usar a amplitude de 65% com 5 x 20 rajadas s constante, permitindo a suspensão esfriar pelo menos 40 s entre pulsos.
      Nota: Se aumentam volumes > 10 mL por exemplo, um copo de refrigeração célula pode ser usado em vez disso. Mais e mais explosões seria necessários então. Sonicators diferem grandemente. Condições podem ter que ser otimizado pelo leitor. Outras alternativas de sonication podem ser usadas também.
  5. Centrifugar as células a 12.000 x g durante 10 minutos a 4 ᵒC, transferir o sobrenadante para um tubo novo e descartar as pelotas.
  6. Estimativa total recuperação usando um método fluorométrica.
  7. Continue para o próximo passo ou snap-congelar e armazenar a amostra no ᵒC-80.
  8. Opcional: Tome uma alíquota, retrocesso ligações cruzadas incubando durante a noite no ᵒC 67 em 0,3 M de NaCl. Limpe o DNA e executá-lo no Bioanalyzer para determinar os comprimentos de fragmento. A maior parte dos fragmentos deve ser entre 500 e 1.000 bp.
    Nota: É Okey parar neste ponto e armazenar as amostras em ᵒC-80.

4. hibridação captura

  1. Preparar 500 mL de tampão de hibridização (Hyb) de 2x (200mm MES, 2 M NaCl, 40 mM EDTA, 0,02% Tween-20) e 500 mL de tampão de lavagem (200 mM NaCl, 0,2% SDS, 50 mM Tris pH 8). Armazene o Hyb e Buffers de lavagem em 4 ᵒC e temperatura, respectivamente, por até 3 meses. Use metade do buffer x Hyb 2 para preparar um 1x tampão de hibridização. Também armazená-lo em 4 ᵒC por até 3 meses.
    Nota: O volume total de captura a hibridação será duas vezes o volume da amostra resultante na etapa anterior (conforme descrito até agora, o volume da amostra seria de cerca de 6 mL e, portanto, o volume total de hibridação seria 12ml).
  2. Reserve grânulos igual a 5% do volume total de hibridização captura (600 µ l neste caso). Um ímã apropriado e adequado é necessário para trabalhar com os grânulos nas etapas a seguir.
  3. Lave os grânulos três vezes com 1 x Hyb Buffer usando duas vezes o volume de grânulos (1200 µ l). Resuspenda as contas em 1.200 µ l de 2 x Hyb Buffer. Coloque os tubos no ímã, até que a solução limpa e remover o tampão.
  4. Realize reações de Pre-esclarecimento em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL com um máximo de 700 µ l de amostra por tubo. Adicione suficiente grânulos (5%) e 2 x Hyb Buffer para diluir o buffer Hyb 1 x (10 tubos com 600 µ l de amostra, 120 µ l de grânulos lavados resuspended em 2 x Hyb Buffer e 480 µ l de 2 x Hyb Buffer). Incube-os durante 10 minutos a 31 ᵒC com final mais rotação final (~ 30 – 60 rpm).
  5. Coloque os tubos em um ímã até grânulos são imobilizados e transferir as amostras para tubos novos. Descarte os grânulos.
    Nota: A partir daí, os tubos de ligação de baixo são recomendados.
  6. Resuspenda os oligonucleotides de captura para uma solução de trabalho de 10 pmol / µ l e adicionar 4 µ l desta solução para cada tubo.
    Nota: Diferentes regiões podem atuar como controle para o outro, mas é recomendável incluir do oligonucleotide captura com sua sequência que se esforçavam para servir como um controle negativo.
  7. Incubar os tubos por 40 min em 42 ᵒC com final mais rotação final (~ 30 – 60 rpm).
  8. Durante a incubação, separe as contas necessárias (0,3 µ l/pmol de captura do oligonucleotide). Lave os grânulos três vezes, conforme descrito na etapa 4.3, mas Ressuspender as células em 1 x Hyb Buffer.
  9. Adicione as contas lavadas à amostra e incubar as amostras por 30 min em RT com final mais rotação final (~ 30 – 60 rpm). Coloque os tubos sobre o ímã e remover o sobrenadante, uma vez que as contas têm sido imobilizadas.
  10. Os grânulos de lavagem
    1. Adicionar 1,2 mL de tampão de lavagem e incubar a amostra por 5 min com final mais rotação final (~ 30 – 60 rpm) em tubos de RT. lugar sobre o ímã e esperar um par de min até solução limpa. Retire o tampão e repita este passo.
    2. Adicionar 1,2 mL de tampão de lavagem e incube-lo para 1 h com final mais rotação final (~ 30-60 rpm) em RT. Coloque os tubos sobre o ímã e esperar uns minutos até solução limpa. Retire o tampão e repita esta etapa, reduzindo o tempo de incubação a 30 min do segundo tempo.
    3. Adicionar 200 µ l de tampão de lavagem e incube por 15 min com final mais rotação final (~ 30 – 60 rpm) em 31 de ᵒC. Coloque os tubos sobre o ímã e esperar uns minutos até solução limpa. Retire o tampão.
    4. Adicionar 200 µ l de PBS e incubá-lo por 5 min com final sobre rotação final (~ 30 – 60 rpm) em RT. Coloque os tubos sobre o ímã e esperar uns minutos até solução limpa. Retire o tampão e repita este passo.
  11. Eluição simples
    1. Adicionar 40 µ l de água molecular grau aos talões e incuba-lo em 94 ᵒC por 5 min.
    2. Coloque os tubos sobre o ímã e aguarde alguns minutos até que a solução limpa.
    3. Transferi o sobrenadante para um tubo novo. Descarte os grânulos.
    4. Proceder à análise proteômica ou armazenar a amostra no ᵒC-80.
      Nota: Este tipo de eluição funciona bem para análise posterior da qPCR e algumas medidas de proteômica, mas em outras instâncias duas abordagens alternativas descritas abaixo rendimento eluídos "limpador".
  12. Eluição de DNase.
    1. Adicione 40 µ l de tampão de DNase 1x e 2 U de DNase para cada tubo.
    2. Incube os tubos por 15 min a 37 ᵒC.
    3. Coloque os tubos em um ímã e esperar uns minutos até que a solução limpa.
    4. Retire as amostras eluted as contas e colocar as amostras em um novo tubo de ligação de baixa.
    5. Incube o tubo em 94 ᵒC por 7 min inativar a enzima e proceder à análise proteômica.
      Nota: Concentrações de DNase podem ser usadas se for observada interferência com análises proteômica. Não será possível calcular os avanços de captura por qPCR se este método de eluição é usado desde o tratamento de DNase destrói completamente o material de DNA na amostra.
    6. Proceder à análise proteômica ou armazenar a amostra no ᵒC-80.
  13. Ponto de apoio da eluição17.
    Nota: Este método não é recomendado para oligonucleotides mais longos (> 40 bases). Este método requer para os oligonucleotides captura conter uma bases 8 adicionais que não se sobrepõem com a sequência genômica e oligonucleotides lançamento complementar para deslocar o alvo dos oligonucleotides de captura.
    1. Dilua 2 nanomoles de oligonucleotídeos de lançamento em 40 µ l de tampão SSC.
    2. -Incubar por 20 min no RT
    3. Coloque os tubos em um ímã e aguarde alguns minutos até que a solução limpa.
    4. Remova a solução de grânulos.
    5. Proceder à análise proteômica ou armazenar a amostra no ᵒC-80.

