Vi præsenterer her, en protokol for at studere planter vækst adfærd og især fænotyper på en reproducerbar måde. Vi viser, hvordan til at give variabel og på samme tid stabile lysforhold. Passende analyser afhænger nok prøve tal og gyldige statistiske evalueringer.
Plante biologer ofte brug for at observere vækst opførslen af deres valgte arter. Med henblik herpå, at planter har brug for konstant miljømæssige og stabile lysforhold, som helst variabel i kvantitet og kvalitet så der kan foretages undersøgelser under forskellige opsætninger. Disse krav opfyldes af klimatiske kamre byder light emitting dioder (LED) lys, som kan-i modsætning til fluorescerende lys – indstilles til forskellige bølgelængder. Lysdioder er energi bevarelse og afgiver næsten ingen varme selv på lys intensitet, som ofte udgør et problem med andre lyskilder. Den præsenterede protokol indeholder en trinvis vejledning i hvordan man programmerer en klimarum udstyret med variable LED-lys samt beskriver flere metoder for dybtgående analyse af vækst fænotyper. Afhængigt af den eksperimentelle set-up kan forskellige karakteristika af de voksende planter observeres og analyseret. Her beskriver vi at fastsætte frisk vægt, leaf område, fotosyntetiske aktivitet og spalteåbningernes tæthed. Vi viser, at for at få pålidelige data og drage gyldige konklusioner er det obligatorisk at bruge et tilstrækkeligt antal personer til statistisk vurdering. Tager alt for få planter til denne slags analyseresultater i høje statistiske fejl og dermed i mindre klart fortolkninger af dataene.
Arabidopsis thaliana har været model organisme for anlægget forskere af den molekylære æra i mere end to årtier. Flere egenskaber gør denne lille repræsentant for slægten Brassica en ideel kandidat til genetiske og molekylære undersøgelser: det har en relativt lille genom med kun fem kromosomer (sammenlignet med fx Nicotiana tabacum med 24 kromosomer) og dens genom blev helt sekventeret i 20001. A. thaliana kan nemt genetisk modificeret af Agrobacterium infektion2 og er åbne over for selv de nyeste genetiske værktøjer som CRISPR/Cas3. Selvom små, er cyklussen hurtig nok til at gøre biokemiske eksperimenter muligt hvor der er behov for en højere mængde af materiale. Planterne vokser på agar plader eller på jord og kan endda være dyrket som flydende kulturer4. Arabidopsis kan dyrkes i klimatisk kontrolleret skabene, fx fra Percival, i klimatiske kamre eller i drivhuse. For at kunne sammenligne vækst adfærd og analysere fænotyper af mutanter er det kritisk at give reproducerbare og på samme tid fleksible vækst betingelser5. Afhængigt af den videnskabelige problem, der er behandles muligvis en forskellige temperaturer og konstant lysforhold, forskellige lys intensitet eller forskellige lys kvaliteter ved samme temperatur. Lys er en meget afgørende parameter i planternes vækst og dens indflydelse er ofte studerede i mangfoldige fremgangsmåder6. For at sikre reproducerbarheden og sammenlignelighed af de fremkomne data er det afgørende at sikre en stabil udgang og anvender den samme slags lyskilder.
De sædvanlige lyskilder i drivhuse og klimatiske kamre består af natrium vapor eller lysstofrør, som fremmer tilfredsstillende plantevækst, men har flere ulemper. Først, de ældes med tiden, som ændrer den spektrale output, ikke kun i intensitet men i kvalitet (egne observationer). Dog overvåges kun intensiteten som regel kontinuerligt, en ændring i let kvalitet kan gå ubemærket hen, men stadig har betydelige virkninger. For det andet begge typer af lamper generere varme ved højere lys intensitet, som selv har en dybtgående fysiologisk indvirkning på planternes vækst og kan maskere eventuelle afhængige lyseffekt. For det tredje er den spektrale output af disse lyskilder uforanderlig og helt i modsætning til naturlige sollys7. Alle disse ulemper er overvundet i tilfælde af lysdioder)8,9,10,11. De har en lang levetid med næsten ingen ændring i emissioner, ikke producerer spildvarme selv ved meget høj lys intensitet og de er meget fleksibel, om deres spektrale output.
