Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Analyse van Arabidopsis thaliana groei gedrag in verschillende kwaliteiten van het licht

Published: February 2, 2018 doi: 10.3791/57152

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van de plant groei gedrag en vooral fenotypen op een reproduceerbare wijze. Variabele en op de dezelfde tijd stabiel lichtomstandigheden, tonen we hoe te verstrekken. Goede analyses, is afhankelijk van voldoende monster getallen en geldige statistische evaluaties.

Abstract

Biologen van de plant moeten vaak observeren het gedrag van de groei van hun gekozen soort. Te dien einde vergen de installaties constante milieu en stabiel licht omstandigheden, die bij voorkeur variabele in kwantiteit en kwaliteit zijn zodat studies onder verschillende opstellingen kunnen worden uitgevoerd. Deze eisen is voldaan door klimaatkasten met licht emitterende diodes (LED) verlichting, die – in tegenstelling tot TL-verlichting – instelbaar voor verschillende golflengtes. LEDs zijn energie besparen en uitstoten vrijwel geen warmte zelfs bij lichte intensiteiten, hetgeen vaak een probleem met andere lichtbronnen. Het gepresenteerde protocol bevat een stapsgewijze richtlijnen van hoe te programmeren een klimaatkamer uitgerust met variabele LED-verlichting, alsook het beschrijven van verschillende benaderingen voor diepgaande analyse van de groei fenotypen. Afhankelijk van de experimentele opstelling kunnen verschillende kenmerken van de groeiende planten worden in acht genomen en geanalyseerd. Hier beschrijven we hoe u kunt bepalen van vers gewicht, blad gebied fotosynthetische activiteit en stomatal dichtheid. We aantonen dat het verkrijgen van betrouwbare gegevens en geldige conclusies is verplicht een voldoende aantal personen gebruiken voor statistische evaluatie. Te weinig planten voor dit soort analyseresultaten met hoge statistische fouten en dus ook in minder duidelijke interpretaties van de gegevens.

Introduction

Arabidopsis thaliana geweest de modelorganisme voor plant onderzoekers van de moleculaire tijdperk voor meer dan twee decennia. Verschillende kenmerken maken dit kleine vertegenwoordiger van de Brassica-familie een ideale kandidaat voor genetische en moleculaire studies: het heeft een relatief klein genoom met slechts vijf chromosomen (in vergelijking met bijvoorbeeld Nicotiana tabacum met 24 chromosomen) en de genoom was volledig sequenced in 20001. A. thaliana genetisch gemakkelijk kan worden gewijzigd door Agrobacterium infectie2 en is vatbaar voor zelfs de meest recente genetische hulpmiddelen zoals CRISPR/Cas3. Hoewel klein, is de groeicyclus snel genoeg om de biochemische experimenten haalbaar te maken waar een hogere hoeveelheid materiaal nodig is. De planten groeien op agar platen of op de bodem en kunnen zelfs als vloeibare culturen4gekweekt. Arabidopsis kunnen worden geteeld in klimatologisch gecontroleerde kasten, bijvoorbeeld van Percival, in klimaatkasten of in kassen. Om te kunnen vergelijken groei gedrag en analyseren van de fenotypen van mutanten is het van cruciaal belang om reproduceerbare en op de dezelfde tijd flexibel groei voorwaarden5te bieden. Afhankelijk van het wetenschappelijke probleem dat moet worden aangepakt is wellicht een verschillende temperaturen en constante licht omstandigheden, diverse lichte intensiteit of verschillende lichte kwaliteiten bij dezelfde temperatuur. Licht is een zeer belangrijke parameter in de plantengroei en de invloed daarvan is vaak bestudeerd in uiteenlopende benaderingen6. Om reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van de verkregen gegevens te waarborgen is het van cruciaal belang het zelfde soort lichtbronnen van toepassing te waarborgen van een stabiele uitgang.

De gebruikelijke lichtbronnen in kassen en klimaatkasten bestaan uit natrium damp of TL-lampen, die bevorderen bevredigend plantengroei, maar hebben verschillende nadelen. Ten eerste, ze ouder na verloop van tijd dat de spectrale output, niet alleen in intensiteit maar in kwaliteit (eigen opmerkingen verandert). Echter is alleen de intensiteit meestal doorlopend gecontroleerd zodat een wijziging in lichte kwaliteit misschien onopgemerkt maar nog steeds aanzienlijke effecten hebben. Ten tweede, beide soorten lampen warmte genereren bij hogere intensiteiten van licht, die zelf heeft een grote fysiologische invloed op de plantengroei en eventuele afhankelijke lichteffect kan maskeren. Ten derde, de spectrale output van deze lichtbronnen is onveranderlijk en heel anders dan het natuurlijke zonlicht7. Al deze nadelen zijn verholpen in geval van LEDs)8,9,10,11. Ze hebben een lange levensduur met nauwelijks enige verandering in de emissie, produceren geen afvalwarmte zelfs bij zeer hoge licht intensiteiten en ze zijn zeer flexibel betreffende hun spectrale output.

