Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van de plant groei gedrag en vooral fenotypen op een reproduceerbare wijze. Variabele en op de dezelfde tijd stabiel lichtomstandigheden, tonen we hoe te verstrekken. Goede analyses, is afhankelijk van voldoende monster getallen en geldige statistische evaluaties.
Biologen van de plant moeten vaak observeren het gedrag van de groei van hun gekozen soort. Te dien einde vergen de installaties constante milieu en stabiel licht omstandigheden, die bij voorkeur variabele in kwantiteit en kwaliteit zijn zodat studies onder verschillende opstellingen kunnen worden uitgevoerd. Deze eisen is voldaan door klimaatkasten met licht emitterende diodes (LED) verlichting, die – in tegenstelling tot TL-verlichting – instelbaar voor verschillende golflengtes. LEDs zijn energie besparen en uitstoten vrijwel geen warmte zelfs bij lichte intensiteiten, hetgeen vaak een probleem met andere lichtbronnen. Het gepresenteerde protocol bevat een stapsgewijze richtlijnen van hoe te programmeren een klimaatkamer uitgerust met variabele LED-verlichting, alsook het beschrijven van verschillende benaderingen voor diepgaande analyse van de groei fenotypen. Afhankelijk van de experimentele opstelling kunnen verschillende kenmerken van de groeiende planten worden in acht genomen en geanalyseerd. Hier beschrijven we hoe u kunt bepalen van vers gewicht, blad gebied fotosynthetische activiteit en stomatal dichtheid. We aantonen dat het verkrijgen van betrouwbare gegevens en geldige conclusies is verplicht een voldoende aantal personen gebruiken voor statistische evaluatie. Te weinig planten voor dit soort analyseresultaten met hoge statistische fouten en dus ook in minder duidelijke interpretaties van de gegevens.
Arabidopsis thaliana geweest de modelorganisme voor plant onderzoekers van de moleculaire tijdperk voor meer dan twee decennia. Verschillende kenmerken maken dit kleine vertegenwoordiger van de Brassica-familie een ideale kandidaat voor genetische en moleculaire studies: het heeft een relatief klein genoom met slechts vijf chromosomen (in vergelijking met bijvoorbeeld Nicotiana tabacum met 24 chromosomen) en de genoom was volledig sequenced in 20001. A. thaliana genetisch gemakkelijk kan worden gewijzigd door Agrobacterium infectie2 en is vatbaar voor zelfs de meest recente genetische hulpmiddelen zoals CRISPR/Cas3. Hoewel klein, is de groeicyclus snel genoeg om de biochemische experimenten haalbaar te maken waar een hogere hoeveelheid materiaal nodig is. De planten groeien op agar platen of op de bodem en kunnen zelfs als vloeibare culturen4gekweekt. Arabidopsis kunnen worden geteeld in klimatologisch gecontroleerde kasten, bijvoorbeeld van Percival, in klimaatkasten of in kassen. Om te kunnen vergelijken groei gedrag en analyseren van de fenotypen van mutanten is het van cruciaal belang om reproduceerbare en op de dezelfde tijd flexibel groei voorwaarden5te bieden. Afhankelijk van het wetenschappelijke probleem dat moet worden aangepakt is wellicht een verschillende temperaturen en constante licht omstandigheden, diverse lichte intensiteit of verschillende lichte kwaliteiten bij dezelfde temperatuur. Licht is een zeer belangrijke parameter in de plantengroei en de invloed daarvan is vaak bestudeerd in uiteenlopende benaderingen6. Om reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van de verkregen gegevens te waarborgen is het van cruciaal belang het zelfde soort lichtbronnen van toepassing te waarborgen van een stabiele uitgang.
De gebruikelijke lichtbronnen in kassen en klimaatkasten bestaan uit natrium damp of TL-lampen, die bevorderen bevredigend plantengroei, maar hebben verschillende nadelen. Ten eerste, ze ouder na verloop van tijd dat de spectrale output, niet alleen in intensiteit maar in kwaliteit (eigen opmerkingen verandert). Echter is alleen de intensiteit meestal doorlopend gecontroleerd zodat een wijziging in lichte kwaliteit misschien onopgemerkt maar nog steeds aanzienlijke effecten hebben. Ten tweede, beide soorten lampen warmte genereren bij hogere intensiteiten van licht, die zelf heeft een grote fysiologische invloed op de plantengroei en eventuele afhankelijke lichteffect kan maskeren. Ten derde, de spectrale output van deze lichtbronnen is onveranderlijk en heel anders dan het natuurlijke zonlicht7. Al deze nadelen zijn verholpen in geval van LEDs)8,9,10,11. Ze hebben een lange levensduur met nauwelijks enige verandering in de emissie, produceren geen afvalwarmte zelfs bij zeer hoge licht intensiteiten en ze zijn zeer flexibel betreffende hun spectrale output.
Hier illustreren we hoe een klimaatkamer met afzonderlijke LED-lampjes voor rood, blauw en wit licht instellen en volgen verschillende parameters van plantengroei na verloop van tijd. We meten vers gewicht, blad gebied, stoma dichtheid en fotosynthetische prestaties. Op hetzelfde moment tonen we het belang van het correct opzetten van statistische evaluaties.
De eerste stap bij het bestuderen van de plantengroei is het opzetten van de klimaatkamer volgens de gewenste voorwaarden. Dit gebeurt gemakkelijk door alle variabelen in het programma masker van de respectieve software (figuur 1A) te typen. Bij deze stap kunnen veel wijzigingen worden uitgevoerd door het veranderen van de lichte regeling en/of temperatuur. Zorg ervoor dat voortdurend temperatuur, vochtigheid en lichtomstandigheden (Figuur 2) om te voorkomen dat technische storingen verpest het experiment. Dit is een kritisch punt voor het verkrijgen van reproduceerbare resultaten. Hoewel deze set-up veel variabelen biedt en kan flexibel worden aangepast, heeft het zijn beperkingen. De verkrijgbare LED-lampjes niet kunnen nabootsen het zonlicht een honderd procent en de klimatologische omstandigheden in een klimaatkamer kunnen nooit volledig overeen met what’s going on buiten15.
In vergelijking met de gebruikte Toon vrijwel geen warmtestraling, TL-lampen LED lampen zijn veelzijdiger en minder energie nodig. Deze voordelen hebben ertoe geleid dat de grote industrie van indoor landbouw om uit te rusten klimaatkasten en serres met LEDs,16. Gezien de enorme successen gemeld op dit gebied, de LED-techniek vindt zeker veel meer toepassingen.
Wanneer het fenotype observeren en vooral voor de bepaling van het oppervlak van de blad is het belangrijk rekening te houden laat dat in oudere planten overlappen (Figuur 3). Dus, grafische evaluatie van hele rozetten neigt te zijn onnauwkeurig. In dat geval is het veel meer nauwkeurig tot alle bladeren afgesneden en ga vanaf daar.
De evaluatie van het gedrag van de groei en vooral verschillen in groei en ontwikkeling onder verschillende omstandigheden, is afhankelijk van een voldoende grootte van de steekproef. In deze studie, ten minste zes fabrieken werden gebruikt voor de bepaling van bijvoorbeeld fotosynthetische opbrengst (Figuur 5), verse gewicht (Figuur 7), en blad gebied (figuur 8A) maar 30 individuele zaden geplant werden aan het begin van de studie om ervoor te zorgen dat eerste, voldoende zaden ontkiemen, en ten tweede, een keuze van de “typische” planten kan worden gemaakt. Zelfs binnen de dezelfde populatie, dat wil zeggen de planten in enkele potten in de dezelfde lade onder exact dezelfde voorwaarden, toonde verschillende fenotypes. Dit wordt dan natuurlijk weerspiegeld in de standaarddeviatie tijdens statistische analyse, maar de interpretatie van gegevens is over het algemeen betrouwbaarder wanneer kleine statistische fouten worden waargenomen (Figuur 8).
Meting van fotosynthetische performance door PAM (Figuur 4, Figuur 5) kan worden gedaan voor verschillende parameters. In dit geval lag de focus op de opbrengst van de PSII Y(II) als een voorbeeld, maar het is mogelijk om ook bijvoorbeeld niet-fotochemische blussen, het quantumrendement van gereglementeerde en niet-gereglementeerde energie dissipatie of lichte kwijtschelding. Belangrijk hier is om te kiezen van ten minste vijf áes per blad gelijkmatig verdeeld over het oppervlak van het blad en vervolgens meten ten minste zes bladeren van verschillende planten. Het nadeel van deze methode is dat eventuele effecten op PSI niet kunnen worden opgespoord; voor dat doel, is verschillende apparatuur nodig.
The authors have nothing to disclose.
F.S. erkent steun van Rhenac Green Tec AG door delen van deze studie. J.S. en B.B. ontvangen financiering van de DFG (SFB TR175).
Climatic chamber equipped with LED panels | Rhenac Green Tec AG | These chambers are custom made. | |
Spectrometer | OceanOptics | USB-650 | |
Imaging PAM | Walz | IMAGING-PAM M-Series | There are several suitable models depending on the broader use. |
Microscope+ 40x objective | Leica | DM1000 | Other companies also produce suitable microscopes. |
Software ImageJ | Free download from website | ||
Plant RNA extraction kit | Qiagen | 74903 | |
Bioanalyser | Agilent | G2939BA | Needs an additional computer |