Her viser vi hvordan du oprette et klimarum byder på separat LED lys for rød, blå og hvide lys og følge forskellige parametre af planternes vækst over tid. Vi måler frisk vægt, leaf område, spalteåbninger tæthed og fotosyntetiske ydeevne. På samme tid viser vi betydningen af korrekt opsætning af statistiske vurderinger.
Det første trin i at studere planternes vækst er ved at oprette klimarum de ønskede betingelser. Dette gøres nemt ved at skrive alle variabler i programmet masken af den respektive software (figur 1A). På dette trin, kan mange ændringer gennemføres ved at ændre lys regime og/eller temperatur. Sørg for at hele tiden overvåge temperatur, luftfugtighed og lysforhold (figur 2) for at undgå tekniske fejl fra ødelægge af eksperiment. Dette er et afgørende punkt for at opnå reproducerbare resultater. Selvom dette set-up tilbyder mange variabler og kan justeres fleksibelt, har den sine begrænsninger. I øjeblikket tilgængelige LED-lys kan ikke efterligne sollyset hundrede procent og de klimatiske forhold inde i et klimarum kan aldrig helt afspejler, hvad der foregår uden for15.
I forhold til de anvendte fluorescerende pærer LED lys er mere alsidige, har brug for mindre energi og viser stort set ingen varmestråling. Disse fordele har ført den store industri af indendørs landbrug for at udstyre klimatiske kamre og drivhuse med lysdioder16. I betragtning af de enorme succeser rapporteret i feltet LED teknik vil sikkert finde mange flere programmer.
Når observere fænotype og især for bestemmelse af det blad område er det vigtigt at tage hensyn til efterlader det i ældre planter overlapning (figur 3). Således grafiske evaluering af hele rosetter tendens til at være upræcis. I dette tilfælde er det meget mere præcis at afskære alle blade og gå derfra.
Vurdering af vækst adfærd og især forskelle i vækst og udvikling under forskellige betingelser afhænger af en tilstrækkelig stikprøvestørrelse. I denne undersøgelse, mindst seks planter blev anvendt til bestemmelse af fx fotosyntetiske udbytte (figur 5), friske vægt (figur 7), og blade område (figur 8A) men 30 individuelle frø blev plantet i begyndelsen af undersøgelsen til at sikre at første, tilstrækkelig frøene spire, og for det andet, et udvalg af “typiske” planter kan foretages. Selv inden for samme population, dvs planter i enkelt gryder i den samme skuffe under de nøjagtige samme betingelser, viste varierende fænotyper. Dette er så naturligvis afspejlet i standardafvigelsen under statistisk analyse, men fortolkningen af data er generelt mere pålidelige, når små statistiske fejl er observeret (figur 8).
Måling af fotosyntetiske ydeevne af PAM (figur 4, figur 5) kan gøres for flere parametre. I dette tilfælde var der fokus på PSII udbytte Y(II) som eksempel, men det er muligt også bestemme f.eks. ikke-fotokemisk quenching, kvanteudbytte af regulerede og ikke-regulerede energi varmeafledning eller lys remission. Vigtigt her er at vælge mindst fem AOIs pr. blad er jævnt fordelt over bladets overflade og derefter måle mindst seks blade fra forskellige planter. Ulempen ved denne metode er, at eventuelle virkninger på PSI ikke kan påvises; til dette formål kræves forskelligt udstyr.
The authors have nothing to disclose.
F.S. anerkender støtte fra Rhenac grøn Tec AG gennem dele af denne undersøgelse. J.S. og B.B. modtaget støtte fra DFG (SFB TR175).
Climatic chamber equipped with LED panels | Rhenac Green Tec AG | These chambers are custom made. | |
Spectrometer | OceanOptics | USB-650 | |
Imaging PAM | Walz | IMAGING-PAM M-Series | There are several suitable models depending on the broader use. |
Microscope+ 40x objective | Leica | DM1000 | Other companies also produce suitable microscopes. |
Software ImageJ | Free download from website | ||
Plant RNA extraction kit | Qiagen | 74903 | |
Bioanalyser | Agilent | G2939BA | Needs an additional computer |