Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für das Studium der Pflanze Wuchsverhalten und vor allem Phänotypen reproduzierbar. Wir zeigen wie Sie bieten Variable und in der gleichen Zeit stabilen Lichtverhältnissen. Richtige Analysen hängen ausreichend Probennummern und gültige statistische Auswertungen.
Pflanze Biologen müssen oft Wuchsverhalten ihrer gewählten Arten beobachten. Zu diesem Zweck benötigen die Pflanzen konstant Umwelt- und stabile Lichtverhältnisse, die vorzugsweise variabel in Quantität und Qualität sind damit Studien unter verschiedenen Setups durchgeführt werden können. Diese Anforderungen werden durch Klimakammern mit Licht emittierenden Dioden (LED)-leuchten, die im Gegensatz zu Leuchtstoffröhren – auf verschiedenen Wellenlängen eingestellt werden können – erfüllt. LEDs sind Energie sparen und emittieren praktisch keine Wärme auch bei Lichtintensitäten, die oft ein Problem mit anderen Lichtquellen darstellt. Die vorgestellte Protokoll sieht eine schrittweise Anleitung zum Programmieren einer Klimakammer mit variabler LED-Leuchten ausgestattet sowie mehrere Ansätze für eingehende Analyse der Wachstum Phänotypen zu beschreiben. Je nach der Versuchsaufbau können verschiedene Eigenschaften der wachsenden Pflanzen beobachtet und analysiert werden. Hier beschreiben wir, wie Frischgewicht, Blattfläche, photosynthetische Aktivität und Stomata Dichte bestimmen. Wir zeigen, dass, um verlässliche Daten zu erhalten und gültige Schlüsse ist es zwingend erforderlich, um eine ausreichende Anzahl von Personen für die statistische Auswertung verwendet. Hohe statistische Fehler zu wenige Pflanzen für diese Art von Analyse-Ergebnisse an und folglich in weniger klaren Interpretation der Daten.
Arabidopsis Thaliana wurde der Modellorganismus für Pflanzenforscher der molekularen Ära für mehr als zwei Jahrzehnten. Verschiedene Eigenschaften machen dieses kleine Vertreter der Familie der Brassica einen idealen Kandidat für die genetischen und molekularbiologischen Studien: Es hat ein relativ kleines Genom mit nur fünf Chromosomen (im Vergleich zu z.B. Nicotiana Tabacum mit 24 Chromosomen) und sein Genom wurde in 20001vollständig sequenziert. A. Thaliana durch Agrobacterium Infektion2 einfach genetisch modifiziert werden kann und sogar die neuesten genetischen Werkzeuge wie CRISPR/Cas3zugänglich ist. Obwohl klein, ist der Wachstumszyklus schnell genug, um biochemische Experimente möglich zu machen, wo eine höhere Menge an Material benötigt. Die Pflanzen wachsen auf Agarplatten oder am Boden und können sogar als flüssige Kulturen4kultiviert werden. Arabidopsis kann in klimatisch kontrollierten Schränke, z. B. von Percival, angebaut in Klimakammern oder in Gewächshäusern. Um zu vergleichen Wuchsverhalten und Phänotypen von Mutanten zu analysieren ist es wichtig, reproduzierbar und in der gleichen Zeit flexibles Wachstum Bedingungen5bieten. Je nach die wissenschaftliche Fragestellung, die angesprochen werden soll benötigen eine unterschiedliche Temperaturen und konstante Lichtverhältnisse, unterschiedlichen Lichtintensitäten oder verschiedenen Lichtqualitäten bei gleicher Temperatur. Licht ist ein sehr kritischer Parameter für das Pflanzenwachstum und seinen Einfluss ist oft in unterschiedlicher Ansätze6untersucht. Um die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der erhobenen Daten ist es entscheidend eine stabile Leistung zu gewährleisten und die gleiche Art von Lichtquellen anwenden.
Die üblichen Lichtquellen in Gewächshäusern und Klimakammern bestehen aus Natrium-Dampf oder Leuchtstofflampen, die befriedigend Pflanzenwachstum zu fördern, sondern haben mehrere Nachteile. Erstens, Altern sie im Laufe der Zeit die spektrale Leistung ändert sich nicht nur in der Intensität, sondern in der Qualität (eigene Beobachtungen). Allerdings wird nur die Intensität in der Regel kontinuierlich überwacht, so dass eine Änderung der Lichtqualität könnte unbemerkt aber noch erhebliche Auswirkungen haben. Zweitens: beide Arten von Lampen erzeugen Wärme bei höheren Lichtintensitäten, die selbst hat einen großen physiologischen Einfluss auf das Pflanzenwachstum und könnte jeder abhängige Lichteffekt zu maskieren. Drittens ist die spektrale Ausgabe dieser Lichtquellen unveränderlich und ganz anders als das natürliche Sonnenlicht-7. Diese Nachteile sind bei LEDs überwunden)8,9,10,11. Sie haben eine lange Lebensdauer mit kaum Änderungen der Emission, produzieren keine Abwärme auch bei sehr hohen Lichtintensitäten und sie sind sehr flexibel bezüglich ihrer spektralen Leistung.