Hier illustreren we hoe een klimaatkamer met afzonderlijke LED-lampjes voor rood, blauw en wit licht instellen en volgen verschillende parameters van plantengroei na verloop van tijd. We meten vers gewicht, blad gebied, stoma dichtheid en fotosynthetische prestaties. Op hetzelfde moment tonen we het belang van het correct opzetten van statistische evaluaties.

Protocol

Dit protocol bevat enkele voorbeelden van hoe te analyseren groei gedrag van A. thaliana planten.

1. voorbereiding

  1. Voordat u begint, maak een zorgvuldige plan op hoeveel planten nodig zal zijn voor het doen van een betrouwbare statistische analyse van de experimenten en vervolgens de juiste hoeveelheid potten worden bereid.
    Opmerking: Is altijd voorzien van de mogelijkheid dat sommige zaden niet kunnen ontkiemen.
  2. Gebruik een klimaatkamer met verschillende individueel programmeerbare LED niveaus te vergelijken van de groei van de planten onder de dezelfde algemene milieuomstandigheden (materialen tabel).

2. planten groei en opzet van de LED-lampjes

  1. Opstellen van het juiste nummer (afhankelijk van verschillende omstandigheden en/of mutanten te analyseren) van 6 x 7 cm potten met bodem en een enkel zaadje plant in elk van hen.
    Opmerking: In dit geval 36 planten per voorwaarden werden ingezaaid.
  2. Vernalize voor twee dagen bij 4 ° C.
  3. Instellen van de relatieve luchtvochtigheid tot 65% en de temperatuur tot 22 ° C/16 ° C voor een dag 16 h / 8 h nacht cyclus. Het licht van alle niveaus tot een intensiteit van 200 µM/cm2/s1aanpassen. Dit doen door de respectieve waarden aangaan van een programma via het scherm van de aanraking aan de voorzijde van de klimaatkamer. Om te vergelijken van vier verschillende lichte kwaliteiten stelt u de LED's op de volgende parameters zoals bepaald in tabel 1.
Identifyier 395 nm [%] 440 nm [%] 3 K [%] 660 nm [%] 770 nm [%]
"sunlight" 100 11 100 15 100
Rood en blauw (RB) 100 15 25 10 100
Blauw (B) 100 15 25 2 25
Red (R) 90 2 25 10 100

Tabel 1: samenstelling van lichte intensiteiten uitgestoten van LEDs

  1. Controleren van de spectrale uitvoer voortdurend, bijvoorbeeld met behulp van een ingebouwde gekalibreerde spectrometer.
  2. Plaats de planten in de klimaatkamer op de verschillende niveaus en houd ze bedekt met een transparante top totdat goed ontwikkelde zaadlobben zichtbaar zijn. Zorg ervoor dat de planten voldoende zijn gedrenkt.
  3. Monitor en document planten door oog en fotografisch zo vaak als nodig, afhankelijk van hoe snel de planten onder de gekozen omstandigheden, bijvoorbeeld om de twee dagen groeien. Zorg ervoor dat het gebruik van een statief voor de camera inschakelen waardoor vergelijkingen te waarborgen van de gelijke afstand tussen camera en objecten voor alle afbeeldingen. Gebruik een schaal bar indien nodig.
    Opmerking: De term DAS (dagen na het zaaien) verwijst naar de werkelijke aanplant van de zaden met inbegrip van vernalisatie.

3. bepaling van het rendement van de PSII

  1. Gebruik een puls-gemoduleerd fluorimeter. Het hoofd van de camera op de juiste afstand van de plant zo instellen dat het volledige rozet te op de live venster zien is.
  2. Bij het starten van de software verschijnt een "select eenheid"-venster. Vink "MINI" en dan "ok." Kies "blauw" in de volgende pop-upvenster. Klik op 'ok'.
    Opmerking: De puls-gemoduleerd fluorescentie meten van licht wordt automatisch ingeschakeld. Op de display verschijnt het afbeeldingsvenster tonen de fluorescentie parameter Ft. Een plant die onder de camera geplaatst kan nu worden gezien als een oranje afbeelding.
  3. Focus van het beeld en/of Kies specifieke regio's van de plant, ga naar Live Video door het vakje "live video" en draai de ring van de aanpassing van het objectief. Sluit het venster van LIVE Video door te klikken op het afsluitvakje in de hogere juiste hoek.
  4. Voor het meten van fotosynthetische parameters, een gebied van belang (AOI) te definiëren. De standaardinstelling hiervoor gebruiken, die is een denkbeeldige cirkel die automatisch wordt weergegeven in het midden van het scherm. Het rode vak ernaast vertegenwoordigt de gemiddelde waarde van de Ft van alle pixels binnen het AOI. Definieer de passende AOI door te kiezen uit het AOI-vak bij het juiste paneel, waar verschillende vormen beschikbaar zijn. Klik op "toevoegen" in het tabblad AOI en plaats van de cirkel binnen het gebied van het blad. Herhaal dit vijf keer per blad.
  5. Het handhaven van de instellingen (tabblad aan de rechterkant) op de standaardwaarden die door de fabrikant (tabel 2).
Tijdseenheid licht Int. Frequentie
1 1
Handelen. Licht Int. Breedte
8 0
Afbeelding correcties MINI
Beeld transformatie Batterij
16.7V
Winst 5
Demping 1
SAT-Pulse Int. No Interval s
8 1 30
Langzame inductie Vertraging s Klok s Duur s
40 20 315
Absortivity Rode winst Rode intensiteit NIR intensiteit
340 25 13
Weergave Kleur
PS Beperken 50
Inh. Ref. AOI 1
FM Factor (tijk) 1030

Tabel 2: standaardinstellingen voor de PAM metingen zoals bepaald door de fabrikant.

  1. Een saturating lichte flitser voor het uitvoeren van een meting van fotosynthetische parameters door tl blussen analyse (verzadiging puls) van toepassing. Daarvoor, het blussen coëfficiënten te bepalen door het meten van het rendement van de minimale en maximale fluorescentie van een dark-adapted plant. Te dien einde, plaatst u de plant in het donker (bijvoorbeeld in een lade of donkere kast) voor een paar minuten. Plaats dan de plant onder de camerakop, schakel de selectievakjes maatregel en ML (het meten van licht), in de rij onder de afbeelding kies "Fv/Fm" door de klokken in de cirkel, en klik op Fo, Fm aan de onderkant van het scherm.
    Opmerking: Fo/Fm vertegenwoordigt het PSII rendement van een dark-adapted plant. Het is dus de waarde waarnaar de meting na het toepassen van licht is genormaliseerd. De huidige Fo/Fm-meting blijft totdat nieuwe Record is geactiveerd. Alle F en Fm' waarden bepaald door intensiteit pulsen zijn gerelateerd aan Fo/Fm en blussen parameters dienovereenkomstig worden berekend.
  2. Deze resultaten in het tabblad rapport zoeken en controleren van alle vakken aan de rechterkant die relevant voor het experiment (BV zijn. Y(II), qP, qN, enz.).
  3. De resultaten exporteren naar een analyse software bv. Excel door te klikken op de knop exporteren in de hogere linkerhoek en opslaan onder de juiste naam. Genereren van ten minste vijf áes per blad en meten van verschillende bladen van dezelfde plant (Vergeet niet te kort donker de plant aan te passen opnieuw na elke meting), evenals verschillende planten uit één voorwaarde, die kan vervolgens worden statistisch geëvalueerd.
  4. Voor statistische analyse genereren gemiddelden en standaardafwijkingen van alle áes en ten minste drie onafhankelijke planten voor alle tijd punten/voorwaarden en het uitvoeren van een student t-test om te beoordelen of de gegevens belangrijke12 zijn. Gegevens worden geëvalueerd als significant verschillend als de p-waarden beneden 0,05 zijn.

4. bepaling van de dichtheid van de stoma

  1. Verzamel drie rozet volledig uitgevouwen bladeren uit drie individuele planten per voorwaarde in 70% ethanol in een glazen petrischaaltje en uitpakken van chlorofyl. Incubeer in dit oplosmiddel 's nachts op kamertemperatuur of bewaren bij 4 ° C.
  2. Voor de volledige afhandeling van pigmenten, incubeer in Chloraalhydraat oplossing (Chloraalhydraat: water: glycerol 8 =: 2: 1 w/v/w) totdat bladeren volledig wit verschijnen.
  3. Neem differentiële interferentie microscopie (DIC) beelden van het abaxial oppervlak op 40 X vergroting. Stoma in het gezichtsveld tellen en extrapoleren met behulp van de schaal bar aan stoma per mm². Herhaal dat deze procedure voor ten minste 4 verlaat per voorwaarden. Statistische analyses uit te voeren door het berekenen van de gemiddelde waarde voor alle bladeren van één voorwaarde en daaruit berekenen de gemiddelde fout.

5. bepaling van vers gewicht

  1. Verwijder alle bladeren, met inbegrip van de bladstelen van rozetten van zes fabrieken per voorwaarde met een scheermesje. Weeg alle bladeren onmiddellijk en de gegevens onderworpen aan statistische analyses zoals hierboven beschreven.

6. bepaling van Rosette blad oppervlak

  1. Afbeeldingen uit acht planten per voorwaarde gebruiken voor het analyseren van het blad gebied grafisch. De foto's voor één voorwaarde in een enkel beeld combineren en opslaan als *.jpeg of * .tiff.
  2. Downloaden van de juiste software (materialen tabel).
    Opmerking: Het is natuurlijk mogelijk toe te passen op alle andere programma's kunnen uitvoeren van deze taak.
  3. Een afbeeldingsbestand openen Kies het gereedschap "vrije handselectie." Omcirkelen bladeren met inbegrip van de blaadjes van een rozet. Klik op "Analyze - set metingen" en "Zone," "Min & Max grijswaarde," controleren "Geïntegreerde dichtheid" en "Gemiddelde grijswaarde." Kies juiste decimale plaatsen, twee of drie het beste is en klik op "ok".
  4. Mm gebruik2 in plaats van pixels de opdracht "set schaal". Toepassing van de lineaire gereedschap om de selectie van een regel die correspondeert met een bekende afstand, bijvoorbeeld de verlof-diameter die gemakkelijk te berekenen van de bar van de schaal van de beelden, dan opent het dialoogvenster schaal instellen en voer deze gedefinieerde afstand en de eenheid van te maken meting. Ga terug naar "analyseren" en klik op "maatregel."
  5. Er verschijnt een nieuw venster getiteld "resultaten", waarin de relevante gegevens voor de huidige rozet. Herhaal deze procedure met alle planten in de afbeelding en initialiseren gebied metingen voor elke nieuwe plant met Ctrl + M.
    Opmerking: Voor kleinere planten met niet-overlappende bladeren de "wand tool" kan worden gebruikt om het proces gemakkelijker en sneller. Zodra de bladeren beginnen die betrekking hebben op elkaar, geeft deze tool geen betrouwbare resultaten.
  6. U kunt ook alle bladeren afgesneden en plaats deze op een manier dat een overzichtsfoto kunnen worden genomen en vervolgens met het gereedschap Toverstaf. Rekening dat wanneer u deze methode gebruikt, meer planten er nodig zijn.
  7. Kies "File"-"Opslaan als" in het resultatenvenster en het genereren van een passende bestandsnaam en een locatie in de directory van de computer. Het bestand zullen automatisch worden opgeslagen in Excel-indeling.

7. bereiding van RNA

  1. Drie monsters van tien afzonderlijke fabrieken voor elke aandoening de oogst. Uittreksel totaal RNA met behulp van een plant RNA extractie kit volgens de instructies van de fabrikant. RNA concentratie, zuiverheid en integriteit bepalen met behulp van een bioanalyzer. RNA kan vervolgens worden gebruikt voor downstream toepassingen zoals qRT-PCR of gen expressie analyse door bijvoorbeeld RNASeq13.

Representative Results

Observatie en analyse van de plantengroei en vooral fenotypes van mutant planten is afhankelijk van stabiele en reproduceerbare milieuomstandigheden. Deze kunnen worden verstrekt in klimaatkasten. Licht hoeveelheid en vooral kwaliteit is kritisch afhankelijk van de werknemer lichtbron, die in deze studie werd verstrekt door LED-verlichting.

Figuur 1 toont een voorbeeld van een klimaatkamer uitgerust met LED-panelen. Figuur 1A toont een schermafbeelding van het bedieningspaneel waar alle klimatologische en lichte voorwaarden kunnen worden aangepast. Binnen 24 uur kan twintig verschillende termijnen worden ingesteld. In dit voorbeeld de voorwaarden van de lange dag met 16 licht/8 h donkere zijn geprogrammeerd. Deze zaal beschikt over vier niveaus die afzonderlijk kunnen worden geprogrammeerd zodat plantengroei op vier verschillende lichtinstellingen kan worden bestudeerd onder precies dezelfde milieu omstandigheden. De linksboven niveau is ingesteld op een spectrale uitgang nabootsen van het zonlicht zoveel technisch mogelijk, de bovenste rechts niveau vertegenwoordigt verheven rode (660 nm) en blauw licht (440 nm) verminderd met wit licht (3K). De linker lager niveau was ingesteld op verhoogde blauw licht en het lagere juiste niveau aan het overwegend rode licht. Figuur 1B illustreert de LED's op de verschillende instellingen een overzicht (middelste deelvenster) en de respectieve zoom-ins (buitenste kleine panelen). Het verschil in licht kwaliteiten kan gemakkelijk worden gezien door het oog.

Een ingebouwde spectrometer voortdurend meet, controleert en past de spectrale output. Figuur 2 toont het spectrum van het bovenste linker niveau 1.1, die was ingesteld om na te bootsen van zonlicht. In vergelijking met een standaard TL lamp is het gedeelte van de UV en blauw licht veel hogere7.

In Figuur 3 een voorbeeld van A. thaliana van planten uit alle vier voorwaarden 10, 13 en 17 dagen, respectievelijk na zaaien wordt afgebeeld. Alle planten werden gefotografeerd vanaf dezelfde afstand door de montage van de camera op een statief. De schaal staaf vertegenwoordigt 1 cm. Na 10 dagen, niet veel verschil in de grootte of de kleur kan worden onderkend, maar na 17 dagen een snellere groei onder rood licht is duidelijk. Naast deze visuele analyse, werden diverse fysiologische analyses uitgevoerd.

Figuur 4 volgt de verschillende stappen van PAM metingen, die bv fotosynthetische capaciteit analyseert. In figuur 4A wordt een screenshot van de live video weergegeven, die de instelling voor het instellen van de fabriek in focus is om optimale kwaliteit van de metingen te waarborgen. In plaats van zich te concentreren op de hele plant, kan men ook kiezen voor een enkel blad om te analyseren. Figuur 4B toont de huidige TL opbrengst Ft van een dark-adapted plant voordat de werkelijke meting werd gestart. In dit geval werden vijf cirkelvormige gebieden van belang (áes) gekozen. De nummers in de rood vakken naast elke AOI geeft direct het numerieke resultaat, die kan ook worden opgeslagen in de vorm van een tabel. Om te beginnen een meting van fotosynthetische parameters Fo, moet Fm stellen. Een screenshot van Ft na dit te doen is afgebeeld in figuur 4C. Merk op dat nu de knop "Fo, Fm" niet meer actief is. Om te beginnen een nieuwe meting, moet "Nieuwe Record" worden geklikt als u wilt wissen van de vorige normalisatie. Ten slotte, Figuur 4 d toont het quantumrendement van de effectieve PSII Y(II) na het geven van een lichte puls in saturating ("SAT-Pulse"). Kwantificering van voorbeeldige gegevens is afgebeeld in Figuur 5. Planten gekweekt in zonlicht 200 µM/cm2/s1 (figuur 5A) werden respectievelijk 12, 21 en 28 dagen na het zaaien, geanalyseerd. Onze gegevens tonen aan dat PSII rendement aanzienlijk hoger in bladeren van planten gekweekt voor drie weken dan voor 12 dagen. Het verschil tussen 28 en 12 dagen is nog steeds aanzienlijk, maar de p-waarde is hoger. In figuur 4B, werden PSII opbrengst van deze planten gekweekt voor twee weken uit verschillende lichte kwaliteiten vergeleken. Interessant, leidt permanente groei onder licht met een hoge deel van het blauwe licht tot een aanzienlijk hoger rendement van PSII. Een soortgelijk effect werd waargenomen voor planten gekweekt onder verrijkt rood licht, maar de verhoging was een beetje lager.

Verschillende lichte kwaliteiten werd aangetoond dat effect stoma ontwikkeling14. Dus werd de stomatal dichtheid onderzocht. Figuur 6 laat zien hoe een blad na extractie van het pigment eruit ziet. Enkele epidermale cellen kunnen worden goed onderscheiden en stoma gemakkelijk kan worden geteld. In de figuur, worden individuele stoma aangeduid met een sterretje. Gedetailleerde gegevens over de stomatal dichtheid van planten uit de verschillende lichte instellingen kunnen worden gevonden elders9.

Naast visuele inspectie (Figuur 3) biedt het verse gewicht een goede maatstaf voor de vooruitgang van de groei. In dit voorbeeld werden de bladeren van planten gekweekt onder "sunlight" na 8, 10 en 12 dagen na het zaaien, respectievelijk, gewogen. Statistische evaluatie van deze gegevens kan worden gezien in Figuur 7. Zoals verwacht, toeneemt het verse gewicht met de tijd.

Naast verse gewicht is het blad gebied een goede maat voor de groei. Hier, werd Plantenontwikkeling gevolgd van 10, 13 en 17 dagen na het zaaien (figuur 8A). Ten minste zes afzonderlijke fabrieken werden regelmatig geëvalueerd om betrouwbare statistische gegevens te verkrijgen. Om aan te tonen het belang van een hoog steekproefgrootte, de fout van het percentage van de gemiddelde waarde van respectievelijk twee en zes planten, analyseren werd berekend (Figuur 8). Dat betekent dat het percentage van de standaarddeviatie ten aanzien van de gemiddelde waarde werd bepaald. Het is heel duidelijk dat de fout in het geval van de grootte van een kleine steekproef 5-10% hoger dan in het geval van een hogere grootte van de steekproef is. Door het verhogen van het aantal planten die worden geëvalueerd, kan de fout worden geminimaliseerd, waardoor de interpretatie van gegevens veel duidelijker.

Figure 1
Figuur 1: verschillende lichte kwaliteiten worden geleverd door LEDs. A) Screenshot vanaf het bedieningspaneel van de LED-kamer. Lengte van de dag is ingesteld op 16 h (rechter bovenhoek) en de lichtsterkte is ingesteld op 200 µmol cm-2 s-1. De lichte kwaliteit verschilt op alle vier niveaus: 1.1 vertegenwoordigt een spectrum zoals gelijkaardig aan het zonlicht als technisch mogelijk, 1.2 vertegenwoordigt een hoog percentage van de rode en blauwe golflengtes (RB) licht, 2.1 ligt voornamelijk aan blauw (B), 2.2 vertegenwoordigt voornamelijk rode licht (R). B) het middelste deelvenster ziet u een overzicht van alle niveaus; de buitenste panelen vertonen een hogere zoom de afzonderlijke niveaus. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: golflengte spectrum van gesimuleerde zonlicht instellingen. Een screenshot van de ingebouwde spectrometer in de LED-zaal wordt getoond, die werd gepositioneerd op niveau 1.1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: ontwikkeling meer dan een week Plant. Representatieve A. thaliana planten uit alle vier de lichte voorwaarden van 10, 13 en 17 DAS. Planten werden gefotografeerd met een digitale reflex camera op een statief. Schaal staaf vertegenwoordigt 1 cm voor alle afbeeldingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Screenshots van representatieve stappen van PAM metingen van A. thaliana planten. A) Screenshot van de "Live video" view waar de focus van de afbeelding kan worden aangepast. B) huidige fluorescentie opbrengst Ft vóór het aanbrengen van een lichte pulsen. C) huidige fluorescentie opbrengst Ft na het instellen van Fo/Fm. D) die PSII quantumrendement na het instellen van een saturating lichte puls. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: grafische weergave van het quantumrendement verrichten van PSII (YII). A) gegevens uit planten 12, 21 en 28 dagen na het zaaien en geteeld onder 200 µmol/cm2/s1 onder gesimuleerde zon licht ("sunlight") onderworpen aan PAM analyse statistisch werden geëvalueerd. Getoond worden de gemiddelde waarden van vijf planten en vijf áes per dag. Een asterisk geeft aan een significant verschil met een p-waarde < 0.05 in vergelijking met dag 12 en twee sterretjes zeer significante verschillen met een p-waarde geven < 0.02 volgens studenten t-test. B) gegevens uit planten gekweekt 200 µmol/cm 2/s1 onder gesimuleerde zonlicht (SL), verrijkt blauw (B) of rode (R) licht, respectievelijk waren statistisch geëvalueerd. Getoond worden de gemiddelde waarden van vijf planten en vijf áes per dag. Significante verschillen werden berekend in vergelijking met "sunlight."

Figure 6
Figuur 6: representatief beeld van stoma aan de abaxial kant van een blad A. thaliana . Bladeren bereid zoals hierboven beschreven en visueel werden geanalyseerd onder een lichte Microscoop met DIC beveiligingsinstellingen 40 X vergroting. Stoma worden meegeteld in het zichtbare gebied van ten minste 4 blaadjes per voorwaarde. De foto is genomen met een digitale camera die is aangesloten op de tubus Microscoop. Het aantal stoma per mm² wordt berekend met behulp van de schaal-bar. Sterren geven een enkele stoma. De schaal staaf vertegenwoordigt 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: grafische weergave van vers gewicht van A. thaliana planten geteeld op gesimuleerd zonlicht/200 µmol/cm2/s1. Rozet bladeren werden gesneden uit planten, acht, tien en twaalf dagen na het zaaien. Gemiddelde waarden in mg uit zes planten per dag worden afgebeeld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8: Statistische evaluatie van A. thaliana blad gebied van planten gekweekt onder verschillende lichtomstandigheden. A) blad gebied van A. thaliana gekweekt voor 10, 13 en 17 dagen werd grafisch bepaald met ImageJ en gegevens van n = 6 planten statistisch werden geëvalueerd. Het blad gebied van alle zes rozetten van elke voorwaarde werd samengevat en gedeeld door zes om de gemiddelde waarde te verkrijgen. Met deze waarde de standaarddeviatie berekend was, en dit is vertegenwoordigd door de foutbalken. B) blad gebied werd grafisch bepaald met ImageJ en gegevens uit beide n = 2 of n = 6 planten, respectievelijk, zijn statistisch geanalyseerd als beschreven voor het deelvenster A. Vervolgens werd de fout in procent van de gemiddelde waarde berekend en grafisch afgebeeld. Groene balken geven de percentage fout uit analyse van n = 6, blauw bars uit n = 2 planten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

De eerste stap bij het bestuderen van de plantengroei is het opzetten van de klimaatkamer volgens de gewenste voorwaarden. Dit gebeurt gemakkelijk door alle variabelen in het programma masker van de respectieve software (figuur 1A) te typen. Bij deze stap kunnen veel wijzigingen worden uitgevoerd door het veranderen van de lichte regeling en/of temperatuur. Zorg ervoor dat voortdurend temperatuur, vochtigheid en lichtomstandigheden (Figuur 2) om te voorkomen dat technische storingen verpest het experiment. Dit is een kritisch punt voor het verkrijgen van reproduceerbare resultaten. Hoewel deze set-up veel variabelen biedt en kan flexibel worden aangepast, heeft het zijn beperkingen. De verkrijgbare LED-lampjes niet kunnen nabootsen het zonlicht een honderd procent en de klimatologische omstandigheden in een klimaatkamer kunnen nooit volledig overeen met what's going on buiten15.

In vergelijking met de gebruikte Toon vrijwel geen warmtestraling, TL-lampen LED lampen zijn veelzijdiger en minder energie nodig. Deze voordelen hebben ertoe geleid dat de grote industrie van indoor landbouw om uit te rusten klimaatkasten en serres met LEDs,16. Gezien de enorme successen gemeld op dit gebied, de LED-techniek vindt zeker veel meer toepassingen.

Wanneer het fenotype observeren en vooral voor de bepaling van het oppervlak van de blad is het belangrijk rekening te houden laat dat in oudere planten overlappen (Figuur 3). Dus, grafische evaluatie van hele rozetten neigt te zijn onnauwkeurig. In dat geval is het veel meer nauwkeurig tot alle bladeren afgesneden en ga vanaf daar.

De evaluatie van het gedrag van de groei en vooral verschillen in groei en ontwikkeling onder verschillende omstandigheden, is afhankelijk van een voldoende grootte van de steekproef. In deze studie, ten minste zes fabrieken werden gebruikt voor de bepaling van bijvoorbeeld fotosynthetische opbrengst (Figuur 5), verse gewicht (Figuur 7), en blad gebied (figuur 8A) maar 30 individuele zaden geplant werden aan het begin van de studie om ervoor te zorgen dat eerste, voldoende zaden ontkiemen, en ten tweede, een keuze van de "typische" planten kan worden gemaakt. Zelfs binnen de dezelfde populatie, dat wil zeggen de planten in enkele potten in de dezelfde lade onder exact dezelfde voorwaarden, toonde verschillende fenotypes. Dit wordt dan natuurlijk weerspiegeld in de standaarddeviatie tijdens statistische analyse, maar de interpretatie van gegevens is over het algemeen betrouwbaarder wanneer kleine statistische fouten worden waargenomen (Figuur 8).

Meting van fotosynthetische performance door PAM (Figuur 4, Figuur 5) kan worden gedaan voor verschillende parameters. In dit geval lag de focus op de opbrengst van de PSII Y(II) als een voorbeeld, maar het is mogelijk om ook bijvoorbeeld niet-fotochemische blussen, het quantumrendement van gereglementeerde en niet-gereglementeerde energie dissipatie of lichte kwijtschelding. Belangrijk hier is om te kiezen van ten minste vijf áes per blad gelijkmatig verdeeld over het oppervlak van het blad en vervolgens meten ten minste zes bladeren van verschillende planten. Het nadeel van deze methode is dat eventuele effecten op PSI niet kunnen worden opgespoord; voor dat doel, is verschillende apparatuur nodig.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

F.S. erkent steun van Rhenac Green Tec AG door delen van deze studie. J.S. en B.B. ontvangen financiering van de DFG (SFB TR175).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Climatic chamber equipped with LED panels Rhenac Green Tec AG These chambers are custom made.
Spectrometer  OceanOptics USB-650
Imaging PAM Walz IMAGING-PAM M-Series There are several suitable models depending on the broader use.
Microscope+ 40x objective Leica  DM1000 Other companies also produce suitable microscopes.
Software ImageJ Free download from website
Plant RNA extraction kit Qiagen 74903
Bioanalyser Agilent G2939BA Needs an additional computer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408, (6814), 796-815 (2000).
  2. An, G., Watson, B. D., Chiang, C. C. Transformation of Tobacco, Tomato, Potato, and Arabidopsis thaliana Using a Binary Ti Vector System. Plant Physiology. 81, (1), 301-305 (1986).
  3. Schiml, S., Fauser, F., Puchta, H. Chromosome and Genomic Engineering in Plants: Methods and Protocols. Murata, M. Springer New York. New York, NY. 111-122 (2016).
  4. Rivero, L., et al. Arabidopsis Protocols. Sanchez-Serrano, J. J., Salinas, J. Humana Press. Totowa, NJ. 3-25 (2014).
  5. Ubbens, J. R., Stavness, I. Deep Plant Phenomics: A Deep Learning Platform for Complex Plant Phenotyping Tasks. Frontiers in Plant Science. 8, (1190), (2017).
  6. Cosgrove, D. J. Rapid Suppression of Growth by Blue Light: OCCURRENCE, TIME COURSE, AND GENERAL CHARACTERISTICS. Plant Physiology. 67, (3), 584-590 (1981).
  7. Seiler, F., Soll, J., Bölter, B. Comparative Phenotypical and Molecular Analyses of Arabidopsis Grown under Fluorescent and LED Light. Plants. 6, (2), 24 (2017).
  8. Janda, M., et al. Growth and stress response in Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Glycine max, Solanum tuberosum and Brassica napus cultivated under polychromatic LEDs. Plant Methods. 11, (1), 31 (2015).
  9. Olle, M., Viršile, A. The effects of light-emitting diode lighting on greenhouse plant growth and quality. Agricultural and food science. 22, (2), 12 (2013).
  10. Lin, K. -H., et al. The effects of red, blue, and white light-emitting diodes on the growth, development, and edible quality of hydroponically grown lettuce (Lactuca sativa L. var. capitata). Scientia Horticulturae. 150, 86-91 (2013).
  11. Castronuovo, D., et al. Light spectrum affects growth and gas exchange of common dandelion and purple coneflower seedlings. International Journal of Plant Biology. (2016).
  12. Student, THE PROBABLE ERROR OF A MEAN. Biometrika. 6, (1), 1-25 (1908).
  13. Database, J. S. E. Essentials of Genetics. RNA-Seq. JoVE. (2017).
  14. Klermund, C., et al. LLM-Domain B-GATA Transcription Factors Promote Stomatal Development Downstream of Light Signaling Pathways in Arabidopsis thaliana Hypocotyls. The Plant Cell. 28, (3), 646-660 (2016).
  15. Annunziata, M. G., et al. Getting back to nature: a reality check for experiments in controlled environments. J Exp Bot. 68, (16), 4463-4477 (2017).
  16. Palus, S. Japan's Massive Indoor Farm Produces 10,000 Heads of Fresh Lettuce Every Day. Smithonian.com. (2014).
Analyse van <em>Arabidopsis thaliana</em> groei gedrag in verschillende kwaliteiten van het licht
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bölter, B., Seiler, F., Soll, J. Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities. J. Vis. Exp. (132), e57152, doi:10.3791/57152 (2018).More

Bölter, B., Seiler, F., Soll, J. Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities. J. Vis. Exp. (132), e57152, doi:10.3791/57152 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter