כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד התנהגות גידול הצמח, במיוחד פנוטיפים באופן לשחזור. אנו מראים כיצד לספק משתנה ועל הזמן אותו יציבים לתנאי תאורה. ניתוחים נכונה תלויה מספיקים מדגם והערכות סטטיסטיות בתוקף.
צמח ביולוגים בדרך כלל צריכים לצפות את ההתנהגות גידול הגזע שלהם שבחרת. לשם כך, השתילים קבוע סביבתית ויציבות לתנאי תאורה, אשר רצוי משתנה בכמות ובאיכות כך מחקרים תחת setups שונים יכול להתבצע. דרישות אלה הם נפגשו על ידי התא-קיטים הכוללים אור האורות (דיודה) פולטות, אשר – בניגוד נורות ניאון – ניתן להגדיר את אורכי גל שונים. נוריות הם אנרגיה שימור ולשדר כמעט אין חום בכלל בעוצמות אור, אשר לעתים קרובות מהווה בעיה עם מקורות אור אחרים. פרוטוקול הציג מספק הדרכה שלב אחר שלב כיצד לתכנת תא אקלימיים מצויד עם נורות LED משתנה, כמו גם המתאר מספר גישות עבור ניתוח עומק של פנוטיפים צמיחה. בהתאם הסידור ניסיוני מאפיינים שונים של הצמחים הגדלים ניתן להקליט ולצפות במעשיהם מנותח. כאן נתאר כיצד לקבוע משקל טריים, באזור עלה, פעילות פוטוסינתטיים, צפיפות stomatal. נדגים זאת על מנת לקבל נתונים אמינים ולהסיק מסקנות בתוקף שחובה להשתמש מספר מספיק של אנשים עבור הערכות סטטיסטיות. לוקח מעט מדי צמחים לסוג כזה של תוצאות ניתוח שגיאות סטטיסטית גבוהה וכתוצאה מכך בפחות פירושים ברורה של הנתונים.
תודרנית לבנה כבר אורגניזם מודל עבור חוקרי הצמחים של עידן מולקולרית במשך יותר משני עשורים. מספר מאפיינים להפוך נציג קטן זה של משפחת כרוב מועמדת אידיאלית ללימודי גנטית ומולקולרית: יש לו גנום קטן יחסית עם רק חמישה כרומוזומים (בהשוואה למשל טבק tabacum עם 24 כרומוזומים) ו הגנום שלו היה רציף לחלוטין בשנת 20001. לבנה א יכול להיות בקלות מהונדסים גנטית על-ידי זיהום Agrobacterium 2 , והוא נוטה? אפילו האחרון גנטי בכלים כגון CRISPR/Cas3. אף קטן, מחזור הצמיחה הוא מהיר מספיק כדי להפוך ריאלי ביוכימיות ניסויים שבו נדרשת כמות גבוהה יותר של חומר. הצמחים גדלים על פלטות אגר או על הקרקע, יכול אפילו להיות מעובד כמו תרבויות נוזלי4. תודרנית ניתן לגדל בתוך הארונות climatically מבוקרת, למשל של פרסיבל, מיכשור או בחממות. כדי שניתן יהיה להשוות התנהגות גדילה ולנתח פנוטיפים של מוטציות חיוני לספק הדירים בבית באותו זמן גמיש צמיחה תנאים5. בהתאם הבעיה המדעית כדי להתייחס אחד ייתכן שיהיה עליך טמפרטורות שונות, לתנאי תאורה קבועה, עוצמות אור מגוונות או איכויות שונות אור בטמפרטורה זהה. אור הוא פרמטר קריטי מאוד לצמיחה צמח ולמד את השפעתה הוא לעיתים קרובות גישות מגוונות6. כדי להבטיח הפארמצבטית comparability של נתונים המתקבלים זה הכרחי להבטיח פלט יציב ליישם את אותו סוג של מקורות אור.
במקורות אור חממות, מיכשור מורכב אדי נתרן או מנורות פלורסנט, לקדם את גדילת הצמח מספק, אך יש מספר חסרונות. ראשית, הם גיל לאורך זמן אשר משנה את הפלט ספקטרלי לא רק בעוצמתם אלא האיכות (תצפיות עצמו). עם זאת, רק עוצמת בדרך כלל נעשה באופן רציף כך בשינוי איכות האור עלול להבחין בהן אך עדיין יש תופעות משמעותיות. שנית, שני סוגי מנורות לייצר חום בעוצמות אור גבוהות יותר, שהוא עצמו יש השפעה פיזיולוגית עמוקה על צימוח, אולי להסוות כל אפקט תלויות אור. שלישית, הפלט ספקטרלי של מקורות אור אלה הוא מחזוריים, בניגוד גמור את אור שמש טבעי7. יש כבר להתגבר על כל החסרונות האלה במקרה של נוריות)8,9,10,11. יש להם חיים ארוכים עם כמעט בלי שינוי פליטה, לא לייצר פסולת חום בכלל בעוצמות אור גבוהות מאוד והם מאוד גמיש בנוגע תפוקתן ספקטרלי.
כאן אנחנו מדגימים כיצד להגדיר תא אקלימיים ובו נפרד נוריות ה-LED אדום, כחול של אור לבן ופעל פרמטרים שונים של צימוח לאורך זמן. אנחנו מודדים משקל טריים, באזור עלה, צפיפות הפיוניות וביצועים פוטוסינתטיים. במקביל, נדגים את חשיבות הגדרת כהלכה הערכות סטטיסטיות.
הצעד הראשון בלימוד צימוח מקימה תא אקלימיים בהתאם לתנאי הרצוי. הדבר מתבצע בקלות על-ידי הקלדת כל המשתנים בתוך המסכה תוכנית של התוכנה המתאימים (איור 1 א’). בשלב זה, ניתן ליישם שינויים רבים על-ידי שינוי המשטר אור ו/או טמפרטורה. ודא כי כל הזמן לעקוב אחרי הטמפרטורה, לחות ו לתנאי תאורה (איור 2) כדי למנוע כשלים טכניים הורס את הניסוי. זוהי נקודה קריטית להשגת תוצאות לשחזור. למרות זה מציע משתנים רבים ניתן להתאים בגמישות, יש המגבלות. נוריות ה-LED זמין כרגע לא יכולה לחקות אור השמש מאה אחוז, תנאי האקלים בתוך תא אקלים לא לגמרי יכול לשקף את מה קורה מחוץ15.
לעומת שימוש נרחב אורות פלורסנט נורות LED הם מגוונים, צריך פחות אנרגיה ולהציג כמעט אין חום וקרינה. יתרונות אלה הובילו תעשיית גדול של חקלאות מקורה לצייד מיכשור וחממות עם נוריות16. בהתחשב ההצלחות ענק דיווח בתחום זה, הטכניקה LED בוודאי תמצאו הרבה יישומים נוספים.
בעת התבוננות על פנוטיפ, במיוחד עבור קביעת אזור עלה, חשוב לקחת בחשבון כי צמחים בוגרים עלים חפיפה (איור 3). לפיכך, הערכת גרפי רוזטות כולו נוטה להיות מדויק. במקרה הזה, זה הרבה יותר מדויק כדי לחתוך את כל העלים ונמשיך משם.
הערכת התנהגות גדילה והבדלים במיוחד של צמיחה והתפתחות בתנאים שונים תלוי גודל דגימה מספקת. במחקר זה, לפחות שישה צמחים שימשו לקביעת למשל פוטוסינתטיים תשואה (איור 5), משקל טריים (איור 7), ושתל באזור עלה (איור 8A) אבל 30 זרעים בודדים היו בתחילת המחקר כדי להבטיח כי הראשון, מספיקות זרעים לנבוט, שנית, ניתן לבצע בחירה של צמחים “טיפוסי”. אפילו בתוך אותה אוכלוסיה, כלומר צמחים בעציצים יחיד במגש אותו תחת בדיוק את אותם התנאים, הראה פנוטיפים שונים. וזאת לאחר מכן כמובן מתבטא סטיית במהלך ניתוח סטטיסטי, אך הפרשנות של נתונים הוא בדרך כלל אמין יותר כאשר שגיאות קטנות סטטיסטית שנצפו (איור 8 ב’).
מדידת ביצועים פוטוסינתטיים מאת PAM (איור 4, איור 5) יכול להיעשות עבור מספר פרמטרים. במקרה זה, הפוקוס היה על התשואה PSII Y(II) כדוגמה אבל זה ניתן גם לקבוע למשל שכבתה ללא פוטו אטמוספרי, התשואה קוונטית של פיזור אנרגיה מוסדר שאינו מוסדר או הפוגה קלה. חשוב זה כדי לבחור לפחות חמישה AOIs לכל עלה מופץ באופן שווה פני העלה ולמדוד אז לפחות שישה עלים של צמחים שונים. החיסרון של שיטה זו הוא כי אין אפשרות לזהות את כל ההשפעות על PSI; לצורך כך נדרש ציוד שונה.
The authors have nothing to disclose.
יצירות מאשר תמיכה של Rhenac גרין טק AG דרך חלקים של מחקר זה. י. ס, בי בי קיבל מימון DFG (SFB TR175).
Climatic chamber equipped with LED panels | Rhenac Green Tec AG | These chambers are custom made. | |
Spectrometer | OceanOptics | USB-650 | |
Imaging PAM | Walz | IMAGING-PAM M-Series | There are several suitable models depending on the broader use. |
Microscope+ 40x objective | Leica | DM1000 | Other companies also produce suitable microscopes. |
Software ImageJ | Free download from website | ||
Plant RNA extraction kit | Qiagen | 74903 | |
Bioanalyser | Agilent | G2939BA | Needs an additional computer |