Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Anpassning av hybridisering fånga av kromatin-associerade proteiner för proteomik för att däggdjursceller

doi: 10.3791/57140 Published: June 1, 2018

Summary

Detta är en metod för att identifiera nya DNA-interagera proteiner vid specifika loci, förlitar sig på sekvens-specifika tillfångatagandet av tvärbunden kromatin för efterföljande proteomiska analyser. Det krävs inga förkunskaper om potentiella bindande proteiner eller cell ändringar. Ursprungligen utvecklades för jäst, har tekniken nu anpassats för däggdjursceller.

Abstract

Hybridisering tillfångatagandet av kromatin-associerade proteiner för proteomik (HyCCAPP) teknik utvecklades ursprungligen för att avslöja nya DNA-protein interaktioner i jäst. Det tillåter analys av en målregionen sevärdheter utan behov av förkunskaper om sannolikt proteiner bunden till målregionen. Detta, i teorin, tillåter HyCCAPP att användas för att analysera någon genomisk region av intresse, och det ger tillräcklig flexibilitet för att arbeta i olika cellsystem. Denna metod är inte tänkt att studera bindningsställen av kända transkriptionsfaktorer, en uppgift som bättre lämpade för kromatin Immunoprecipitation (ChIP) och ChIP-liknande metoder. HyCCAPP styrka ligger i dess förmåga att utforska DNA-regioner för vilka det finns begränsad eller ingen kunskap om proteinerna bunden till den. Det kan också vara en bekväm metod för att undvika fördomar (närvarande i ChIP-liknande metoder) infördes genom protein-baserade kromatin berikning med hjälp av antikroppar. Potentiellt, kan HyCCAPP vara ett kraftfullt verktyg för att avslöja verkligen roman DNA-protein interaktioner. Hittills har tekniken använts huvudsakligen jästceller eller hög kopia upprepa sekvenser i däggdjursceller. För att bli den kraftfulla verktyg som vi föreställer oss, måste HyCCAPP strategier optimeras för att effektivt fånga singel-kopia loci i däggdjursceller. Här presenterar vi vår anpassning av inledande jäst HyCCAPP capture protokoll till mänskliga cellinjer och visa att singel-kopia kromatin regioner kan isoleras effektivt med detta modifierade protokoll.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Under det senaste decenniet har det sett en dramatisk förbättring i sekvensering teknik, möjliggör studiet av ett brett utbud av arvsmassan i stort antal prover, och med häpnadsväckande upplösning. Encyklopedi av DNA element (koda) konsortiet, en storskalig flera institutionella insats i spetsen av den nationella Human Genome Research Institute av National Institutes of Health, har gett insikter i hur enskilda transkriptionsfaktorer och andra reglerande proteiner binder till och interagera med genomet. Den inledande insatsen kännetecknas specifika DNA-protein interaktioner, enligt bedömning av kromatin immunoprecipitation (ChIP) för över 100 kända DNA-bindande proteiner1. Alternativa metoder såsom DNAS Footprints2 och formaldehyd assisterad isolering av reglerande element (FAIRE)3 har också använts för att hitta specifika regioner i genomet interagerar med proteiner, men med den uppenbara begränsningen som dessa experimentella metoder identifierar inte de samverkande proteinerna. Trots de omfattande ansträngningarna de senaste åren, har ingen teknik framkommit att effektivt tillåter omfattande karakterisering av protein-DNA interaktioner i kromatin, och identifiering och kvantifiering av kromatin-associerade proteiner.

För att bemöta detta behov, har vi utvecklat en ny metod som vi kallas som Hybridization Capture of Chromatin-Associated proteiner för proteomik (HyCCAPP). 5,6, strategin från början utvecklades i jäst4,och isolerar tvärbundna kromatin regioner av intresse (med bundna proteiner) med sekvens-specifika hybridisering capture. Efter isolering av de protein-DNA-komplex, kan metoder såsom masspektrometri användas att karakterisera uppsättningen proteiner bunden till sekvensen av intresse. HyCCAPP kan således betraktas som en icke-partisk inställning till avslöja nya DNA-protein interaktioner, i den meningen att det inte bygger på antikroppar och det är helt agnostiker om de proteiner som kan hittas. Det finns andra metoder som kan avslöja roman DNA-interagera proteiner7, men mest beroende av ChIP-liknande metoder8,9,10, plasmid infogningar11,12, 13,14, eller regioner med hög kopia nummer15. Däremot HyCCAPP kan tillämpas på multi - och single-kopia regioner, och det kräver inte någon förhandsinformation om proteinerna i regionen. Dessutom, medan några av metoderna som nämns ovan har värdefulla funktioner, särskilt undvika behovet för DNA-protein crosslinking reaktioner, det unika med HyCCAPP är att det kan tillämpas på singel-kopia regioner i omodifierade celler, och utan någon förkunskaper om förmodad bindande proteiner eller tillgängliga antikroppar.