5. avaliação de capturar rendimento por qPCR com Primers para a região de capturar alvo de interesse

  1. Use um software adequado ou ferramenta on-line para projetar primers e sondas para a região de destino.
    Nota: Neste experimento, foram alvejados na região promotora do DUSP3 e DUSP5 . Os primers e sondas utilizadas são os seguintes. DUSP3: Primer 1 - GTG TTT AGG TTC CCT GAT CC, cartilha 2 - CGG AAT GTC TGC CTT CG, FAM-rotulado sonda - TCC ATG CCC GAA TTG TGA CGT CGG; DUSP5: Primer 1 - TGA GAA AGC CCT GAT GTG TC, cartilha 2 - GCC TTC AGA AAC CCC AAA AG, FAM-rotulado sonda TGC ATT TAG AGC AGC CAG ATG AGG TT.
  2. Tomar uma alíquota do eluato (não mais de 10 µ l) e diluir 01:10 com molecular da classe H2O.
  3. Extrair o DNA de uma das alíquotas tomadas na etapa 2.1.7 e usar aquela amostra de DNA para fazer uma curva padrão fazendo cinco serial 01:10 diluições em molecular grau H2O.
  4. Preparar uma mistura de mestre qPCR (grande variedade de alternativas comerciais), adicionar primers e sondas e dosear a quantidade adequada (15 µ l se executando uma reação de 20 µ l) em cada poço.
  5. Adicionar 5 µ l de qualquer: a) diluído a amostra, b) a curva padrão ou classe c) molecular H2O (para servir como nenhum modelo de controle) para cada poço.
  6. Selar a placa e centrifuga-lo a 100 x g por 1 min.
  7. Executar em um sistema de qPCR com os seguintes parâmetros: 5 min à 95 ᵒC seguido de 40 ciclos de ᵒC 95 por 20 s, 59 ᵒC por 20 s e 72 ᵒC para 25 s.
  8. Use a curva padrão para rendimentos de bundas e captura ovos mexida para avaliar a especificidade de captura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Devido a necessidade de grandes quantidades de entrada de cromatina para HyCCAPP ter sucesso, as células são cultivadas a níveis relativamente elevados de confluência. Trypan coloração azul é usada para confirmar que as taxas de morte celular são moderadas (< % 10). Em experimentos de cópia única, conteúdo de cromatina antes da captura da hibridização precisa ser na faixa de femtomolar, que geralmente exige pelo menos 109 células, como material de partida. Antes de experiências em escala completa, é recomendável testar o desempenho de captura do oligonucleotide em lotes menores. Hibridização de captura usando uma titulação dos oligonucleotides é mostrada na Figura 1. O número de oligonucleotídeos de captura é aumentado gradualmente, enquanto a concentração total permanece constante. Esta experiência mostra claramente três aspectos-chave. Primeiro, ajuda a determinar, para aquela determinada região, quantos oligonucleotides são necessários para atingir eficiências de hibridização ideal (e máxima). Em segundo lugar, revela se há quaisquer interacções prejudiciais óbvias entre um determinado conjunto de oligonucleotídeos. Por último, mostra que se há qualquer oligonucleotides com especificidade pobre que carregam quantidades substanciais de fundo (neste caso medido pelo qPCR análise com primers visando outras regiões no genoma).

Os rendimentos de hibridação de captura aparecerá modestos devido à natureza reticulada da amostra da cromatina. Uma grande proporção de fragmentos na cromatina a quitosana não será favorável para captura de hibridização. As experiências de hibridação serial demonstram este (Figura 2). Se a captura de hibridização é executada com êxito, um experimento de captura subsequentes do mesmo material da cromatina usando um conjunto diferente de captura oligonucleotides resultará em comparáveis rendimentos (ligeiramente inferiores) do que quando usando o fresco da cromatina (~ 11% menor em média). Mas se a mesma região destina-se novamente com o mesmo conjunto de oligonucleotídeos em uma segunda experiência de captura usando a cromatina amostra restante após a captura do primeira experimento, o rendimento diminuirá cerca de 90%, confirmando que a maior parte do material passível de hibridização foi capturado. Se tal uma diminuição na captura não for observada após captura subsequente com o mesmo conjunto de oligonucleotídeos, isso indica um problema técnico na etapa de captura de hibridização.

Em sistemas simples como o fermento, observamos que a eficiência de captura aproximando-se 4%5, que levou à identificação de 9 proteínas diferencialmente enriquecido em 2 regiões quando a levedura foi cultivada sob diferentes condições. Em células humanas no entanto, tendo um genoma ~ 250 vezes maior que a levedura, rendimentos de hibridização são tipicamente abaixo de 1% (Figura 3). Como mostra a Figura 3 , uma única experiência pode produzir quantidades insuficientes para análise proteômica. Nesse caso, terá várias amostras capturadas seja agrupado para realizar uma análise de espectrometria de massa subsequente. Alternativamente, concentrações inferiores da cromatina de região alvo capturado podem ser usadas para abordagens de análise orientada como mancha ocidental e espectrometria de massa base reação selecionada ensaios de monitoramento.

Figure 1
Figura 1: representação de trama caixa de titulação de captura do oligonucleotide. Aumentando o número de captura oligonucleotídeos foram testados e analisados por qPCR. Plano de fundo refere-se a ensaios de qPCR visando outras regiões no genoma. Valores são apresentados como prega mudança de captura de hibridação usando um único do oligonucleotide. Bigodes representam os valores mínimos e máximos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: representação de trama caixa de capturas seriais. Captura sequencial de hibridação com o mesmo conjunto de oligonucleotídeos (A_A) mostra uma forte queda no enriquecimento comparado a hibridização sequencial captura usando um conjunto diferente de oligonucleotídeos (A_B) (p = 3,88 e-5). Enriquecimento é medido por qPCR e valores são mostrados em relação a captura usando o fresco da cromatina. Bigodes representam os valores mínimos e máximos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: captura de hibridação usando células humanas. Hibridização captura de regiões situadas em cromossomos diferentes. Cada região serve como um controle negativo para o outro. Além disso, uma captura de hibridização é executada usando a sequência de ovos mexida (Scr) como um controle negativo. Barras de erro representam o desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

O método de HyCCAPP descrito aqui tem muitas características únicas que a tornam uma poderosa abordagem para desvendar o DNA-interações que caso contrário permaneceria indescritíveis. A natureza do processo dá HyCCAPP a flexibilidade para trabalhar em diferentes organismos e regiões do genoma. É um método, no entanto, que tem várias limitações para ser considerada.

HyCCAPP é um método que evita quaisquer modificações de célula para que potencialmente pode ser aplicada em células primárias, sistemas de cultura de células ou amostras de tecido mesmo. Por causa disso, no entanto, requer amostras para ser ligado, o que reduz a sensibilidade em análise proteômica e, portanto, requer grandes quantidades de entrada. Lá estão surgindo abordagens que dependem de CRISPR e biotinylation de em torno de proteínas que podem funcionar sem reticulação reações12,13,14,18. Essas abordagens podem ser muito poderosas se inserções de plasmídeo não representam uma restrição, mas só podem ser usadas em sistemas de cultura de células. Outras abordagens são muito adequadas para identificar a proteína geral associações com base em um estado de cromatina ou na presença de um fatores de transcrição particular, mas não se destinam a estudar loci individuais9,10,19 .

A abordagem HyCCAPP apresenta uma abordagem alternativa com ampla aplicabilidade, mas é provável que os aplicativos em sistemas diferentes de células ou organismos exigirá a otimização. A etapa de otimização mais crítica na abordagem envolve o projeto e seleção de oligonucleotídeos de captura. Uma série de testes de pequena escala deve mostrar se os oligonucleotides projetados são adequados e se a sequência na região efetivamente é capturada. Existem vários fatores que devem ser considerados ao projetar e captura oligonucleotides, tais como o comprimento do oligonucleotide, grau de especificidade para a região de destino e as interações entre o conjunto de oligonucleotídeos de teste a ser usado. Todas essas interações podem ser facilmente testadas usando um ensaio de qPCR específico para a região de destino. Se desejado, um ChIP-Seq-como fluxo de trabalho pode ser usado para sequenciar os fragmentos de DNA resultantes e assegurar-se de que a especificidade do enriquecimento é satisfatória em todo o genoma inteiro5.

Finalmente, as condições do cross-linking também são altamente importantes no processo de HyCCAPP, e temos observado diferenças perceptíveis entre os diferentes sistemas, obtendo os melhores resultados em células humanas por cross-linking com 1% de formaldeído, Considerando que no fermento, Cross-linking com formaldeído 3% resultados mais reprodutíveis. É possível que o mais intenso do cross-linking com 3% de formaldeído em células humanas, com uma estrutura mais complexa de cromatina não fornece suficiente acessibilidade para os oligonucleotides captura de hibridização. Também é possível que a presença de uma parede celular de levedura impede acesso de formaldeído para as células, aumentando a quantidade de formaldeído necessário para os níveis de sucesso reticulação na cromatina.

Realização de ChIP e outras abordagens de captura direcionamento humano cromatina quitosana, observamos que apenas cerca de 1% do ADN do alvo na verdade pode ser capturado. Para a maioria das análises e abordagens baseadas em ADN, este não é um fator limitante. No entanto, ao contrário do ChIP, onde a leitura final é baseada no DNA ampliáveis, HyCCAPP baseia-se no conteúdo de proteína para a leitura final. Devido a essa limitação intrínseca, grandes quantidades de material de entrada (pilhas cultivadas nas experiências apresentadas aqui) são necessárias: este restringir deverão ser cuidadosamente considerado antes de explorar esta metodologia, especialmente quando aplicado às regiões de cópia única. Nem todos os sistemas será capazes de produzir o número de células necessárias, ou o custo de crescer o número de células necessárias pode ser proibitivo. Os valores de entrada que HyCCAPP requer (~ 109 células) é comparável a outros métodos que se baseiam no material reticulado com entrada quantidades que variam entre 108 e 1011 células11,9,15. Modificações futuras da tecnologia HyCCAPP irão explorar abordagens para aumentar artificialmente o número de cópias das regiões alvo, tornar este método mais amplamente aplicável. Ao mesmo tempo, vamos trabalhar para continuar aumentando a eficiência global do processo que, juntamente com os avanços contínuos em espectrometria de massa, deve reduzir a quantidade de entrada necessário e viabilizar essa tecnologia em sistemas de mais.

Biotinylation com base em abordagens usando CRISPR, como enCHiP18 e outros13,14, têm demonstrado ser muito eficaz, eliminando a necessidade de material de quitosana, aumentando o rendimento, e reduzindo significativamente a entrada requisitos. O processamento elaborado de células em um desses métodos, no entanto, não permite que essas técnicas a aplicar para amostras de tecido, uma direção que começamos a perseguir com HyCCAPP e que está produzindo resultados promissores.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Há não há conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo NIH bolsas P50HG004952 e R01GM109099 de MO.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PrimerQuest tool IDT
OligoAnalyzer 3.1 IDT Analyze capture oligonucleotids
PairFold UBC Analyze interactions
RPMI 1640 media Thermo Fisher 11875093
Penicillin-streptomycin Thermo Fisher 15140122
L-Glutamine  Thermo Fisher 25030081
Fetal bovine serum Thermo Fisher 26140079
Countess automated cell counter Thermo Fisher
850 cm2 roller bottle  Greiner Bio-one 680058
Roller system Wheaton 22-288-525
37 % formaldehyde  Sigma-Aldrich F8775
Glycine Sigma-Aldrich
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I3021
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P4380
HEPES Thermo Fisher 15630080
Branson digital sonifier SFX 150 Emerson
Qubit 3.0 fluorometer Thermo Fisher
Qubit dsDNA BR assay kit Thermo Fisher Q32850
Bioanalyzer 2100 Agilent
Agilent DNA 1000 kit Agilent 5067-1504
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
NaCl 5M Thermo Fisher AM9760G
EDTA Sigma-Aldrich
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher 12321D
DynaMag-15 magnet Thermo Fisher 12301D
Dynabeads M-280 atreptavidin Thermo Fisher 60210
Low binding tubes Eppendorf 22431081
Hybridization oven SciGene
Tube shaker and rotator Thermo Fisher 415110Q
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303
SSC buffer 20× concentrate Sigma-Aldrich S6639

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, (7414), 57-74 (2013).
  2. Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 5, (9), 3157-3170 (1978).
  3. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7, (2), 256-267 (2012).
  4. Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins. Anal. Chem. 89, (15), 7841-7846 (2017).
  5. Guillen-Ahlers, H., et al. HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Genomics. 107, (6), (2016).
  6. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae. J Proteome Res. 13, (8), 3810-3825 (2014).
  7. Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins. Physiol Genomics. 46, (13), 441-447 (2014).
  8. Lambert, J. -P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. Defining the budding yeast chromatin-associated interactome. Mol Syst Biol. 6, 448 (2010).
  9. Soldi, M., Bonaldi, T. The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components. Mol Cell Proteomics. 12, (3), 764-780 (2013).
  10. Wang, C. I., et al. Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila. Nat Struct Mol Biol. 20, (2), 202-209 (2013).
  11. Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus. Cell Rep. 2, (1), 198-205 (2012).
  12. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR. Biochem. Bioph. Res. Co. 439, (1), 132-136 (2013).
  13. Liu, X., et al. In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9. Cell. 170, (5), 1028-1043 (2017).
  14. Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells. bioRxiv. (2017).
  15. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, (1), 175-186 (2009).
  16. Buxton, K. E., et al. Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 16, (9), 3433-3442 (2017).
  17. Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. Multiplexed programmable release of captured DNA. Chembiochem. 15, (16), 2353-2356 (2014).
  18. Fujita, T., Fujii, H. Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Chromatin Protoc. Third Ed. 43-52 (2015).
  19. Lambert, J. -P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks. Mol Cell Proteomics. 8, (4), 870-882 (2009).
Adaptação da hibridação capturar de proteínas da cromatina associada para proteômica para células de mamíferos
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K., Perumalla, D. S., Montoya, M. J., Jadhav, A. Y. L., Shortreed, M. R., Smith, L. M., Olivier, M. Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57140, doi:10.3791/57140 (2018).More

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K., Perumalla, D. S., Montoya, M. J., Jadhav, A. Y. L., Shortreed, M. R., Smith, L. M., Olivier, M. Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57140, doi:10.3791/57140 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter