Summary
यहां, हम संयंत्र के विकास के व्यवहार और विशेष रूप से एक प्रतिलिपि तरीके से phenotypes अध्ययन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम कैसे चर प्रदान करने के लिए और एक ही समय में स्थिर प्रकाश शर्तों पर दिखाते हैं । उचित विश्लेषण पर्याप्त नमूना संख्या और वैध सांख्यिकीय मूल्यांकन पर निर्भर करते हैं ।
Abstract
संयंत्र जीव अक्सर अपने चुने हुए प्रजातियों के विकास के व्यवहार का निरीक्षण करने की जरूरत है । इस अंत करने के लिए, पौधों की जरूरत है निरंतर पर्यावरण और स्थिर प्रकाश की स्थिति है, जो अधिमानतः चर रहे है मात्रा और गुणवत्ता में इतनी है कि अध्ययन के तहत विभिंन setups आयोजित किया जा सकता है । इन आवश्यकताओं जलवायु प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) रोशनी, जो कर सकते है-फ्लोरोसेंट रोशनी के विपरीत में विशेषता कक्षों से मुलाकात कर रहे है-अलग तरंग दैर्ध्य के लिए सेट हो । एल ई डी ऊर्जा संरक्षण और प्रकाश तीव्रता, जो अक्सर अंय प्रकाश स्रोतों के साथ एक समस्या का गठन पर भी लगभग कोई गर्मी उत्सर्जन कर रहे हैं । प्रस्तुत प्रोटोकॉल कैसे एक जलवायु चर एलईडी रोशनी से सुसज्जित कक्ष कार्यक्रम के लिए एक कदम दर कदम मार्गदर्शन प्रदान करता है के रूप में अच्छी तरह के रूप में विकास phenotypes के गहराई विश्लेषण में के लिए कई दृष्टिकोण का वर्णन । प्रायोगिक तौर पर स्थापित पौधों की विभिंन विशेषताओं के आधार पर देखा और विश्लेषण किया जा सकता है । यहां हम वर्णन कैसे ताजा वजन, पत्ती क्षेत्र, संश्लेषक गतिविधि, और stomatal घनत्व निर्धारित करने के लिए । हम प्रदर्शित करते है कि आदेश में विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने और वैध निष्कर्ष यह सांख्यिकीय मूल्यांकन के लिए व्यक्तियों की एक पर्याप्त संख्या का उपयोग करना अनिवार्य है आकर्षित करने के लिए । उच्च सांख्यिकीय त्रुटियों में विश्लेषण परिणामों के इस प्रकार के लिए भी कुछ पौधों को ले जा रहा है और फलस्वरूप डेटा की कम स्पष्ट व्याख्याओं में ।
Introduction
Arabidopsis थालियाना अधिक से अधिक दो दशकों के लिए आणविक युग के संयंत्र शोधकर्ताओं के लिए मॉडल जीव किया गया है । कई विशेषताओं ब्रेसिका परिवार के इस छोटे प्रतिनिधि आनुवंशिक और आणविक अध्ययन के लिए एक आदर्श उंमीदवार बनाने: यह केवल पांच गुणसूत्रों के साथ एक अपेक्षाकृत छोटे जीनोम है (24 गुणसूत्रों के साथ निकोटियाना tabacum जैसे की तुलना में) और इसके जीनोम को पूरी तरह २०००१में अनुक्रम किया गया. ए थालियाना आसानी से आनुवंशिक रूप से एग्रोबेक्टीरियम संक्रमण2 द्वारा संशोधित किया जा सकता है और यहां तक कि CRISPR/कैस3के रूप में नवीनतम आनुवंशिक उपकरणों के लिए उत्तरदाई है । हालांकि छोटे, विकास चक्र काफी तेजी से जैव रासायनिक प्रयोगों संभव बनाने के लिए जहां सामग्री की एक उच्च राशि की जरूरत है । पौधों या मिट्टी पर आगर प्लेटें बढ़ने और भी तरल संस्कृतियों4के रूप में खेती की जा सकती है । Arabidopsis जलवायु नियंत्रित अलमारी में उगाया जा सकता है, Percival से उदा , जलवायु कक्षों में या ग्रीनहाउस में । करने के लिए वृद्धि व्यवहार की तुलना और म्यूटेंट के phenotypes विश्लेषण यह प्रतिलिपि प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है और एक ही समय में लचीला विकास की स्थिति5में सक्षम हो । वैज्ञानिक समस्या यह है कि एक अलग तापमान और लगातार प्रकाश की स्थिति की जरूरत हो सकती है पर निर्भर करता है, विविध प्रकाश तीव्रता या एक ही तापमान पर अलग प्रकाश गुण । प्रकाश संयंत्र विकास में एक बहुत ही महत्वपूर्ण पैरामीटर है और इसके प्रभाव अक्सर विविध दृष्टिकोण में अध्ययन किया जाता है6. प्राप्त आंकड़ों की reproducibility और तुलना सुनिश्चित करने के लिए यह एक स्थिर उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है और प्रकाश स्रोतों की एक ही तरह लागू होते हैं ।