Vid denna punkt, HyCCAPP har huvudsakligen använts för analysen av olika genomisk regioner i jäst4,5,6, och användes nyligen till att analysera protein-DNA interaktioner i alpha-satellit DNA, en upprepad region i den mänskliga arvsmassa16. Som en del av vårt pågående arbete, har vi anpassat metoden hybridisering fånga ursprungligen utvecklades för jäst kromatin tillämpas på analysen av mänskliga celler och presenterar här ett modifierat protokoll som tillåter selektiv fångst av singel-kopieringsmål regioner i det mänskliga genomet med effektivitetsvinster liknar våra inledande studier i jäst. Detta nya optimerade protokoll tillåter nu anpassning och utnyttjande av teknik för att förhöra protein-DNA-interaktion över det mänskliga genomet, med hjälp av masspektrometri eller andra analytiska metoder.

Det är viktigt att understryka att metoden HyCCAPP är avsedd för analys av specifika målregionerna och ännu inte är lämplig för genome-wide analyser. Tekniken är särskilt användbart när det gäller regioner där det finns knappa information om samverkande proteiner, eller när en mer omfattande fördjupad analys av samverkande proteiner på en specifik genomet locus önskas. HyCCAPP är tänkt att avslöja DNA-bindande proteiner men inte kännetecknar exakt de specifika protein bindningsställen i genomisk DNA. I det nuvarande genomförandet ger metoden inte information om DNA-bindning sekvenser eller motiv för enskilda proteiner. Därför det fint kompletterar befintlig teknik såsom FAIRE, och tillåta identifiering av romanen bindande proteiner i genomisk regioner identifieras genom en inledande FAIRE-analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. fånga oligonukleotiden Design

  1. Designa en panel av oligonukleotider användas under hybridisering insamlingen av mål region/s.
    1. Syfta till att utforma 4 – 8 oligonukleotider per målregionen, men som ett minimum, design minst en oligonukleotid inriktning varje ände av målregionen.
    2. Om sekvensen målet är lång (> 500 baspar), design av oligonukleotider som utspridda som möjligt för att säkerställa effektiv anrikning av kromatin över regionen hela målet.
      Obs: Vi har observerat optimal fångar med 4 – 8 oligonukleotider. Även om denna process kan fungera väl med mer oligonukleotider, är det inte ovanligt att iaktta en minskning av anrikning avkastning när alltför många oligonukleotider används.
  2. Utforma oligonukleotider med liknande smälttemperaturer och se till att de inte bildar starka hårnålar eller har interaktioner (med hänsyn till att hybridizations kommer att genomföras på 42 ᵒC).
    Obs: Om ett fotfäste eluering väljs (4.12.3), en extra extern 8 bas sekvens måste läggas till oligonukleotiden och kommer att kräva kompletterande 'release' oligonukleotider vid tidpunkten för den eluering17. Flera kommersiella programverktyg kan användas för att markera och analysera oligonukleotider. 25 mers har visat goda resultat, men beroende på genomet storlek och sekvens, fånga oligonukleotider innehålla någonstans mellan 20-80 baser. Vanligtvis fånga oligonukleotider har en smälttemperatur nära 62 ᵒC, men som kan ändras beroende på deras längd. Konsekvent smälttemperaturer eller oligonukleotiden längd i hela capture mixen kan bidra till att undvika oönskade fördomar i anrikning.
  3. Design de fånga oligonukleotider med en biotin biexponentiellt (helst åtskilda av en spacer från sekvensen capture) i 3'-änden.

