Her presenterer vi en protokoll for å studere anlegget vekst atferd og spesielt fenotyper i en reproduserbar måte. Viser vi hvordan du gir variabel og på samme tid stabil lysforholdene. Riktig analyser, avhenger av tilstrekkelig utvalg tall og gyldige statistiske evalueringer.
Anlegget biologer trenger ofte å observere atferden vekst av utvalgte arter. Dette trenger planter konstant miljømessige og stabilt lys betingelser som helst variabel i kvantitet og kvalitet slik at studier under forskjellige installasjoner kan utføres. Disse kravene er oppfylt av klimatiske chambers med utslipp dioder (LED) lyser, som kan-i motsetning til lysstoffrør-være satt til forskjellige bølgelengder. Lysene er energi bevaring og avgir nesten ingen varme selv på lett intensitet, som ofte utgjør et problem med andre lyskilder. Presentert protokollen gir en trinnvis veiledning i hvordan program en klimatiske kammer utstyrt med variabel lys samt beskriver flere metoder for grundig analyse av vekst fenotyper. Avhengig av den eksperimentelle set-up kan ulike egenskapene til de voksende anleggene observert og analyseres. Her beskriver vi fastslå frisk vekt, tropene, fotosynteseaktiviteten aktivitet og øverst tetthet. Vi viser at for å få pålitelige data og gyldige konklusjoner er det obligatorisk å bruke et tilstrekkelig antall personer for statistiske evalueringer. Tar for få planter for denne typen analyseresultater høy statistiske feil og dermed i mindre klart tolkninger av dataene.
Arabidopsis thaliana har vært modell organismen for plante forskere av molekylære epoken i mer enn to tiår. Flere egenskaper gjør denne lille representant av Brassica familien en ideell kandidat for genetiske og molekylære studier: det har en relativt liten genomet med bare fem kromosomene (i forhold til f.eks Nicotiana tabacum med 24 kromosomer) og dens Genova var helt sekvensert i 20001. A. thaliana kan endres enkelt genetisk Agrobacterium infeksjon2 og er mottakelig for selv de nyeste genetiske verktøyene som CRISPR/Cas3. Men lite er vekstsyklusen rask nok til å gjøre biokjemiske eksperimenter mulig der en høyere mengde materiale er nødvendig. Plantene vokser på agar plater eller jord og kan også være dyrket som flytende kulturer4. Arabidopsis kan dyrkes i klimatisk kontrollert skap, f.eks fra Percival, klimatiske kamre eller i veksthus. For å kunne sammenligne vekst atferd og analysere fenotyper mutanter er det avgjørende å gi reproduserbare og på samme tid fleksibel vekst forhold5. Avhengig av vitenskapelige problemet sendes kan man trenger forskjellige temperaturer og konstant lys, forskjellige lys intensiteter eller forskjellige kvaliteter ved samme temperatur. Light er en svært kritisk parameter i plantevekst og dens innflytelse er ofte studert i ulike tilnærminger6. Reproduserbarhet og sammenlignbarhet innhentet data er det avgjørende å sikre en stabil produksjon og bruke samme type lyskilder.
Vanlige lyskilder i veksthus og klimatiske chambers består av natrium damp eller lysstoffrør, som fremmer tilfredsstillende plantevekst, men har flere ulemper. Først alder de over tid som endrer spectral utdataene ikke bare i intensitet, men kvalitet (egne observasjoner). Imidlertid overvåkes bare intensiteten vanligvis kontinuerlig slik at en endring i lyskvalitet kan ubemerket, men fortsatt har betydelige effekter. Andre begge typer lamper genererer varme ved høyere lys intensiteter, som selv har en dyp fysiologiske påvirker plantevekst og kan maskere eventuelle avhengige lyseffekt. Tredje er spectral produksjon av disse lyskilder uforanderlig og helt ulikt naturlig sollys7. Alle disse ulempene har blitt overvunnet ved lysdioder)8,9,10,11. De har lang levetid med knapt noen endring i utslipp, produserer ikke avfall varme selv ved svært høy lett intensitet og de er svært fleksibel om spectral produksjonen.
Her viser vi hvordan du setter opp en klimatiske kammer med egen LED-lys for rødt, blått og hvitt lys og følge ulike parametere i plantevekst over tid. Vi måler frisk vekt, tropene, stomata tetthet og fotosynteseaktiviteten ytelse. Samtidig viser vi viktigheten av riktig innfatning opp statistiske evalueringer.
Det første trinnet i å studere plantevekst konfigurerer klimatiske kammeret i henhold til ønsket vilkårene. Dette gjøres enkelt ved å skrive alle variablene i programmet maske av respektive programvaren (figur 1A). På dette trinnet, kan mange endringer implementeres ved å endre lyset regimet og/eller temperatur. Kontroller at du overvåker konstant temperatur, fuktighet og lys (figur 2) hindre teknisk svikt i å ødelegge eksperimentet. Dette er et kritisk punkt for å få reproduserbar resultater. Selv om dette oppsettet tilbyr mange variabler og kan justeres fleksibelt, har sine begrensninger. Tilgjengelig lys kan ikke etterligne sollyset hundre prosent og de klimatiske forholdene i en klimatiske kammer kan aldri helt reflekterer hva som skjer utenfor15.
Sammenlignet med de brukte lysrør LED lys er mer allsidig, trenger mindre energi og vise nesten ingen varme stråling. Disse fordelene har ført den store industrien av innendørs oppdrett å utruste klimatiske kamre og drivhus med lysdioder16. Vurderer store suksesser rapportert i dette feltet LED teknikken vil sikkert finne mange flere programmer.
Når observere fenotypen og spesielt for fastsettelse av blad området er det viktig å ta hensyn forlater som i eldre planter overlapping (Figur 3). Dermed pleier grafisk evaluering av hele rosetter å være upresis. I så fall er det mye mer nøyaktig å kutte av alle bladene og gå derfra.
Vurderingen av vekst atferd og spesielt forskjeller i vekst og utvikling under ulike forhold, avhenger av en tilstrekkelig utvalgsstørrelsen. I denne studien minst seks planter ble brukt for fastsettelse av f.eks fotosynteseaktiviteten avkastning (figur 5), frisk vekt (figur 7), og blad området (figur 8A) men 30 personlige frø ble plantet i begynnelsen av studien å bekrefte at første, nok frø germinate, og andre, et utvalg av “typisk” planter kan gjøres. Selv innenfor samme populasjon, dvs planter i enkelt potter i samme skuffen nøyaktig oppstiller, viste varierende fenotyper. Dette er så selvfølgelig reflektert i standardavviket i statistisk analyse, men tolkningen av data er generelt mer pålitelig når små statistiske feil er observert (figur 8B).
Måling av fotosynteseaktiviteten ytelse av PAM (Figur 4, figur 5) gjøres for flere parametere. I dette tilfellet fokus var på PSII gir Y(II) som et eksempel, men det er mulig å også bestemme f.eks ikke-fotokjemisk slukke, quantum avkastningen regulert og ikke regulert energi ødsling eller lys remisjon. Viktige her er å velge minst fem AOIs per blad jevnt fordelt over blad overflaten og deretter måle minst seks blader fra ulike planter. Ulempen med denne metoden er at eventuelle effekter på PSI ikke kan oppdages; for dette formålet, er annet utstyr nødvendig.
The authors have nothing to disclose.
F.S. anerkjenner støtte fra Rhenac Green Tec AG gjennom deler av denne studien. JS og bb mottatt finansiering fra DFG (SFB TR175).
Climatic chamber equipped with LED panels | Rhenac Green Tec AG | These chambers are custom made. | |
Spectrometer | OceanOptics | USB-650 | |
Imaging PAM | Walz | IMAGING-PAM M-Series | There are several suitable models depending on the broader use. |
Microscope+ 40x objective | Leica | DM1000 | Other companies also produce suitable microscopes. |
Software ImageJ | Free download from website | ||
Plant RNA extraction kit | Qiagen | 74903 | |
Bioanalyser | Agilent | G2939BA | Needs an additional computer |