ग्रीनहाउस और जलवायु कक्षों में हमेशा की तरह प्रकाश स्रोतों सोडियम वाष्प या फ्लोरोसेंट लैंप, जो संतोषजनक संयंत्र विकास को बढ़ावा देने के कई नुकसान है से मिलकर बनता है । सबसे पहले, वे समय है जो न केवल तीव्रता में, लेकिन गुणवत्ता में (अपनी टिप्पणियों) वर्णक्रमीय उत्पादन परिवर्तन पर उंर । हालांकि, केवल तीव्रता आमतौर पर लगातार इतनी नजर रखी है कि प्रकाश की गुणवत्ता में परिवर्तन का ध्यान नहीं जा सकता है लेकिन अभी भी महत्वपूर्ण प्रभाव है । दूसरा, लैंप के दोनों प्रकार के उच्च प्रकाश तीव्रता, जो खुद को संयंत्र विकास पर गहरा शारीरिक प्रभाव है और किसी भी प्रकाश निर्भर प्रभाव मुखौटा हो सकता है पर गर्मी उत्पंन करते हैं । तीसरा, इन प्रकाश स्रोतों के वर्णक्रमीय उत्पादन चर रहा है और काफी प्राकृतिक सूरज की रोशनी के विपरीत7। इन सभी खामियों को दूर किया गया है एल ई डी के मामले में)8,9,10,11. वे मुश्किल से उत्सर्जन में किसी भी परिवर्तन के साथ एक लंबे जीवनकाल है, बहुत उच्च प्रकाश तीव्रता पर भी बर्बाद गर्मी का उत्पादन नहीं है और वे बहुत अपने वर्णक्रमीय उत्पादन के विषय में लचीला कर रहे हैं ।
यहाँ हम वर्णन कैसे एक जलवायु चैंबर लाल, नीले, और सफेद प्रकाश के लिए अलग एलईडी रोशनी की विशेषता स्थापित करने के लिए और समय के साथ संयंत्र के विकास के विभिन्न मापदंडों का पालन करें । हम ताजा वजन, पत्ती क्षेत्र, stomata घनत्व, और संश्लेषक प्रदर्शन को मापने । एक ही समय में, हम ठीक से सांख्यिकीय मूल्यांकन की स्थापना के महत्व को प्रदर्शित करता है ।
Protocol
इस प्रोटोकॉल कैसे ए. थालियाना संयंत्रों के विकास के व्यवहार का विश्लेषण करने के कुछ उदाहरण शामिल हैं ।
1. तैयारी
- शुरू करने से पहले, एक सावधान योजना बनाने के लिए कितने पौधों के प्रयोगों का एक विश्वसनीय सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए की जरूरत होगी और फिर बर्तन की उचित मात्रा में तैयार करते हैं ।
नोट: हमेशा संभावना है कि कुछ बीज अंकुरित नहीं हो सकता है के लिए अनुमति देते हैं । - एक ही सामांय पर्यावरण की स्थिति (सामग्री तालिका) के तहत संयंत्र के विकास की तुलना करने के लिए विभिंन व्यक्तिगत प्रोग्राम एलईडी स्तर के साथ एक जलवायु चैंबर का प्रयोग करें ।
2. संयंत्र विकास और एलईडी लाइट्स के सेट अप
- उपयुक्त संख्या तैयार (विभिंन स्थितियों और/म्यूटेंट के आधार पर विश्लेषण किया जा करने के लिए) 6 x 7 मुख्यमंत्री बर्तन मिट्टी के साथ और उनमें से प्रत्येक में एक बीज संयंत्र ।
नोट: इस मामले में, ३६ संयंत्रों के प्रति शर्तों बोया गया था । - 4 डिग्री सेल्सियस पर दो दिनों के लिए Vernalize ।
- रिश्तेदार हवा आर्द्रता सेट करने के लिए ६५% और तापमान के लिए 22 ° c/16 h दिन/ २०० µ m/cm2/1की तीव्रता के लिए सभी स्तरों के प्रकाश को समायोजित करें । जलवायु चैंबर के सामने टच स्क्रीन के माध्यम से एक कार्यक्रम में संबंधित मूल्यों में प्रवेश करके ऐसा करते हैं । चार अलग प्रकाश गुणों की तुलना करने के लिए 1 तालिका में प्रदान के रूप में निम्नलिखित मापदंडों के लिए एल ई डी सेट.
| Identifyier | ३९५ एनएम [%] | ४४० एनएम [%] | 3 K [%] | ६६० एनएम [%] | ७७० एनएम [%] |
| धूप" | १०० | 11 | १०० | 15 | १०० |
| लाल और नीला (आरबी) | १०० | 15 | 25 | 10 | १०० |
| नीला (B) | १०० | 15 | 25 | 2 | 25 |
| लाल (नि.) | ९० | 2 | 25 | 10 | १०० |
तालिका 1: एल ई डी से उत्सर्जित प्रकाश तीव्रता की रचना
- वर्णक्रमीय उत्पादन लगातार मॉनिटर, एक निर्मित में नपेed स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके उदा.
- विभिंन स्तरों पर जलवायु चैंबर में पौधों प्लेस और उंहें एक पारदर्शी शीर्ष के साथ कवर जब तक अच्छी तरह से विकसित cotyledons दिखाई दे रहे हैं । सुनिश्चित करें कि पौधों को पर्याप्त मात्रा में पानी है ।
- मॉनिटर और दस्तावेज़ पौधों आंख और photographically द्वारा के रूप में अक्सर के रूप में उपयुक्त, कितनी तेजी से पौधों को चुना शर्तों के तहत बढ़ने पर निर्भर करता है, हर दो दिन उदा । कैमरा और सभी चित्रों के लिए वस्तुओं और इस तरह की तुलना सक्षम के बीच बराबर दूरी सुनिश्चित करने के लिए कैमरे के लिए एक तिपाई का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें । जब उचित हो स्केल पट्टी का उपयोग करें ।
नोट: शब्द दास (बुवाई के दिनों के बाद) vernalization सहित बीज के वास्तविक रोपण को संदर्भित करता है ।
3. PSII उपज का निर्धारण
- एक पल्स-संग्राहक fluorimeter का उपयोग करें । संयंत्र से एक उचित दूरी पर कैमरा सिर की स्थापना की है ताकि पूरा rosette लाइव विंडो पर देखा जा सकता है ।
- सॉफ्टवेयर शुरू करने पर एक "इकाई चुनें" विंडो प्रकट होता है । टिक "मिनी" और फिर "ठीक है." अगले पॉप-अप विंडो में रंग "नीला" चुनें. क्लिक करें "ठीक है."
