Adaptação da hibridação capturar de proteínas da cromatina associada para proteômica para células de mamíferos
Summary
Este é um método para identificar novas proteínas DNA-interagindo em loci de destino específico, baseando-se na captura de sequência-específicos da cromatina de quitosana para análises subsequentes proteomic. Nenhum conhecimento prévio sobre potenciais proteínas obrigatórias, nem modificações de célula são necessários. Inicialmente desenvolvido para o fermento, a tecnologia agora foi adaptada para células de mamíferos.
Abstract
A captura de hibridação de proteínas da cromatina associada para tecnologia de proteômica (HyCCAPP) foi desenvolvida inicialmente para descobrir romance interações DNA-proteína no fermento. Ele permite a análise de uma região alvo de interesse sem a necessidade de conhecimento prévio sobre proteínas provavelmente vinculados à região de destino. Isso, em teoria, permite que HyCCAPP a ser usado para analisar qualquer região genômica de interesse, e fornece flexibilidade suficiente para trabalhar em sistemas de células diferentes. Este método não pretende estudar locais obrigatórios conhecidos de factores de transcrição, uma tarefa que valorizaria imunoprecipitação da cromatina (ChIP) e ChIP-como métodos. A força do HyCCAPP reside em sua capacidade de explorar as regiões de ADN para o qual é limitado ou nenhum conhecimento sobre as proteínas associados a ele. Também pode ser um método conveniente para evitar enviesamentos (presente no ChIP, como métodos) introduzidos pelo enriquecimento à base de proteínas da cromatina usando anticorpos. Potencialmente, HyCCAPP pode ser uma ferramenta poderosa para descobrir verdadeiramente novas interações DNA-proteína. Até à data, a tecnologia foi predominantemente aplicada para células de levedura ou sequências de repetição de cópia elevada em células de mamíferos. Para se tornar a ferramenta poderosa que montamos, abordagens HyCCAPP precisam ser otimizado para capturar eficientemente cópia única loci em células de mamíferos. Aqui, apresentamos a nossa adaptação do fermento inicial HyCCAPP capturar protocolo para linhas de células humanas e mostrar que as regiões de cromatina de cópia única podem ser eficientemente isoladas com este protocolo modificado.
Introduction
Durante a última década, tem visto uma melhora dramática em tecnologias de sequenciamento, permitindo o estudo de uma ampla gama de genomas em grande número de amostras e com resolução surpreendente. O consórcio livre de elementos de DNA (ENCODE), um esforço multi-institucional em grande escala, liderado pelo National Human Genome Research Institute dos National Institutes of Health, forneceu insights individuais como fatores de transcrição e outras proteínas reguladoras ligam e interagirem com o genoma. O esforço inicial caracteriza-se interações específicas do ADN-proteína, avaliada por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) para ligação a DNA conhecido mais de 100 proteínas1. Métodos alternativos como DNase footprinting2 e formaldeído assistido isolamento de elementos reguladores (FAIRE)3 também têm sido usados para localizar regiões específicas do genoma, interagindo com as proteínas, mas com a limitação óbvia que essas abordagens experimentais não identificar as proteínas interagindo. Apesar dos esforços de extensivos nos últimos anos, nenhuma tecnologia emergiu que eficientemente permite a caracterização abrangente das interações proteína-ADN da cromatina e a identificação e quantificação de proteínas da cromatina associada.