2. cellkultur

  1. Odla mänskliga lymfoblastoida celler (till exempel GM12878 visas här) eller andra cellinjer i RPMI 1640 media kompletteras med 1% penicillin-streptomycin, 2 mM L-glutamin och 5% fetalt bovint serum (FBS), på 37 ᵒC och 5% CO2.
    1. Utsäde inledande frysta portioner (2 – 5 x 105 celler) i en T-25 kolv med 6 mL RPMI 1640 media förberedd i 2.1.
    2. Övervaka cell densiteten och livskraft.
      1. Ta en representativ delmängd av celler och färga dem med ett lämpligt färgämne såsom trypan blå.
      2. Mäta cell densiteten med hjälp av en hemocytometer eller en automatiserad cell räknare.
    3. Innan cellen når täthet på 1 x 106 celler/mL, snurra cellerna ner vid 100 x g i 5 min och överföra cellerna till en T-75 kolv med 25 mL RPMI 1640 media förberedd i 2.1. Växer cellerna tills cell densiteten närmar sig 1 x 106 celler/mL.
    4. Överföra cellerna till en t-150 kolv i 38 mL RPMI 1640 media (2.1) och odla cellerna ytterligare två dagar.
      Obs: Lymfoblastoida celler växer i suspension. Allmänna riktlinjer för växande lymfoblastoida celler rekommenderar cell tätheter hållas mellan 0,2 – 1 x 106 celler/mL. På grund av den stora mängden material som krävs i denna teknik, är detta protokoll avsiktligt skriven att växa celler till en cell densiteten bortom vad används ofta. Cell tillväxt protokoll kan revideras och anpassas av läsaren beroende på de celltyper användas.
    5. Snurra cellerna ner vid 100 x g i 5 min, resuspendera cellerna i 10 mL RPMI 1640 media (2.1) och häll suspensionen i en 850 cm2 roller flaska innehåller 500 mL av media. Inkubera cellerna på samma villkor som före men på denna punkt börjar använda konstant rotation (~0.5 rpm).
    6. Övervaka celltillväxten och ändra media när det behövs (vanligtvis varje 3-4 dagar). Låt cellerna växa till densitet så nära som möjligt till 2 x 106 celler/mL (1 x 109 celler totalt).
    7. När det önska celltalet nås, skörda cellerna genom att snurra cellerna ner vid 100 x g i 5 min och resuspendera cellerna i 36 mL RPMI 1640 media (2,1). Överföra cellsuspensionen till en 50 mL konisk tub. Ta små portioner för cell räknar och DNA-extraktion.
  2. Crosslink genom att tillsätta 1 mL 37% formaldehyd att nå en slutlig koncentration av 1%.
    FÖRSIKTIGHET: Formaldehyd är cancerframkallande och bör hanteras i dragskåp.
    1. Inkubera cellerna med rotation (~ 30 – 60 rpm) under 10 minuter vid rumstemperatur (RT).
    2. Släcka crosslink reaktionen genom att lägga till 2 mL av en 2,5 M glycin lösning, för en slutlig koncentration på 125 mM.
    3. Inkubera cellerna med rotation (~ 30 – 60 rpm) för 5 min på RT. Pellet cellerna genom centrifugering vid 100 x g i 5 min och tvätta cellerna två gånger med is kallt 1 x PBS.
  3. Fortsätta till nästa steg eller återsuspendera pelleten i 5 mL Cell lyseringsbuffert (5 mM Hepes, 85 mM KCl, 0,5% Igepal, proteashämmare (PI)) och snapin-frysa suspensionen droppvis i flytande kväve. Lagra proverna på-80 ᵒC.
    Obs: Förbereda > 25 mL lyseringsbuffert Cell utan Igepal och PI och lägga till dessa reagenser färska när du är redo att använda. Undvik långtidsförvaring av Cell lyseringsbuffert när Igepal och PI har lagts till. Lagra Cell lyseringsbuffert på 4 ᵒC för upp till 3 månader. Igepal är en icke-jonaktivt, icke-denatureringen rengöringsmedel. NP-40 kan potentiellt användas som ett alternativ till Igepal men vi har inte använt det i detta sammanhang som NP-40 inte rekommenderas när prover analyseras så småningom av masspektrometri att karakterisera de DNA-bindande proteinerna.

