Nous présentons ici un protocole pour l’étude de comportement de croissance des végétaux et en particulier des phénotypes de façon reproductible. Nous montrons comment fournir variable et à des conditions d’éclairage temps stable même. Bon analyses dépendent nombre d’échantillon suffisant et évaluations statistiques valides.
Phytobiologistes a souvent besoin d’observer le comportement de la croissance de leur espèce choisie. À cette fin, les plantes ont besoin constantes conditions environnementales et stables légers, qui sont préférence variables en quantité et en qualité, afin que sous différentes configurations peuvent être menées. Ces besoins sont satisfaits par des enceintes climatiques mettant en vedette électroluminescentes diodes (LED) s’allume, qui – contrairement aux lampes fluorescentes – réglable à différentes longueurs d’onde. Les LED sont énergie conservation et n’émet pratiquement aucune chaleur même à des intensités lumineuses, qui constitue souvent un problème avec les autres sources de lumière. Le protocole présenté fournit un guide étape par étape comment programmer une chambre climatique équipé de voyants variables comme décrivant plusieurs approches pour une analyse approfondie des phénotypes de la croissance. Selon le montage expérimental diverses caractéristiques des croissance des plantes peuvent être observés et analysés. Nous décrivons ici comment déterminer le poids frais, la surface foliaire, l’activité photosynthétique et la densité des stomates. Nous démontrons que, pour obtenir des données fiables et de tirer des conclusions valables, qu’il est obligatoire d’utiliser un nombre suffisant d’individus pour l’évaluation statistique. En trop peu de plantes pour ce genre de résultats d’analyse des erreurs statistiques élevées et par conséquent au moins clairement les interprétations des données.
Arabidopsis thaliana a été l’organisme modèle pour les chercheurs de la plante de l’ère moléculaire pendant plus de deux décennies. Plusieurs caractéristiques rendent ce petit représentant de la famille des Brassicacées un candidat idéal pour les études génétiques et moléculaires : il possède un génome relativement faible avec seulement cinq chromosomes (contre par exemple Nicotiana tabacum avec 24 chromosomes) et son génome a été séquencé entièrement en 20001. A. thaliana peut être facilement génétiquement modifié par Agrobacterium infection2 et se prête à même les derniers outils génétiques telles que CRISPR/AR3. Bien que petite, le cycle de croissance est assez rapide pour faire des expériences biochimiques possibles nécessitant une plus grande quantité de matériel. Les plantes poussent sur milieu gélosé ou sur le sol et peuvent même être cultivés comme culture liquide4. Arabidopsis peut être cultivé dans des armoires climatiquement contrôlés, par exemple de Percival, en enceintes climatiques ou dans les serres. Pour être en mesure de comparer le comportement de croissance et d’analyser les phénotypes mutants, il est essentiel de fournir reproductible et avec le même temps la croissance flexible conditions5. Selon le problème scientifique qui doit être adressée, on pourrait besoin de différentes températures et conditions de luminosité constantes, diverses intensités lumineuses ou différentes qualités de lumière à la même température. La lumière est un paramètre très essentiel dans la croissance des plantes et son influence est souvent étudié dans diverses approches6. Afin de garantir la reproductibilité et la comparabilité des données obtenues, il est essentiel d’assurer un rendement stable et appliquent le même type de sources lumineuses.
Les sources lumineuses habituels dans les serres et enceintes climatiques sont constitués de vapeur de sodium ou de lampes fluorescentes, qui favorisent la croissance des plantes satisfaisant mais ont plusieurs inconvénients. Tout d’abord, ils vieillissent avec le temps qui change le rendement spectral, non seulement en intensité, mais de qualité (propres observations). Toutefois, seule l’intensité est généralement surveillée en continu afin qu’un changement dans la qualité de la lumière pourrait passer inaperçu mais toujours avoir des incidences notables. Deuxièmement, les deux types de lampes génèrent de la chaleur aux intensités lumineuses supérieures, qui lui-même a une profonde influence physiologique sur la croissance des plantes et peut masquer une luminescence dépendant. En troisième lieu, la sortie spectrale de ces sources lumineuses est invariable et contrairement à la lumière naturelle du soleil7. Tous ces inconvénients ont été surmontées dans le cas de LEDs)8,9,10,11. Ils ont une longue durée de vie avec à peine n’importe quel changement d’émission, ne produisent pas de chaleur résiduelle, même à très haute intensité lumineuse et ils sont très flexibles concernant leur rendement spectral.
Ici, nous illustrons comment mettre en place une chambre climatique avec LED distinctes pour rouge, bleu et blanc léger et suivre les différents paramètres de croissance de la plante au fil du temps. Nous mesurons le poids frais, la surface foliaire, densité des stomates et rendement photosynthétique. Dans le même temps, nous démontrent l’importance de correctement mise en place d’évaluations statistiques.
La première étape dans l’étude de la croissance des plantes met en place la chambre climatique selon les conditions souhaitées. Cela se fait facilement en tapant toutes les variables dans le masque de programme du logiciel respectif (Figure 1 a). À cette étape, beaucoup de modifications peut être implémenté en modifiant le régime de lumière et/ou de la température. Assurez-vous de surveiller constamment la température, l’humidité et luminosité (Figure 2) pour prévenir la défaillance technique de ruiner l’expérience. Il s’agit d’un point critique pour obtenir des résultats reproductibles. Bien que cette configuration fournit plusieurs variables et peut être ajustée de manière flexible, il a ses limites. Les voyants actuellement disponibles ne peuvent pas imiter la lumière du soleil à cent pour cent et les conditions climatiques à l’intérieur d’une enceinte climatique peuvent refléter jamais complètement ce qui se passe à l’extérieur15.
Par rapport à la largement utilisé des tubes fluorescents LED lumières sont plus polyvalents, ont besoin de moins d’énergie et ne show pratiquement aucun rayonnement de chaleur. Ces avantages ont conduit à la grande industrie agricole intérieure pour équiper les chambres climatiques et les serres avec LEDs16. Compte tenu de l’énormes succès rapportés dans ce domaine, la technique LED trouverez sûrement bien d’autres applications.
Lors de l’observation du phénotype et surtout pour la détermination de la surface foliaire, qu’il est important de prendre en compte que dans les plantes plus âgées laisse chevauchement (Figure 3). Ainsi, une évaluation graphique des rosettes toute tend à être imprécis. Dans ce cas, il est beaucoup plus précis pour couper toutes les feuilles et partir de là.
L’évaluation du comportement de croissance et en particulier les différences de croissance et de développement dans des conditions différentes repose sur un échantillon de taille suffisante. Dans cette étude, au moins six usines ont été utilisées pour la détermination du p. ex. photosynthétique rendement (Figure 5), poids frais (Figure 7), et la surface foliaire (Figure 8 a), mais 30 graines individuelles ont été plantés au début de l’étude pour s’assurer que tout d’abord, suffisamment de graines germent, et Deuxièmement, un choix de plantes « typiques » peut se faire. Même au sein de la même population, c’est-à-dire les plantes en pots unique dans la barre d’État même dans les mêmes conditions exactes, ont montré des phénotypes différents. Alors bien sûr en témoigne l’écart au cours de l’analyse statistique, mais l’interprétation des données est généralement plus fiable lorsque les petites erreurs statistiques sont observés (Figure 8 b).
Mesure du rendement photosynthétique par PAM (Figure 4, Figure 5) peut être fait pour plusieurs paramètres. Dans ce cas, était axé sur le rendement PSII ouverts à titre d’exemple, mais on peut aussi déterminer par exemple quenching non-photochimique, le rendement quantique de dissipation d’énergie réglementés et non réglementés ou de la remise lumineuse. Important ici est de choisir au moins cinq IEA chaque feuille uniformément répartis dans la surface de la feuille et ensuite mesurer au moins six feuilles de différentes plantes. L’inconvénient de cette méthode est que les conséquences pour les PSI ne peuvent être détectés ; pour cela, différents équipements sont nécessaire.
The authors have nothing to disclose.
F.S. reconnaît le soutien de Rhenac vert Tec AG à travers des parties de cette étude. J.S. et B.B. a reçu des fonds de la DFG (SFB TR175).
Climatic chamber equipped with LED panels | Rhenac Green Tec AG | These chambers are custom made. | |
Spectrometer | OceanOptics | USB-650 | |
Imaging PAM | Walz | IMAGING-PAM M-Series | There are several suitable models depending on the broader use. |
Microscope+ 40x objective | Leica | DM1000 | Other companies also produce suitable microscopes. |
Software ImageJ | Free download from website | ||
Plant RNA extraction kit | Qiagen | 74903 | |
Bioanalyser | Agilent | G2939BA | Needs an additional computer |