Para atender a essa necessidade, desenvolvemos uma nova abordagem que nós denominado como Hybridization Capture of Chromatin-Associated proteínas para proteômica (HyCCAPP). Inicialmente desenvolvido na levedura4,5,6, a abordagem isola quitosana cromatina as regiões de interesse (com proteínas acopladas) usando captura de hibridação de sequência específica. Após o isolamento dos complexos proteína-ADN, abordagens como a espectrometria de massa podem ser usadas para caracterizar o conjunto de proteínas vinculada à sequência de interesse. Assim, HyCCAPP pode ser considerado como uma abordagem não-tendencioso para descobrir romance interações DNA-proteína, no sentido de que ele não depende de anticorpos e isso é completamente agnóstica sobre as proteínas que podem ser encontradas. Existem outras abordagens capazes de descobrir o romance de proteínas DNA-interagindo7, mas dependem mais de ChIP-como métodos8,9,10, plasmídeo inserções11,12, 13,14, ou regiões com alta copiar números15. Em contraste, HyCCAPP pode ser aplicado às regiões de multi e single-cópia, e não exige qualquer informação prévia sobre as proteínas na região. Além disso, enquanto alguns dos métodos mencionados acima têm recursos valiosos, nomeadamente, evitando a necessidade para reações de reticulação do ADN-proteína, a característica única de HyCCAPP é que pode ser aplicado às regiões de cópia única no não modificado células e sem qualquer conhecimento prévio sobre proteínas putativo, ou anticorpos disponíveis.
Neste ponto, HyCCAPP predominantemente foi aplicada à análise de diversas regiões genômicas em levedura4,5,6e recentemente foi usado para analisar as interações proteína-ADN no DNA alfa-satélite, uma região de repetição no genoma humano16. Como parte do nosso trabalho em curso, adaptámos a abordagem de captura de hibridização inicialmente desenvolvida por cromatina de fermento a ser aplicável para a análise de células humanas e apresento aqui um protocolo modificado que permite a captura seletiva de destino de cópia única regiões no genoma humano com eficiência semelhante ao nossos estudos iniciais no fermento. Agora, este novo protocolo otimizado permite a adaptação e utilização da tecnologia para interrogar interações proteína-ADN através do genoma humano, utilizando espectrometria de massa ou outras abordagens analíticas.
É importante ressaltar que o método de HyCCAPP destina-se a análise de regiões-alvo específicos e ainda não é apropriado para análises de todo o genoma. A tecnologia é especialmente útil quando se lida com as regiões para as quais existe escassa informação sobre proteínas interagindo, ou quando uma mais abrangente análise aprofundada das proteínas interagindo em um locus específico do genoma é desejada. HyCCAPP destina-se a descobrir proteínas DNA-ligando mas não caracterizar com precisão os sites de ligação de proteínas específicas no DNA genômico. Em sua implementação atual, a metodologia não fornece informações sobre as sequências de ADN obrigatória ou motivos para proteínas individuais. Portanto, bem complementa tecnologias existentes, como FAIRE e pode permitir a identificação de novas proteínas nas regiões genômicas identificado por uma análise inicial de FAIRE.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método de HyCCAPP descrito aqui tem muitas características únicas que a tornam uma poderosa abordagem para desvendar o DNA-interações que caso contrário permaneceria indescritíveis. A natureza do processo dá HyCCAPP a flexibilidade para trabalhar em diferentes organismos e regiões do genoma. É um método, no entanto, que tem várias limitações para ser considerada.
HyCCAPP é um método que evita quaisquer modificações de célula para que potencialmente pode ser aplicada em cé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH bolsas P50HG004952 e R01GM109099 de MO.
Materials
| PrimerQuest tool | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT | Analyze capture oligonucleotids | |
| PairFold | UBC | Analyze interactions | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher | 11875093 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 26140079 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| 850 cm2 roller bottle | Greiner Bio-one | 680058 | |
| Roller system | Wheaton | 22-288-525 | |
| 37 % formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | ||
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P4380 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Branson digital sonifier SFX 150 | Emerson | ||
| Qubit 3.0 fluorometer | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA BR assay kit | Thermo Fisher | Q32850 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Agilent DNA 1000 kit | Agilent | 5067-1504 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| NaCl 5M | Thermo Fisher | AM9760G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| DynaMag-15 magnet | Thermo Fisher | 12301D | |
| Dynabeads M-280 atreptavidin | Thermo Fisher | 60210 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Hybridization oven | SciGene | ||
| Tube shaker and rotator | Thermo Fisher | 415110Q | |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303 | |
| SSC buffer 20× concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 |
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