नोट: पल्स-संग्राहक प्रतिदीप्ति को मापने प्रकाश स्वचालित रूप से चालू है । मॉनिटर पर, छवि विंडो दिखाई देता है प्रतिदीप्ति पैरामीटर Ft । कैमरे के नीचे रखे एक पौधे को अब नारंगी रंग की छवि के रूप में देखा जा सकता है । - छवि और/या संयंत्र के विशिष्ट क्षेत्रों का चयन ध्यान केंद्रित करने के लिए, "लाइव वीडियो" बॉक्स टिक और उद्देश्य लेंस के समायोजन अंगूठी बारी से लाइव वीडियो के लिए स्विच । ऊपरी दाएँ कोने में बाहर निकलें बॉक्स पर क्लिक करके लाइव वीडियो विंडो से बाहर निकलें ।
- संश्लेषक मापदंडों को मापने के लिए, ब्याज (AOI) के क्षेत्र को परिभाषित करें । इस के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग का उपयोग करें, जो एक वृत्त है जो स्वचालित रूप से स्क्रीन के बीच में प्रकट होता है । इसके बगल में लाल बॉक्स AOI के भीतर सभी पिक्सल के औसत फुट मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है । सही फलक पर AOI बॉक्स से चुनकर उपयुक्त AOI को परिभाषित करें, जहां विभिंन प्रपत्र उपलब्ध हैं । AOI टैब में "add" पर क्लिक करें और सर्कल को पत्ती क्षेत्र के भीतर रखें । पत्ती प्रति पांच बार दोहराएं ।
- निर्माता (तालिका 2) द्वारा प्रदत्त डिफ़ॉल्ट मानों पर सेटिंग्स (दाईं ओर स्थित टैब) को बनाए रखें ।
| रहत. हल् | int. | आवृत्ति | |
| 1 | 1 | ||
| अधिनियम. प्रकाश | int. | चौड़ाई | |
| 8 | 0 | ||
| छवि सुधार | मिनी | ||
| छवि परिवर्तन | बैटरी | ||
| 16.7 v | |||
| हासिल | 5 | ||
| गलन | 1 | ||
| सैट पल्स | int. | नहीं | अंतराल s |
| 8 | 1 | 30 | |
| धीमी प्रेरण | लंब s | घड़ी एस | कालावधी s |
| ४० | 20 | ३१५ | |
| Absortivity | लाल लाभ | लाल तीव्रता | NIR तीव्रता |
| ३४० | 25 | 13 | |
| प्रदर्शन | रंग | ||
| पुनश्च सीमा | ५० | ||
| Inh । Ref. AOI | 1 | ||
| एफएम फैक्टर (टिक) | १,०३० |
तालिका 2: पाम माप के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के रूप में निर्माता द्वारा प्रदान की गई ।
- फ्लोरोसेंट शमन विश्लेषण (संतृप्ति पल्स) द्वारा संश्लेषक मापदंडों का एक माप प्रदर्शन करने के लिए एक संतृप्त प्रकाश फ्लैश लागू करें । इससे पहले, एक अंधेरे अनुकूलित संयंत्र की न्यूनतम और अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति उपज को मापने के द्वारा शमन गुणांक का निर्धारण । इस अंत करने के लिए, अंधेरे में संयंत्र जगह (एक दराज या अंधेरे बॉक्स मेंउदा ) कुछ मिनट के लिए । फिर कैमरे के सिर के नीचे संयंत्र जगह, बक्से उपाय और मिलीलीटर की जांच (प्रकाश को मापने), नीचे पंक्ति में छवि चुनें "Fv/एफएम" सर्कल में घड़ी, और क्लिक करें फो, एफएम स्क्रीन के तल पर ।
नोट: फो/एफएम एक अंधेरे अनुकूलित संयंत्र की PSII उपज का प्रतिनिधित्व करता है । इस प्रकार, यह मूल्य है जो प्रकाश लागू करने के बाद माप सामान्यीकृत है । नया रिकॉर्ड सक्रिय होने तक वर्तमान फो/Fm माप रहेगा । सभी एफ और एफएम ' मूल्यों संतृप्ति दालों से निर्धारित करने के लिए संबंधित है/एफएम और शमन मापदंडों तदनुसार गणना कर रहे हैं । - इन परिणामों को रिपोर्ट टैब में ढूँढें और उन सभी बक्सों को दाएँ हाथ की ओर जाँचें जो प्रयोग (उदाके लिए प्रासंगिक हैं. Y (II), qP, qN, आदि।
- परिणामों को किसी विश्लेषण सॉफ़्टवेयर उदामें निर्यात करें । ऊपरी बाएँ कोने में निर्यात बटन पर क्लिक करके और उचित फ़ाइल नाम के तहत सहेजें द्वारा एक्सेल । एक पत्ती के अनुसार और एक ही संयंत्र के कई पत्तियों को मापने के लिए कम से कम पांच AOIs उत्पन्न (शीघ्र ही अंधेरे एक माप के बाद फिर से संयंत्र अनुकूलित करने के लिए मत भूलना), के रूप में अच्छी तरह से एक शर्त है, जो तो सांख्यिकीय मूल्यांकन किया जा सकता से कई पौधों के रूप में.
- सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए सभी AOIs से मतलब मूल्यों और मानक विचलन उत्पन्न और सभी समय अंक के लिए कम से कम तीन स्वतंत्र संयंत्रों/और एक छात्र के टी परीक्षण करने के लिए मूल्यांकन अगर डेटा महत्वपूर्ण हैं12. p-मान ०.०५ से नीचे हैं, जब डेटा काफी भिन्न के रूप में मूल्यांकित होते हैं ।
4. Stomata घनत्व का निर्धारण
- तीन पूरी तरह से विस्तारित rosette एक गिलास पेट्री पकवान में ७०% इथेनॉल में शर्त प्रति तीन व्यक्ति पौधों से पत्तियों और क्लोरोफिल निकालने के लिए ले लीजिए । कमरे के तापमान पर इस विलायक में रात भर मशीन या 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
- pigments से पूर्ण निकासी के लिए, chloral हाइड्रेट समाधान में मशीन (chloral हाइड्रेट: जल: ग्लिसरॉल = 8:2: 1 w/वी/जब तक पत्तियों पूरी तरह से सफेद दिखाई देते हैं ।
- 40X आवर्धन पर abaxial सतह के अंतर हस्तक्षेप माइक्रोस्कोपी (उद्योग) छवियां ले लो । विजन के क्षेत्र में stomata की गणना करें और एक्सट्रपलेशन स्केल बार की मदद से stomata प्रति एमएम की ² ष्टि से करें । इस कार्यविधि को प्रति शर्तों के लिए ंयूनतम 4 पत्तियों के लिए दोहराएं । एक शर्त के सभी पत्तियों के लिए माध्य मान परिकलित करके और इस माध्य त्रुटि की गणना करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें ।
5. ताजे वजन का निर्धारण
- एक उस्तरा ब्लेड के साथ शर्त प्रति छह पौधों से rosettes से डंठल सहित सभी पत्तियों को हटा दें । सभी पत्तियों तुरंत तौलना और ऊपर वर्णित के रूप में सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए डेटा विषय ।
6. Rosette लीफ एरिया का निर्धारण
- पत्ती क्षेत्र रेखांकन का विश्लेषण करने के लिए शर्त प्रति आठ पौधों से चित्रों का उपयोग करें । एक ही छवि में एक शर्त के लिए चित्रों का मिश्रण है और *. jpeg या *. tiff के रूप में सहेजें ।
- उपयुक्त सॉफ्टवेयर (सामग्री तालिका) डाउनलोड करें ।
नोट: यह, ज़ाहिर है, संभव है इस कार्य को करने में सक्षम किसी अंय प्रोग्राम को लागू करने के लिए । - कोई छवि फ़ाइल खोलें । उपकरण चुनें "मुक्त हाथ चयन." एक rosette के डंठल सहित पत्तियों को घेरना । पर क्लिक करें "विश्लेषण-सेट माप" और चेक "क्षेत्र," "न्यूनतम और अधिकतम ग्रे मूल्य," "एकीकृत घनत्व," और "मतलब ग्रे मूल्य." उपयुक्त दशमलव स्थान चुनें, सर्वश्रेष्ठ दो या तीन है और "ठीक" क्लिक करें ।
- पिक्सेल के बजाय mm2 को प्राप्त करने के लिए "सेट स्केल" आदेश का उपयोग करें । एक लाइन चयन है कि एक ज्ञात दूरी के लिए संगत है, उदा छोड़ व्यास है कि छवियों के पैमाने पर पट्टी से गणना करने के लिए आसान है, तो सेट पैमाने पर संवाद खोलने और इस निर्धारित दूरी और दर्ज करें की इकाई के लिए सीधी लाइन चयन उपकरण लागू करें माप. फिर "विश्लेषण" और क्लिक करने के लिए वापस जाओ "उपाय."
- एक नई विंडो "परिणाम" जो वर्तमान rosette के लिए प्रासंगिक डेटा शामिल है हकदार दिखाई देता है । छवि में सभी संयंत्रों के साथ इस प्रक्रिया को दोहराने और Ctrl + एम के साथ हर नए संयंत्र के लिए क्षेत्र माप शुरू ।
नोट: के लिए छोटे पौधों के साथ गैर अतिव्यापी पत्तियों "छड़ी उपकरण" प्रक्रिया आसान और तेजी से बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । पत्तियों के रूप में जल्द ही एक दूसरे को कवर शुरू, इस उपकरण विश्वसनीय परिणाम नहीं देता है । - वैकल्पिक रूप से, सभी पत्तियों में कटौती और उन्हें एक तरीका है कि एक सिंहावलोकन तस्वीर लिया जा सकता है और फिर छड़ी उपकरण का उपयोग में स्थिति । ध्यान में रखना है कि जब इस विधि का उपयोग कर, अधिक पौधों की जरूरत है ।
- चुनें "फ़ाइल"-"के रूप में सहेजें" परिणाम विंडो में और एक उपयुक्त फ़ाइल नाम और कंप्यूटर निर्देशिका में एक स्थान उत्पंन करते हैं । फ़ाइल स्वचालित रूप से Excel स्वरूप में सहेजी जाएगी ।
7. आरएनए की तैयारी
- हर हालत के लिए दस व्यक्तिगत पौधों से तीन नमूनों की कटाई । निकालें कुल आरएनए निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक संयंत्र आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर । आरएनए एकाग्रता, पवित्रता का निर्धारण, और अखंडता एक विश्लेषक का उपयोग करके. आरएनए तो RNASeq13 उदा द्वारा qRT-पीसीआर या जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के रूप में बहाव अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Representative Results
अवलोकन और संयंत्र के विकास और विशेष रूप से उत्परिवर्ती पौधों से phenotypes के विश्लेषण स्थिर और प्रतिलिपि पर्यावरण की स्थिति पर निर्भर करते हैं । इन जलवायु कक्षों में प्रदान किया जा सकता है । प्रकाश मात्रा और विशेष रूप से गुणवत्ता गंभीर कार्यरत प्रकाश स्रोत है, जो इस अध्ययन में एलईडी लाइट्स द्वारा प्रदान की गई थी पर निर्भर करता है ।
चित्रा 1 एक जलवायु एलईडी पैनलों से सुसज्जित चैंबर का एक उदाहरण से पता चलता है । चित्र 1a नियंत्रण कक्ष का एक स्क्रीनशॉट दिखाता है जहां सभी जलवायु और हल्की स्थितियां समायोजित की जा सकती हैं । 24 घंटे के भीतर बीस अलग समय फ्रेम सेट किया जा सकता है । इस उदाहरण में, 16 प्रकाश/8 एच डार्क के साथ लंबे दिन की स्थिति क्रमादेशित किया गया है । यह कक्ष चार स्तरों जो अलग-अलग क्रमादेशित किया जा सकता है कि चार विभिंन प्रकाश सेटिंग्स में संयंत्र विकास बिल्कुल एक ही पर्यावरण की स्थिति के तहत अध्ययन किया जा सकता है सुविधाएं । ऊपरी बाएँ स्तर के रूप में ज्यादा के रूप में तकनीकी रूप से संभव सूरज की रोशनी में नकल उतारने एक वर्णक्रमीय उत्पादन के लिए सेट है, ऊपरी सही स्तर कम सफेद प्रकाश (3K) के साथ ऊंचा लाल (६६० एनएम) और नीले प्रकाश (४४० एनएम) का प्रतिनिधित्व करता है । बाएं निचले स्तर को ऊंचा नीला प्रकाश और निचले सही स्तर पर मुख्य रूप से लाल बत्ती के लिए सेट किया गया था । चित्रा 1b एक सिंहावलोकन (मध्य पैनल) और संबंधित ज़ूम-ins (बाहरी छोटे पैनलों) के रूप में अलग सेटिंग्स में एल ई डी दिखाता है । प्रकाश के गुणों में अंतर को आंखों से आसानी से देखा जा सकता है ।
एक इनबिल्ट स्पेक्ट्रोमीटर लगातार उपाय, पर नज़र रखता है, और वर्णक्रमीय उत्पादन समायोजित कर देता है । चित्रा 2 ऊपरी बाएँ स्तर १.१, जो सूर्य प्रकाश की नकल करने के लिए सेट किया गया था से स्पेक्ट्रम से पता चलता है. एक मानक फ्लोरोसेंट रोशनी बल्ब की तुलना में यूवी और नीली बत्ती का हिस्सा बहुत अधिक है7।
चित्रा 3 में सभी चार शर्तों 10, 13, और 17 दिनों से ए. थालियाना पौधों का एक उदाहरण, बुवाई के बाद क्रमशः, चित्रित है । सभी पौधों एक तिपाई पर कैमरा बढ़ते द्वारा एक ही दूरी से फोटो खिंचवाने थे । स्केल बार 1 सेमी का प्रतिनिधित्व करता है । 10 दिनों के बाद, आकार या रंग में ज्यादा अंतर नहीं समझदार हो सकता है, लेकिन 17 दिनों के बाद लाल बत्ती के तहत एक तेज वृद्धि स्पष्ट है । इस दृश्य विश्लेषण के अलावा, कई शारीरिक विश्लेषण प्रदर्शन किया गया ।
चित्रा 4 पाम माप है, जो संश्लेषक क्षमता उदा विश्लेषण के विभिंन चरणों के बाद । चित्रा 4a में लाइव वीडियो के एक स्क्रीनशॉट दिखाया गया है, जो ध्यान में संयंत्र लाने के लिए माप की इष्टतम गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए सेटिंग है. पूरे संयंत्र पर ध्यान केंद्रित करने के बजाय, एक भी एक पत्ती का चयन करने के लिए विश्लेषण कर सकते हैं । चित्रा 4B वास्तविक माप शुरू करने से पहले एक अंधेरे-अनुकूलित संयंत्र के वर्तमान फ्लोरोसेंट उपज फुट दर्शाता है । इस मामले में, ब्याज के पांच परिपत्र क्षेत्रों (AOIs) चुना गया । प्रत्येक AOI के बगल में लाल बक्से में संख्या सीधे संख्यात्मक परिणाम देता है, जिसे किसी तालिका के रूप में भी सहेजा जा सकता है. के लिए संश्लेषक मापदंडों का एक माप आरंभ करने के लिए, एफएम सेट की जरूरत है । यह करने के बाद Ft का एक स्क्रीनशॉट चित्र 4cमें दर्शाया गया है । ध्यान दें कि अब बटन "फो, एफएम" सक्रिय अब और नहीं है । नया माप प्रारंभ करने के लिए, पिछले सामांयीकरण को मिटाने के लिए "नया रिकॉर्ड" को क्लिक करने की आवश्यकता है । अंत में, चित्रा 4d से पता चलता है प्रभावी PSII क्वांटम यील्ड Y (द्वितीय) एक संतृप्त प्रकाश पल्स देने के बाद ("सैट-पल्स") । अनुकरणीय डेटा का ठहराव चित्रा 5में दिखाया गया है । २०० µ m/cm2//1 (चित्र 5) में सूर्य के नीचे हो पौधों की बुवाई के बाद 12, 21, और 28 दिनों का विश्लेषण किया गया, क्रमशः । हमारे डेटा प्रदर्शित करता है कि PSII उपज पौधों से पत्तियों में काफी अधिक है तीन सप्ताह के लिए 12 दिनों के लिए हो । 28 और 12 दिन के बीच का अंतर अभी भी महत्वपूर्ण है, लेकिन पी मूल्य अधिक है । चित्रा 4Bमें, विभिन्न प्रकाश गुणों से दो सप्ताह के लिए उगाई गई पौधों से PSII पैदावार की तुलना की गई । दिलचस्प है, प्रकाश के तहत स्थाई विकास नीली बत्ती के एक उच्च भाग युक्त PSII की एक काफी अधिक उपज की ओर जाता है । एक समान प्रभाव समृद्ध लाल बत्ती के तहत खेती की पौधों के लिए मनाया गया था, लेकिन वृद्धि थोड़ा कम था ।
stomata विकास14प्रभाव करने के लिए विभिंन प्रकाश गुण दिखाए गए थे । इसलिए stomatal की सघनता से जांच की गई । चित्रा 6 दर्शाता है कैसे वर्णक निष्कर्षण के बाद एक पत्ती लग रहा है । एकल एपिडर्मल कोशिकाओं को अच्छी तरह से प्रतिष्ठित किया जा सकता है, और स्टोमा आसानी से गिना जा सकता है । चित्रा में, व्यक्तिगत stomata एक तारे के द्वारा संकेत कर रहे हैं । विभिन्न प्रकाश सेटिंग्स से पौधों की stomatal घनत्व के बारे में विस्तृत डेटा9कहीं और पाया जा सकता है ।
दृश्य निरीक्षण (चित्रा 3) के अलावा ताजा वजन वृद्धि प्रगति का एक अच्छा उपाय प्रदान करता है । इस उदाहरण में "सूरज की रोशनी" के तहत उगाया पौधों से पत्तियों 8, 10 के बाद, और 12 दिनों के बाद बुवाई, क्रमशः तौला गया । इन आंकड़ों का सांख्यिकीय मूल्यांकन चित्रा 7में देखा जा सकता है । उम्मीद के मुताबिक समय के साथ ताजा वजन बढ़ जाता है ।
ताजे वजन के अलावा, पत्ती क्षेत्र विकास के लिए एक अच्छा उपाय है । यहां पौध विकास 10, 13, और 17 दिनों के बाद बुवाई (figure ८अ) के बाद किया गया । न्यूनतम छह व्यक्तिगत संयंत्रों नियमित रूप से विश्वसनीय सांख्यिकीय डेटा प्राप्त करने के लिए मूल्यांकन किया गया । एक उच्च नमूना आकार के महत्व को प्रदर्शित करने के लिए, माध्य मूल्य का प्रतिशत त्रुटि, दो और छह पौधों का विश्लेषण करने से, क्रमशः परिकलित किया गया था (चित्रा 8B) । इसका मतलब है कि मानक विचलन का अर्थ मूल्य के संबंध में प्रतिशत निर्धारित किया गया था । यह एक छोटे नमूना आकार त्रुटि के मामले में एक उच्च नमूना आकार के मामले में से 5-10% अधिक है कि बहुत स्पष्ट है । पौधों है कि मूल्यांकन कर रहे है की संख्या में वृद्धि करके, त्रुटि कम किया जा सकता है, जो डेटा की व्याख्या बहुत स्पष्ट करता है ।
चित्रा 1: विभिन्न प्रकाश गुण एल ई डी द्वारा प्रदान की जाती हैं. एक) एलईडी चैंबर के नियंत्रण कक्ष से स्क्रीनशॉट । दिन की लंबाई 16 घंटे (ऊपरी दाएँ कोने) के लिए सेट है और प्रकाश की तीव्रता २०० µmol सेमी-2 एस-1करने के लिए सेट किया गया है । प्रकाश की गुणवत्ता के सभी चार स्तरों पर अलग है: १.१ तकनीकी रूप से संभव के रूप में सूरज की रोशनी के समान एक स्पेक्ट्रम का प्रतिनिधित्व करता है, १.२ लाल और नीले तरंग दैर्ध्य (आरबी) प्रकाश का एक उच्च प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है, २.१ मुख्य रूप से नीले (ख), २.२ का प्रतिनिधित्व करता है मुख्यतः लाल प्रकाश (आर) । B) मध्य पैनल सभी स्तरों का ओवरव्यू दिखाता है; बाहरी पैनलों एक उच्च ज़ूम में व्यक्तिगत स्तर दिखाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: नकली सूरज की रोशनी सेटिंग्स से तरंग दैर्ध्य स्पेक्ट्रम । एलईडी चैंबर में इनबिल्ट स्पेक्ट्रोमीटर से एक स्क्रीनशॉट दिखाया गया है, जो स्तर १.१ पर तैनात किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: एक सप्ताह में संयंत्र विकास । प्रतिनिधि ए. थालियाना ने सभी चार प्रकाश शर्तों से 10, 13, और 17 दास से पौधे लगाये । पौधों एक तिपाई पर एक डिजिटल पलटा कैमरा के साथ फोटो खिंचवाने थे । स्केल बार सभी छवियों के लिए 1 सेमी का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: ए. थालियाना संयंत्रों के पाम माप के प्रतिनिधि कदम से स्क्रीनशॉट । "लाइव वीडियो" दृश्य जहां छवि ध्यान समायोजित किया जा सकता है से एक) स्क्रीनशॉट । किसी भी प्रकाश दालों के आवेदन से पहले ख) वर्तमान प्रतिदीप्ति उपज फुट । ग) मौजूदा प्रतिदीप्ति उपज फुट की स्थापना के बाद/PSII क्वांटम उपज एक संतृप्त प्रकाश नाड़ी स्थापित करने के बाद को प्रभावित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5: PSII क्वांटम यील्ड (YII) के चित्रमय प्रतिनिधित्व । A) पौधों से डेटा 12, 21, और बुवाई के बाद 28 दिन और २०० µmol/cm2के तहत हो1 //पाम विश्लेषण के अधीन सूर्य प्रकाश ("सूरज की रोशनी") सांख्यिकीय मूल्यांकन किया गया । दिखाया पांच पौधों और प्रति दिन पांच AOIs का मतलब मान रहे हैं । एक तारांकन दिन 12 की तुलना में p-मान < 0.05 के साथ महत्वपूर्ण अंतर इंगित करता है, और दो तारांकन छात्रों के t-test के अनुसार p-value < 0.02 के साथ बहुत महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं । ख) पौधों से डेटा २०० µmol/सेमी2 //1 के तहत नकली सूरज की रोशनी (SL), समृद्ध नीले (ख) या लाल (नि.) प्रकाश, क्रमशः, सांख्यिकीय मूल्यांकन किया गया । दिखाया पांच पौधों और प्रति दिन पांच AOIs का मतलब मान रहे हैं । "सूर्य की रोशनी" की तुलना में महत्वपूर्ण अंतरों की गणना की गई ।
चित्रा 6: stomata की प्रतिनिधि छवि एक थालियाना पत्ती के abaxial पक्ष में । पत्तियों के रूप में तैयार ऊपर वर्णित है और नेत्रहीन 40X आवर्धन पर उद्योग की रूपरेखा के साथ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत विश्लेषण किया गया । Stomata शर्त के अनुसार कम 4 पत्तियों के दृश्यमान क्षेत्र में गिना जाता है । यह तस्वीर माइक्रोस्कोप tubus से जुड़े एक डिजिटल कैमरे के साथ ली गई थी । प्रति mm ² stomata की संख्या की गणना स्केल बार की मदद से की जाती है । तारे एकल स्टोमा का संकेत देते हैं । स्केल बार २०० µm का प्रतिनिधित्व करता है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 7: ताजा वजनका चित्रमय प्रतिनिधित्व ए. थालियाना नकली सूरज की रोशनी में उगाई पौधों से/2/ Rosette के पत्ते आठ, दस और बारह दिनों की बुआई के बाद पौधों से काटे जाते थे । मतलब मूल्य प्रति दिन छह पौधों से मिलीग्राम में चित्रित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 8: विभिन्न प्रकाश स्थितियों के तहत हो पौधों से ए. थालियाना पत्ती क्षेत्र का सांख्यिकीय मूल्यांकन. a. थालियाना से a) पत्ती क्षेत्र 10, 13, और 17 दिनों के लिए हो रेखांकन ImageJ और n से डेटा के साथ निर्धारित किया गया था = 6 संयंत्रों सांख्यिकीय मूल्यांकन किया गया । प्रत्येक शर्त से सभी छह rosettes से पत्ती क्षेत्र को अभिव्यक्त किया गया था और छह से विभाजित करने के लिए मतलब मूल्य प्राप्त करने के लिए । इस मान के साथ, मानक विचलन की गणना की गई थी, और यह त्रुटि पट्टियों द्वारा प्रस्तुत किया जाता है । ख) पत्ती क्षेत्र रेखांकन ImageJ और या तो n = 2 या n = 6 संयंत्रों, क्रमशः, सांख्यिकीय पैनल के लिए वर्णित के रूप में विश्लेषण किया गया से डेटा के साथ निर्धारित किया गया था । फिर मतलब मूल्य के प्रतिशत में त्रुटि की गणना की और रेखांकन भी चित्रित किया गया था । हरी पट्टियां n = 6, नीली पट्टियों से n = 2 संयंत्रों के विश्लेषण से प्रतिशत त्रुटि दिखाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Discussion
संयंत्र के विकास का अध्ययन करने में पहला कदम वांछित परिस्थितियों के अनुसार जलवायु चैंबर स्थापित कर रहा है । यह आसानी से संबंधित सॉफ्टवेयर (चित्र 1a) के कार्यक्रम मुखौटा में सभी चर टाइपिंग द्वारा किया जाता है । इस चरण में, कई संशोधनों प्रकाश शासन और/या तापमान को बदलने के द्वारा लागू किया जा सकता है । लगातार तापमान, आर्द्रता, और प्रकाश की स्थिति (चित्रा 2) की निगरानी करने के लिए प्रयोग को बर्बाद करने से तकनीकी विफलता को रोकने के लिए सुनिश्चित करें । यह प्रतिलिपि परिणाम प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण बिंदु है । हालांकि इस सेट अप कई चर प्रदान करता है और flexibly समायोजित किया जा सकता है, यह अपनी सीमाएं हैं । वर्तमान में उपलब्ध एलईडी रोशनी सूरज की रोशनी की नकल नहीं कर सकते एक सौ प्रतिशत और एक जलवायु चैंबर के अंदर जलवायु परिस्थितियों पूरी तरह से प्रतिबिंबित क्या नहीं कर सकते है क्या15के बाहर जा रहा है ।
व्यापक रूप से इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट बल्ब एलईडी रोशनी की तुलना में अधिक बहुमुखी हैं, कम ऊर्जा की जरूरत है, और वस्तुतः कोई गर्मी विकिरण दिखाओ । इन लाभों इनडोर खेती के बड़े उद्योग का नेतृत्व किया है के लिए जलवायु मंडलों और ग्रीनहाउस16एल ई डी के साथ सुसज्जित । इस क्षेत्र में सूचना दी विशाल सफलताओं को देखते हुए, एलईडी तकनीक निश्चित रूप से कई और अधिक आवेदन मिल जाएगा ।
जब phenotype देख और विशेष रूप से पत्ती क्षेत्र के निर्धारण के लिए यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि पुराने पौधों में ओवरलैप (चित्रा 3) छोड़ देता है । इस प्रकार, पूरे rosettes के चित्रमय मूल्यांकन के लिए गलत हो जाता है । उस मामले में, यह बहुत अधिक सही करने के लिए बंद सभी पत्तियों में कटौती और वहां से जाना है ।
विकास व्यवहार का मूल्यांकन और विभिन्न स्थितियों के तहत वृद्धि और विकास के विशेष रूप से मतभेद एक पर्याप्त नमूना आकार पर निर्भर करता है. इस अध्ययन में, संश्लेषक उपज (चित्रा 5), ताजा वजन ( चित्रा 7), और पत्ती क्षेत्र (चित्रा ८अ) के निर्धारण के लिए कम से कम छह संयंत्रों का उपयोग किया गया था लेकिन अध्ययन के प्रारंभ में 30 व्यक्तिगत बीजों को लगाया गया ताकि यह सुनिश्चित हो सके यह पहले, पर्याप्त बीज अंकुरित, और दूसरा, "ठेठ" पौधों का एक विकल्प बनाया जा सकता है । यहां तक कि एक ही आबादी के भीतर, यानी सटीक एक ही शर्त के तहत एक ही ट्रे में एकल बर्तन में पौधों, अलग phenotypes दिखाया । यह तो पाठ्यक्रम के सांख्यिकीय विश्लेषण के दौरान मानक विचलन में प्रतिबिंबित है, लेकिन डेटा की व्याख्या आम तौर पर अधिक विश्वसनीय है जब छोटे सांख्यिकीय त्रुटियाँ (चित्रा 8B) मनाया जाता है ।
पाम द्वारा संश्लेषक प्रदर्शन की माप (चित्रा 4, चित्रा 5) कई मापदंडों के लिए किया जा सकता है । इस मामले में, ध्यान PSII उपज पर था Y (द्वितीय) एक उदाहरण के रूप में, लेकिन यह भी गैर-photochemical शमन, विनियमित और गैर विनियमित ऊर्जा अपव्यय या प्रकाश छूट की मात्रा उपज निर्धारित करने के लिए संभव है । यहां महत्वपूर्ण पत्ता सतह के पार समान रूप से वितरित और फिर विभिंन पौधों से कम से कम छह पत्तियों को मापने के प्रति पत्ती का चयन करने के लिए ंयूनतम पांच AOIs है । इस विधि की खामी यह है कि साई पर कोई प्रभाव नहीं पाया जा सकता है; उस प्रयोजन के लिए, विभिंन उपकरणों की जरूरत है ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
F.S. इस अध्ययन के कुछ हिस्सों के माध्यम से Rhenac ग्रीन टेक एजी से समर्थन स्वीकार करता है । जे और बीएसफ ने DFG (SFB TR175) से फंडिंग प्राप्त की ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Climatic chamber equipped with LED panels | Rhenac Green Tec AG | These chambers are custom made. | |
| Spectrometer | OceanOptics | USB-650 | |
| Imaging PAM | Walz | IMAGING-PAM M-Series | There are several suitable models depending on the broader use. |
| Microscope+ 40x objective | Leica | DM1000 | Other companies also produce suitable microscopes. |
| Software ImageJ | Free download from website | ||
| Plant RNA extraction kit | Qiagen | 74903 | |
| Bioanalyser | Agilent | G2939BA | Needs an additional computer |
References
- Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
- An, G., Watson, B. D., Chiang, C. C. Transformation of Tobacco, Tomato, Potato, and Arabidopsis thaliana Using a Binary Ti Vector System. Plant Physiology. 81 (1), 301-305 (1986).
- Schiml, S., Fauser, F., Puchta, H. Chromosome and Genomic Engineering in Plants: Methods and Protocols. Murata, M. , Springer New York. New York, NY. 111-122 (2016).
- Rivero, L., et al. Arabidopsis Protocols. Sanchez-Serrano, J. J., Salinas, J. , Humana Press. Totowa, NJ. 3-25 (2014).
- Ubbens, J. R., Stavness, I. Deep Plant Phenomics: A Deep Learning Platform for Complex Plant Phenotyping Tasks. Frontiers in Plant Science. 8 (1190), (2017).
- Cosgrove, D. J. Rapid Suppression of Growth by Blue Light: OCCURRENCE, TIME COURSE, AND GENERAL CHARACTERISTICS. Plant Physiology. 67 (3), 584-590 (1981).
- Seiler, F., Soll, J., Bölter, B. Comparative Phenotypical and Molecular Analyses of Arabidopsis Grown under Fluorescent and LED Light. Plants. 6 (2), 24 (2017).
- Janda, M., et al. Growth and stress response in Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Glycine max, Solanum tuberosum and Brassica napus cultivated under polychromatic LEDs. Plant Methods. 11 (1), 31 (2015).
- Olle, M., Viršile, A. The effects of light-emitting diode lighting on greenhouse plant growth and quality. Agricultural and food science. 22 (2), 12 (2013).
- Lin, K. -H., et al. The effects of red, blue, and white light-emitting diodes on the growth, development, and edible quality of hydroponically grown lettuce (Lactuca sativa L. var. capitata). Scientia Horticulturae. 150, 86-91 (2013).
- Castronuovo, D., et al. Light spectrum affects growth and gas exchange of common dandelion and purple coneflower seedlings. International Journal of Plant Biology. , (2016).
- Student, THE PROBABLE ERROR OF A MEAN. Biometrika. 6 (1), 1-25 (1908).
- Database, J. S. E. Essentials of Genetics. RNA-Seq. JoVE. , (2017).
- Klermund, C., et al. LLM-Domain B-GATA Transcription Factors Promote Stomatal Development Downstream of Light Signaling Pathways in Arabidopsis thaliana Hypocotyls. The Plant Cell. 28 (3), 646-660 (2016).
- Annunziata, M. G., et al. Getting back to nature: a reality check for experiments in controlled environments. J Exp Bot. 68 (16), 4463-4477 (2017).
- Palus, S. Japan's Massive Indoor Farm Produces 10,000 Heads of Fresh Lettuce Every Day. Smithonian.com. , (2014).