Hier zeigen wir, wie Einrichten einer Klimakammer mit separaten LED-Leuchten für rot, blau und weißes Licht und verschiedene Parameter des Pflanzenwachstums im Laufe der Zeit zu folgen. Wir messen Frischgewicht, Blattfläche, Spaltöffnungen Dichte und photosynthetischen Leistung. Zur gleichen Zeit zeigen wir, wie wichtig es ist, richtig einrichten statistische Auswertungen.
Der erste Schritt bei der Untersuchung von Pflanzenwachstum ist die Einrichtung der Klimakammer nach den gewünschten Bedingungen. Dies geschieht ganz einfach indem Sie alle Variablen in der Programm-Maske der jeweiligen Software (Abbildung 1A) eingeben. Bei diesem Schritt können viele Änderungen implementiert werden, indem Sie ändern die vereinfachte Regelung und/oder Temperatur. Achten Sie darauf, Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Lichtverhältnisse (Abbildung 2) zu verhindern, dass technisches Versagen ruinieren das Experiment ständig zu überwachen. Dies ist ein kritischer Punkt für reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Obwohl dieses Set-up viele Variablen bietet und flexibel angepasst werden kann, hat es seine Grenzen. Die derzeit verfügbaren LED-Leuchten können nicht dem Sonnenlicht eine hundertprozentige imitieren und die klimatischen Bedingungen in einer Klimakammer können nie vollständig reflektieren was außen15geht.
Im Vergleich zu den weit verbreiteten Leuchtstofflampen LED-Leuchten sind vielseitiger, benötigen weniger Energie und zeigen nahezu keine Wärmestrahlung. Diese Vorteile führten die Großindustrie innen Landwirtschaft, Klimakammern und Gewächshäuser mit LEDs16auszustatten. In Anbetracht der großen Erfolge berichtet in diesem Bereich die LED-Technik finden sicher viele weitere Anwendungen.
Bei der Beobachtung des Phänotyps und vor allem zur Bestimmung der Blattfläche ist es wichtig zu berücksichtigen Blätter, dass in älteren Anlagen Überlappung (Abbildung 3). Grafische Auswertung der gesamten Rosetten tendenziell so ungenau sein. In diesem Fall ist es sehr viel genauer auf alle Blätter abgeschnitten und gehen von dort aus.
Die Auswertung der Wuchsverhalten und vor allem die Unterschiede von Wachstum und Entwicklung unter verschiedenen Bedingungen hängt eine ausreichende Stichprobengröße. In dieser Studie mindestens sechs Pflanzen dienten zur Bestimmung von z.B. photosynthetischen Ertrag (Abbildung 5), Frischgewicht (Abbildung 7), und Blattfläche (Abb. 8A) aber 30 einzelne Samen gepflanzt wurden zu Beginn der Studie zu gewährleisten dass erstens genügende Samen keimen, und zweitens eine Auswahl der “typischen” Pflanzen erzielt werden. Sogar innerhalb der gleichen Bevölkerung, d.h. Pflanzen in einzelnen Töpfen in demselben Fach unter den exakten gleichen Bedingungen zeigten unterschiedliche Phänotypen. Dies spiegelt dann natürlich in die Standardabweichung bei der statistischen Analyse, aber die Interpretation der Daten ist in der Regel zuverlässiger, wenn kleine statistische Fehler (Abbildung 8 b) eingehalten werden.
Messung der photosynthetischen Leistungsfähigkeit von PAM (Abbildung 4, Bild 5) kann für mehrere Parameter erfolgen. In diesem Fall im Mittelpunkt standen PSII Ertrag Y(II) als Beispiel, aber es ist möglich, auch zu ermitteln, z. B. nicht photochemische abschrecken, die Quantenausbeute der regulierten und nicht regulierten Energie Verschwendung oder leichte Remission. Wichtig ist hier, wählen mindestens fünf AOIs pro Blatt gleichmäßig auf der Blattoberfläche verteilt und dann messen Sie mindestens sechs Blätter von verschiedenen Pflanzen. Der Nachteil dieser Methode ist, dass keine Auswirkungen auf die PSI nicht erkannt werden können; zu diesem Zweck braucht man verschiedener Geräte.
The authors have nothing to disclose.
F.s. räumt Unterstützung von Rhenac Green Tec AG durch Teile dieser Studie. J.s. und b.b. finanziell unterstützt von der DFG (SFB TR175).
Climatic chamber equipped with LED panels | Rhenac Green Tec AG | These chambers are custom made. | |
Spectrometer | OceanOptics | USB-650 | |
Imaging PAM | Walz | IMAGING-PAM M-Series | There are several suitable models depending on the broader use. |
Microscope+ 40x objective | Leica | DM1000 | Other companies also produce suitable microscopes. |
Software ImageJ | Free download from website | ||
Plant RNA extraction kit | Qiagen | 74903 | |
Bioanalyser | Agilent | G2939BA | Needs an additional computer |