3. Lys och klippning

  1. Förbereda > 15 mL atomkärnor lyseringsbuffert (10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8,0, 1% SDS, PI).
    Lägg Till PI färska, bara för att de belopp som skall användas. Undvik långtidsförvaring av atomkärnor lyseringsbuffert när PI har lagts till. Atomkärnor lysisbuffert kan lagras på RT för upp till 1 månad.
  2. Återsuspendera pelleten i 20 mL Cell lyseringsbuffert (innehållande Igepal och PI). Låt pellets Tina på is och blanda väl en gång tinade. Låt prov sitta för en ytterligare 10 min på is. Centrifugera cellerna vid 400 x g vid 4 ᵒC för 5 min.
  3. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 6 mL lyseringsbuffert atomkärnor med PI (volym kan ökas om cellerna inte utgör en suspension).
  4. Förberedelse för ultraljudsbehandling, dela upp provet jämnt i ~ 6 – 8 microfuge rör (600 till 1000 µL för varje tub).
    1. Placera proverna på is eller en kall rack och Sonikera provet med en någon sonikator med en microtip. Använda 65% amplitud med 5 x 20 s konstant skurar, så att suspensionen svalna för minst 40 s mellan pulser.
      Obs: Om volymerna ökar > 10 mL per prov, ett glas kylning cell kan användas i stället. Fler och längre skurar skulle krävas då. Sonicators skiljer sig mycket. Villkor kan behöva optimeras av läsaren. Andra ultraljudsbehandling alternativ kan användas också.
  5. Centrifugera cellerna vid 12 000 x g under 10 minuter vid 4 ᵒC, överför supernatanten till en ny tub och kassera pellets.
  6. Beräkna total återställning med en fluorometric metod.
  7. Fortsätta till nästa steg eller snapin-frysa och lagra provet vid-80 ᵒC.
  8. Valfritt: Ta en delmängd, omvänd antipyridinantikropp genom inkubation det över natten på 67 ᵒC i 0.3 M NaCl. Rena DNA och köra det i Bioanalyzer att bestämma fragment längder. Huvuddelen av fragment bör vara mellan 500 och 1 000 bp.
    Obs: Det är OK att stoppa på denna punkt och lagra proverna på-80 ᵒC.

4. hybridisering Capture

  1. Bereda 500 mL 2 x hybridisering (Hyb) buffert (200 mM MES, 2 M NaCl, 40 mM EDTA, 0,02% Tween-20) och 500 mL tvättbuffert (200 mM NaCl, 0,2% SDS, 50 mM Tris pH 8). Lagra Hyb och tvätta buffertar på 4 ᵒC och rumstemperatur, respektive, för upp till 3 månader. Använd hälften av 2 x Hyb bufferten för att förbereda en 1 x hybridisering buffert. Även lagra den på 4 ᵒC för upp till 3 månader.
    Obs: Den totala volymen av hybridisering fångst blir två gånger volymen av resulterande provet i föregående steg (som beskrivits hittills, provvolymen skulle vara omkring 6 mL och därmed den totala hybridisering volymen skulle vara 12 mL).
  2. Avsätta pärlor motsvarar 5% av den totala hybridisering fånga volymen (600 µL i detta fall). En lämplig och passande magnet som behövs för att arbeta med pärlor i följande steg.
  3. Tvätta pärlorna tre gånger med 1 x Hyb buffert med dubbelt pärlor volymen (1200 µL). Återsuspendera pärlorna i 1 200 µL av 2 x Hyb buffert. Placera rören på magneten tills lösningen försvinner och avlägsna bufferten.
  4. Utföra före röjningen reaktioner i 1,5 mL microfuge rör med högst 700 µL prov per rör. Lägga till nog pärlor (5%) och 2 x Hyb buffert att späda Hyb bufferten till 1 x (10 tuber med 600 µL prov, 120 µL av tvättade pärlor resuspended i 2 x Hyb buffert och 480 µL av 2 x Hyb buffert). Inkubera i 10 min vid 31 ᵒC med slutet dem över slutet rotation (~ 30 – 60 rpm).
  5. Placera rören på en magnet tills pärlor är orörlig och överföra proverna till nya rör. Kassera pärlorna.
    Obs: Från denna punkt framåt, låg-bindande rör rekommenderas.
  6. Omsuspendera de fånga oligonukleotider till en fungerande lösning på 10 pmol/µL och tillsätt 4 µL av denna lösning till varje rör.
    Obs: Olika regioner kan fungera som kontroll för varandra, men det rekommenderas att inkludera en capture oligonukleotiden med dess sekvens kodade att fungera som en sann negativ kontroll.
  7. Inkubera rören för 40 min på 42 ᵒC med slutet över slutet rotation (~ 30 – 60 rpm).
  8. Under inkubationstiden, avsätta pärlorna behövs (0,3 µL/pmol av capture oligonukleotiden). Tvätta pärlorna tre gånger enligt steg 4,3, men resuspendera cellerna i 1 x Hyb buffert.
  9. Tillsätt tvättade pärlorna och inkubera proverna för 30 min vid RT med slutet över slutet rotation (~ 30 – 60 rpm). Placera rören på magneten och avlägsna supernatanten när pärlorna har varit orörlig.
  10. Tvätta pärlor
    1. Tillsätt 1,2 mL av tvättlösning och inkubera provet för 5 min med slutet över slutet rotation (~ 30 – 60 rpm) på RT. plats rör på magnet och vänta ett par min tills lösningen klarnar. Ta bort bufferten och upprepa detta.
    2. Tillsätt 1,2 mL av tvättlösning och inkubera det för 1 h med slutet över slutet rotation (~ 30-60 rpm) på RT. Placera rören på magneten och vänta ett par min tills lösningen Clear. Ta bort bufferten och upprepa detta minska inkubationstiden till 30 min andra gången.
    3. Tillsätt 200 µL tvättlösning och inkubera det 15 min med slutet över slutet rotation (~ 30 – 60 rpm) på 31 ᵒC. Placera rören på magneten och vänta ett par min tills lösningen Clear. Ta bort bufferten.
    4. Tillsätt 200 µL av PBS och inkubera i 5 min med slutet det över slutet rotation (~ 30 – 60 rpm) på RT. Placera rören på magneten och vänta ett par min tills lösningen Clear. Ta bort bufferten och upprepa detta.
  11. Enkla eluering
    1. Tillsätt 40 µL vatten för molekylär användning i pärlor och inkubera det vid 94 ᵒC för 5 min.
    2. Placera rören på magneten och vänta ett par minuter tills lösningen försvinner.
    3. Över supernatanten till en ny tub. Kassera pärlorna.
    4. Gå vidare till proteomiska analysen eller förvara provet vid-80 ᵒC.
      Obs: Denna typ av eluering fungerar väl för senare qPCR-analys och vissa proteomik mätningar, men i andra fall två alternativa metoder beskrivs nedan avkastning ”renare” eluat.
  12. DNAS eluering.
    1. Tillsätt 40 µL 1 x DNAS buffert och 2 U av DNAS i varje rör.
    2. Inkubera rören under 15 minuter vid 37 ᵒC.
    3. Placera rören på en magnet och vänta ett par min tills lösningen försvinner.
    4. Ta bort de eluerade proverna från pärlor och placera proverna i en ny låg-bindande tub.
    5. Inkubera röret på 94 ᵒC för 7 min inaktivera enzymet och gå vidare till proteomiska analyser.
      Obs: Lägre DNAS koncentrationer kan användas om störningar med proteomiska analyser observeras. Det kommer inte vara möjligt att beräkna de fånga rikedomar av qPCR om eluering metoden används eftersom DNAS behandling helt förstör DNA material i provet.
    6. Gå vidare till proteomiska analys eller förvara provet vid-80 ᵒC.
  13. Fotfäste eluering17.
    Obs: Den här metoden rekommenderas inte för längre oligonukleotider (> 40 baser). Denna metod kräver för att fånga oligonukleotider till innehåller en ytterligare 8 grunder som inte överlappar med genomiska sekvensen och kompletterande release oligonukleotider för att förskjuta målet från de fånga oligonukleotider.
    1. Späd 2 nanomol av release oligonukleotider i 40 µL av SSC buffert.
    2. Inkubera det i 20 min på RT.
    3. Placera rören på en magnet och vänta ett par minuter tills lösningen försvinner.
    4. Ta bort lösningen från pärlorna.
    5. Gå vidare till proteomiska analys eller förvara provet vid-80 ᵒC.

5. utvärdering av fånga avkastning av qPCR med Primers för Target Capture intresseområdet

  1. Använd en lämplig programvara eller online verktyg för att designa primers och sonder för målregionen.
    Obs: I detta experiment riktade promotor regionen av DUSP3 och DUSP5 . De primers och sonder används är följande. DUSP3: Primer 1 - GTG TTT AGG TTC CCT GAT CC, primer 2 - CGG AAT GTC TGC CTT CG, FAM-märkt sond - TCC ATG CCC GAA TTG TGA CGT CGG; DUSP5: Primer 1 - TGA GAA AGC CCT GAT GTG TC, primer 2 - GCC TTC AGA AAC CCC AAA AG, FAM-märkt sonden TGC ATT TAG AGC AGC CAG ATG AGG TT.
  2. Ta en alikvot av eluatet (högst 10 µL), och späd 1:10 med molekylärbiologisk kvalitet H2O.
  3. Extrahera DNA från en av de alikvoter som tas i steg 2.1.7 och använda det DNA-provet för att göra en standardkurva genom att göra fem serial 1:10 utspädningar i molekylär klass H2O.
  4. Förbereda en qPCR master mix (en mängd olika kommersiella alternativ), lägga till primers och sonder och fördela lämpligt belopp (15 µL om kör en 20 µL reaktion) i varje brunn.
  5. Tillsätt 5 µL av antingen: a) utspätt prov, b) den standardkurva eller c) molekylärbiologisk kvalitet H2O (för att tjäna som ingen mall kontroll) till varje brunn.
  6. Försegla plattan och centrifugera det 100 x g för 1 min.
  7. Kör i en qPCR-system med följande parametrar: 5 min vid 95 ᵒC följt av 40 cykler av 95 ᵒC för 20 s, 59 ᵒC för 20 s och 72 ᵒC för 25 s.
  8. Använda standardkurvan åsnor avkastning och kodade fånga för att bedöma fånga specificitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

På grund av behovet av ingående mängder av kromatin för HyCCAPP att lyckas, odlas celler för relativt höga nivåer av konfluens. Trypan blå färgning används för att bekräfta att cellen dödstalen är måttlig (< 10%). I enstaka kopia experiment, kromatin innehåll före hybridisering fånga måste vara i intervallet femtomolar, som vanligtvis kräver minst 109 celler som utgångsmaterial. Före full skala experiment rekommenderas att testa fånga oligonukleotiden prestanda i mindre batchar. Hybridisering fångar med hjälp av en titrering av oligonukleotider visas i figur 1. Antalet fånga oligonukleotider ökas gradvis medan den totala koncentrationen förblir konstant. Detta experiment visar tydligt tre viktiga aspekter. Först, det hjälper för att avgöra, för särskilt regionen, hur många oligonukleotider behövs för att nå optimal (och maximal) hybridisering effektivitet. För det andra, det avslöjar om det finns några uppenbara skadliga interaktioner mellan en viss uppsättning oligonukleotider. Slutligen, det visar om det finns någon oligonukleotider med dålig specificitet som transporterar stora mängder bakgrund (i detta fall mätt av qPCR-analys med inriktning på andra regioner i genomet).

Fånga hybridisering avkastningarna visas blygsamma tvärbunden pågrund av kromatin provet. En stor del av fragment i tvärbundna kromatinet kan inte mottaglig för hybridisering capture. Seriell hybridisering experiment påvisa detta (figur 2). Om att hybridisering fånga är kört, kommer att en efterföljande fånga experiment av samma kromatin material med hjälp av en annan uppsättning fånga oligonukleotider resultera i jämförbara (något lägre) avkastning än när man använder färska kromatin (~ 11% lägre på genomsnitt). Men om samma region är målinriktad igen med samma uppsättning oligonukleotider i en andra fånga experiment med hjälp av kromatin prov kvar efter första tillfångatagandet experimentera, avkastningen kommer att minska ca 90%, vilket bekräftar att de flesta av de hybridisering-mottaglig material har fångats. Om sådan en minskning i capture inte iakttas efter efterföljande fångar med samma uppsättning oligonukleotider, visar det ett tekniskt problem i hybridisering fånga steg.

I enkla system som jäst, har vi observerat fånga effektivitetsvinster närmar sig 4%5, vilket ledde till identifiering av 9 proteiner differentially berikad i 2 regioner när jäst odlades under olika förhållanden. I mänskliga celler dock är med en arvsmassa ~ 250 gånger större än jäst, hybridisering avkastning vanligtvis under 1% (figur 3). Som figur 3 visar, kanske en enda experiment ger otillräckliga mängder för proteomik analyser. I så fall måste flera tagna prover poolas för att utföra en efterföljande masspektrometri. Lägre koncentrationer av fångade mål regionen kromatin kan alternativt användas för riktad analys metoder såsom western blotting och mass spectrometry-baserade vald biverkning övervakning analyser.

Figure 1
Figur 1: Box plot representation av capture oligonukleotiden titrering. Öka antalet fånga oligonukleotider testades och analyseras med qPCR. Bakgrunden är qPCR analyser inriktning andra regioner i genomet. Värden presenteras som vik förändring från hybridisering fånga med hjälp av en enda oligonukleotiden. Whiskers representerar de lägsta och högsta värden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Box plot representation av seriell fångar. Sekventiell hybridisering fångar med samma uppsättning oligonukleotider (Patsy) visar en stark nedgång i anrikning jämfört med sekventiell hybridisering fångar med annan oligonukleotider (Kristoffer) (p = 3,88 e-5). Berikning mäts av qPCR och värdena visas i förhållande till fångar använder färska kromatin. Whiskers representerar de lägsta och högsta värden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: hybridisering fånga använda människaceller. Hybridisering fånga av regioner som ligger i olika kromosomer. Varje region fungerar som en negativ kontroll för den andra. Dessutom utförs en hybridisering fånga med den kodade (Scr)-sekvensen som en sann negativ kontroll. Felstaplar representera standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den HyCCAPP metod som beskrivs här har många unika funktioner som gör det en kraftfull metod att avslöja DNA-interaktioner som annars skulle förbli svårfångade. Processen ger HyCCAPP flexibiliteten att arbeta i olika organismer och regioner i genomet. Det är en metod, men som har flera begränsningar beaktas.

HyCCAPP är en metod som undviker ändringar cellen så att den kan potentiellt tillämpas i primära celler, kultur cellsystem eller ens vävnadsprover. På grund av detta, men kräver det prover vara tvärbunden, vilket minskar känsligheten i proteomiska analysen och kräver därför stora ingående belopp. Det finns nya metoder som förlitar sig på CRISPR och biotinylation av omgivande proteiner som kan fungera utan crosslinking reaktioner12,13,14,18. Dessa metoder kan vara mycket kraftfullt om plasmiden infogningar representerar inte en begränsning, men kan bara användas i cellen kultur system. Andra metoder är mycket väl lämpade att identifiera allmänna protein föreningar baserat på en kromatin stat eller förekomsten av en viss transkriptionsfaktorer, men är inte avsedda att studera enskilda loci9,10,19 .

Metoden HyCCAPP presenterar en alternativ strategi med breda tillämplighet, men det är sannolikt att program i olika cellsystem eller organismer kräver optimering. Det mest kritiska optimering steget i metoden innebär utformning och val av capture oligonukleotider. En rad småskaliga tester bör visa om de designade oligonukleotider är lämplig och om sekvensen i regionen effektivt fångas. I området i närheten finns det flera faktorer som bör beaktas vid utformning och testning av capture oligonukleotider, såsom oligonukleotiden längd, grad av specificitet till målregionen och interaktioner bland uppsättningen oligonukleotider användas. Alla dessa interaktioner kan lätt testas genom att använda en specifik qPCR-analys att målregionen. Om så önskas, kan ett ChIP-Seq-liknande arbetsflöde användas att sekvensera de resulterande DNA-fragment och försäkra att specificiteten av berikning är tillfredsställande över hela genomet5.

Slutligen, tvärbindande villkoren är också mycket viktigt i förfarandet för HyCCAPP, och vi har observerat märkbara skillnader mellan olika system, att få bästa resultat i mänskliga celler av cross-linking med 1% formaldehyd, medan i jäst, cross-linking med 3% formaldehyd givit fler reproducerbara resultat. Det är möjligt att mer intensiv bryggbindningen med 3% formaldehyd i mänskliga celler med en mer komplex kromatinstruktur inte ger tillräcklig tillgänglighet för hybridisering fånga oligonukleotider. Det är också tänkbart att förekomsten av en cellvägg i jäst hindrar formaldehyd tillträdet till cellerna, öka mängden av formaldehyd som behövs för lyckad crosslinking nivåer i kromatinet.

Utför ChIP och andra fånga tillvägagångssätt inriktning tvärbundna mänskliga kromatin, har vi observerat att endast ca 1% av mål-DNA faktiskt kan fångas. För de flesta DNA-baserade metoder och analyser är detta inte en begränsande faktor. Men till skillnad från ChIP, där den slutliga avläsningen är baserad på amplifiable DNA, bygger HyCCAPP på proteinhalt för den slutliga avläsningen. På grund av denna inneboende begränsning, krävs stora mängder insatsmaterial (odlade celler i experiment presenteras här): detta begränsa bör övervägas noga innan du utforskar denna metod, speciellt när de appliceras till singel-kopia regioner. Inte alla system kommer att kunna producera antalet celler som behövs, eller kostnaden för växande krävs cell nummer kan vara oöverkomliga. De ingående belopp att HyCCAPP kräver (~ 109 celler) är jämförbar med andra metoder som förlitar sig på tvärbundet material med ingående belopp mellan 108 och 1011 celler9,11,15. Framtida ändringar i den HyCCAPP tekniken kommer att undersöka metoder för att artificiellt öka kopia nummer Regionkommittén mål att göra denna metod mer allmänt tillämplig. På samma gång, kommer att vi arbeta för att fortsätta öka den övergripande effektiviteten i processen som tillsammans med kontinuerliga framsteg inom masspektrometri ska minska de ingående belopp behövs och göra denna teknik genomförbart i fler system.

Biotinylation baserat tillvägagångssätt använder CRISPR, som enCHiP18 och andra har13,14, visat sig vara mycket effektiv genom att eliminera behovet av tvärbundet material, öka avkastningen och avsevärt minska input krav. Genomarbetade bearbetning av celler i dessa metoder men tillåter inte dessa metoder tillämpas på vävnadsprover, en riktning som vi har börjat driva med HyCCAPP, och som ger lovande resultat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Det finns inga intressekonflikter avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete fick stöd av NIH Grants P50HG004952 och R01GM109099 till MO.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PrimerQuest tool IDT
OligoAnalyzer 3.1 IDT Analyze capture oligonucleotids
PairFold UBC Analyze interactions
RPMI 1640 media Thermo Fisher 11875093
Penicillin-streptomycin Thermo Fisher 15140122
L-Glutamine  Thermo Fisher 25030081
Fetal bovine serum Thermo Fisher 26140079
Countess automated cell counter Thermo Fisher
850 cm2 roller bottle  Greiner Bio-one 680058
Roller system Wheaton 22-288-525
37 % formaldehyde  Sigma-Aldrich F8775
Glycine Sigma-Aldrich
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I3021
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P4380
HEPES Thermo Fisher 15630080
Branson digital sonifier SFX 150 Emerson
Qubit 3.0 fluorometer Thermo Fisher
Qubit dsDNA BR assay kit Thermo Fisher Q32850
Bioanalyzer 2100 Agilent
Agilent DNA 1000 kit Agilent 5067-1504
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
NaCl 5M Thermo Fisher AM9760G
EDTA Sigma-Aldrich
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher 12321D
DynaMag-15 magnet Thermo Fisher 12301D
Dynabeads M-280 atreptavidin Thermo Fisher 60210
Low binding tubes Eppendorf 22431081
Hybridization oven SciGene
Tube shaker and rotator Thermo Fisher 415110Q
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303
SSC buffer 20× concentrate Sigma-Aldrich S6639

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, (7414), 57-74 (2013).
  2. Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 5, (9), 3157-3170 (1978).
  3. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7, (2), 256-267 (2012).
  4. Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins. Anal. Chem. 89, (15), 7841-7846 (2017).
  5. Guillen-Ahlers, H., et al. HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Genomics. 107, (6), (2016).
  6. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae. J Proteome Res. 13, (8), 3810-3825 (2014).
  7. Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins. Physiol Genomics. 46, (13), 441-447 (2014).
  8. Lambert, J. -P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. Defining the budding yeast chromatin-associated interactome. Mol Syst Biol. 6, 448 (2010).
  9. Soldi, M., Bonaldi, T. The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components. Mol Cell Proteomics. 12, (3), 764-780 (2013).
  10. Wang, C. I., et al. Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila. Nat Struct Mol Biol. 20, (2), 202-209 (2013).
  11. Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus. Cell Rep. 2, (1), 198-205 (2012).
  12. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR. Biochem. Bioph. Res. Co. 439, (1), 132-136 (2013).
  13. Liu, X., et al. In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9. Cell. 170, (5), 1028-1043 (2017).
  14. Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells. bioRxiv. (2017).
  15. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, (1), 175-186 (2009).
  16. Buxton, K. E., et al. Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 16, (9), 3433-3442 (2017).
  17. Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. Multiplexed programmable release of captured DNA. Chembiochem. 15, (16), 2353-2356 (2014).
  18. Fujita, T., Fujii, H. Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Chromatin Protoc. Third Ed. 43-52 (2015).
  19. Lambert, J. -P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks. Mol Cell Proteomics. 8, (4), 870-882 (2009).
Anpassning av hybridisering fånga av kromatin-associerade proteiner för proteomik för att däggdjursceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K., Perumalla, D. S., Montoya, M. J., Jadhav, A. Y. L., Shortreed, M. R., Smith, L. M., Olivier, M. Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57140, doi:10.3791/57140 (2018).More

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K., Perumalla, D. S., Montoya, M. J., Jadhav, A. Y. L., Shortreed, M. R., Smith, L. M., Olivier, M. Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57140, doi:10.3791/57140 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter