Aqui, apresentamos um protocolo para estudar o comportamento do crescimento de planta e especialmente fenótipos de forma reproduzível. Mostramos como fornecer variável e ao mesmo tempo estável condições de luz. Adequada análises dependem de números suficientes de amostra e avaliações de estatísticas válidas.
Biólogos da planta, muitas vezes, necessidade de observar o comportamento de crescimento da espécie escolhida. Para este efeito, as plantas precisam de constantes estáveis e ambientais condições de luz, que são de preferência variáveis em quantidade e qualidade, para que podem efectuar-se estudos sob diferentes configurações. Esses requisitos são atendidos por câmaras climáticas com luz emitindo luzes de diodos (LED), que podem – em contraste com luzes fluorescentes – ser definidas para diferentes comprimentos de onda. Os LEDs são energia conservação e não emitem praticamente nenhum calor mesmo em intensidades luminosas, que constitui frequentemente um problema com outras fontes de luz. O protocolo apresentado fornece uma orientação passo a passo de como programar uma câmara climática equipados com luzes de LED variáveis, bem como descrevendo várias abordagens na análise aprofundada dos fenótipos de crescimento. Dependendo da montagem experimental várias características das plantas crescentes podem ser observadas e analisadas. Aqui descrevemos como determinar o peso fresco, área foliar, atividade fotossintética e densidade estomática. Demonstramos que a fim de obter dados fiáveis e tirar conclusões válidas, é obrigatório usar um número suficiente de indivíduos para avaliação estatística. Tendo muito poucas plantas para este tipo de resultados de análise em altos erros estatísticos e, consequentemente, menos clara interpretações dos dados.
Arabidopsis thaliana tem sido o organismo modelo para pesquisadores da planta da época molecular por mais de duas décadas. Várias características fazem deste pequeno representante da família Brassica um candidato ideal para estudos genéticos e moleculares: tem um genoma relativamente pequeno com apenas cinco cromossomas (em comparação com , por exemplo, Nicotiana tabacum com 24 cromossomos) e seu genoma foi completamente sequenciada em 20001. A. thaliana podem ser facilmente geneticamente modificados por Agrobacterium infecção2 e é passível de mesmo as mais recente genéticas ferramentas como CRISPR/Cas3. Embora pequeno, o ciclo de crescimento é rápido o suficiente para fazer experimentos bioquímicos viáveis onde uma maior quantidade de material é necessária. As plantas crescem em placas de ágar ou no solo e podem ser cultivadas como culturas líquido4. Arabidopsis pode ser crescido em armários climaticamente controlados, por exemplo, de Percival, em câmaras climáticas ou em estufas. Para ser capaz de comparar o comportamento de crescimento e analisar fenótipos mutantes é essencial para fornecer reproduzíveis e no mesmo tempo crescimento flexível condições5. Dependendo do problema científico que deve ser abordada uma precisar de diferentes temperaturas e condições de luz constantes, diversas intensidades luminosas ou qualidades de luz diferentes à mesma temperatura. A luz é um parâmetro muito crítico no crescimento das plantas e sua influência é frequentemente estudada em diversas abordagens6. Para garantir a reprodutibilidade e a comparabilidade dos dados obtidos é crucial assegurar uma saída estável e aplicar o mesmo tipo de fontes de luz.
As habituais fontes de luz em estufas e câmaras climáticas consistem de vapor de sódio ou lâmpadas fluorescentes, que promovem o crescimento de planta satisfatória, mas têm várias desvantagens. Primeiro, eles envelhecem com o tempo que muda a saída espectral não apenas em intensidade, mas em qualidade (observações próprias). No entanto, somente a intensidade é geralmente monitorada continuamente para que uma mudança na qualidade da luz pode passar despercebida, mas ainda tem efeitos significativos. Em segundo lugar, ambos os tipos de lâmpadas geram calor em intensidades mais elevadas de luz, que em si tem uma profunda influência fisiológica no crescimento das plantas e pode mascarar qualquer efeito dependente de luz. Em terceiro lugar, a saída espectral destas fontes de luz é invariável e diferente da luz natural do sol7. Todas estas desvantagens foram vencidas no caso de diodos emissores de luz)8,9,10,11. Eles têm uma vida longa com quase nenhuma mudança na emissão, não produzem calor waste mesmo em intensidades luminosas muito altas e eles são muito flexíveis sobre sua saída espectral.
Aqui ilustramos como preparar uma câmara climática com luzes de LED separadas para luz branca, azul e vermelho e siga os diversos parâmetros de crescimento da planta ao longo do tempo. Medimos o peso fresco, área foliar, densidade de estômatos e desempenho fotossintético. Ao mesmo tempo, podemos demonstrar a importância da corretamente configurar avaliações estatísticas.
O primeiro passo no estudo de crescimento da planta é criação de câmara climática, de acordo com as condições desejadas. Isso é facilmente feito digitando todas as variáveis dentro da máscara do programa do respectivo software (figura 1A). Neste passo, muitas modificações podem ser implementadas, alterando o regime de luz e/ou temperatura. Certifique-se de monitorar constantemente a temperatura, umidade e condições de luz (Figura 2) para evitar a falha técnica de arruinar o experimento. Este é um ponto crítico para a obtenção de resultados reprodutíveis. Embora essa configuração oferece muitas variáveis e pode ser ajustada de forma flexível, tem suas limitações. As luzes de LED atualmente disponíveis não podem imitar a luz do sol cem por cento e as condições climáticas dentro de uma câmara climática nunca completamente podem refletir o que está acontecendo fora15.
Comparado com os utilizados luzes fluorescentes lâmpadas LED são mais versáteis, precisa de menos energia e praticamente nenhuma radiação de calor. Estas vantagens levaram a grande indústria da agricultura indoor para equipar câmaras climáticas e estufas com LEDs16. Considerando os enormes sucessos relatados neste campo, a técnica de LED certamente irá encontrar muitas outras aplicações.
Ao observar o fenótipo e especialmente para determinação da área de folha, é importante ter em conta que em plantas mais velhas folhas de sobreposição (Figura 3). Assim, a avaliação gráfica das rosetas toda tende a ser impreciso. Nesse caso, é muito mais preciso cortar todas as folhas, e de lá ir.
A avaliação do comportamento de crescimento e especialmente as diferenças de crescimento e desenvolvimento sob diferentes condições dependem de um tamanho de amostra suficiente. Neste estudo, pelo menos seis plantas foram utilizadas para determinação de , por exemplo, rendimento fotossintético (Figura 5), peso fresco (Figura 7), e a área foliar (Figura 8A) mas 30 sementes individuais foram plantadas no início do estudo para garantir que germinarem sementes suficientes, primeiras, e em segundo lugar, que pode ser feita uma escolha de plantas “típicas”. Mesmo dentro da mesma população, ou seja, plantas em vasos único na mesma bandeja sob as mesmas condições, mostrou diferentes fenótipos. Isto então é claro refletido no desvio-padrão durante a análise estatística, mas a interpretação dos dados é geralmente mais confiável quando pequenos erros estatísticos são observados (Figura 8B).
Medição de desempenho fotossintético por PAM (Figura 4, Figura 5) pode ser feita por vários parâmetros. Neste caso, o foco foi sobre o rendimento do FSII y (II) como um exemplo, mas é possível também determinar , por exemplo, não-fotoquímica têmpera, o rendimento quântico de dissipação de energia regulamentadas e não regulamentadas ou remissão de luz. Aqui é importante para escolher pelo menos cinco PUC por folha, distribuídos uniformemente em toda a superfície da folha e em seguida medir pelo menos seis folhas de diferentes plantas. A desvantagem desse método é que não podem ser detectados quaisquer efeitos na PSI; para esse efeito, é necessário equipamento diferente.
The authors have nothing to disclose.
F.S. reconhece apoio da Rhenac verde Tec AG através de partes deste estudo. J.S. e B.B. receberam financiamento da DFG (SFB TR175).
Climatic chamber equipped with LED panels | Rhenac Green Tec AG | These chambers are custom made. | |
Spectrometer | OceanOptics | USB-650 | |
Imaging PAM | Walz | IMAGING-PAM M-Series | There are several suitable models depending on the broader use. |
Microscope+ 40x objective | Leica | DM1000 | Other companies also produce suitable microscopes. |
Software ImageJ | Free download from website | ||
Plant RNA extraction kit | Qiagen | 74903 | |
Bioanalyser | Agilent | G2939BA | Needs an additional computer |