यहां, हम संयंत्र के विकास के व्यवहार और विशेष रूप से एक प्रतिलिपि तरीके से phenotypes अध्ययन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम कैसे चर प्रदान करने के लिए और एक ही समय में स्थिर प्रकाश शर्तों पर दिखाते हैं । उचित विश्लेषण पर्याप्त नमूना संख्या और वैध सांख्यिकीय मूल्यांकन पर निर्भर करते हैं ।
संयंत्र जीव अक्सर अपने चुने हुए प्रजातियों के विकास के व्यवहार का निरीक्षण करने की जरूरत है । इस अंत करने के लिए, पौधों की जरूरत है निरंतर पर्यावरण और स्थिर प्रकाश की स्थिति है, जो अधिमानतः चर रहे है मात्रा और गुणवत्ता में इतनी है कि अध्ययन के तहत विभिंन setups आयोजित किया जा सकता है । इन आवश्यकताओं जलवायु प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) रोशनी, जो कर सकते है-फ्लोरोसेंट रोशनी के विपरीत में विशेषता कक्षों से मुलाकात कर रहे है-अलग तरंग दैर्ध्य के लिए सेट हो । एल ई डी ऊर्जा संरक्षण और प्रकाश तीव्रता, जो अक्सर अंय प्रकाश स्रोतों के साथ एक समस्या का गठन पर भी लगभग कोई गर्मी उत्सर्जन कर रहे हैं । प्रस्तुत प्रोटोकॉल कैसे एक जलवायु चर एलईडी रोशनी से सुसज्जित कक्ष कार्यक्रम के लिए एक कदम दर कदम मार्गदर्शन प्रदान करता है के रूप में अच्छी तरह के रूप में विकास phenotypes के गहराई विश्लेषण में के लिए कई दृष्टिकोण का वर्णन । प्रायोगिक तौर पर स्थापित पौधों की विभिंन विशेषताओं के आधार पर देखा और विश्लेषण किया जा सकता है । यहां हम वर्णन कैसे ताजा वजन, पत्ती क्षेत्र, संश्लेषक गतिविधि, और stomatal घनत्व निर्धारित करने के लिए । हम प्रदर्शित करते है कि आदेश में विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने और वैध निष्कर्ष यह सांख्यिकीय मूल्यांकन के लिए व्यक्तियों की एक पर्याप्त संख्या का उपयोग करना अनिवार्य है आकर्षित करने के लिए । उच्च सांख्यिकीय त्रुटियों में विश्लेषण परिणामों के इस प्रकार के लिए भी कुछ पौधों को ले जा रहा है और फलस्वरूप डेटा की कम स्पष्ट व्याख्याओं में ।
Arabidopsis थालियाना अधिक से अधिक दो दशकों के लिए आणविक युग के संयंत्र शोधकर्ताओं के लिए मॉडल जीव किया गया है । कई विशेषताओं ब्रेसिका परिवार के इस छोटे प्रतिनिधि आनुवंशिक और आणविक अध्ययन के लिए एक आदर्श उंमीदवार बनाने: यह केवल पांच गुणसूत्रों के साथ एक अपेक्षाकृत छोटे जीनोम है (24 गुणसूत्रों के साथ निकोटियाना tabacum जैसे की तुलना में) और इसके जीनोम को पूरी तरह २०००१में अनुक्रम किया गया. ए थालियाना आसानी से आनुवंशिक रूप से एग्रोबेक्टीरियम संक्रमण2 द्वारा संशोधित किया जा सकता है और यहां तक कि CRISPR/कैस3के रूप में नवीनतम आनुवंशिक उपकरणों के लिए उत्तरदाई है । हालांकि छोटे, विकास चक्र काफी तेजी से जैव रासायनिक प्रयोगों संभव बनाने के लिए जहां सामग्री की एक उच्च राशि की जरूरत है । पौधों या मिट्टी पर आगर प्लेटें बढ़ने और भी तरल संस्कृतियों4के रूप में खेती की जा सकती है । Arabidopsis जलवायु नियंत्रित अलमारी में उगाया जा सकता है, Percival से उदा , जलवायु कक्षों में या ग्रीनहाउस में । करने के लिए वृद्धि व्यवहार की तुलना और म्यूटेंट के phenotypes विश्लेषण यह प्रतिलिपि प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है और एक ही समय में लचीला विकास की स्थिति5में सक्षम हो । वैज्ञानिक समस्या यह है कि एक अलग तापमान और लगातार प्रकाश की स्थिति की जरूरत हो सकती है पर निर्भर करता है, विविध प्रकाश तीव्रता या एक ही तापमान पर अलग प्रकाश गुण । प्रकाश संयंत्र विकास में एक बहुत ही महत्वपूर्ण पैरामीटर है और इसके प्रभाव अक्सर विविध दृष्टिकोण में अध्ययन किया जाता है6. प्राप्त आंकड़ों की reproducibility और तुलना सुनिश्चित करने के लिए यह एक स्थिर उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है और प्रकाश स्रोतों की एक ही तरह लागू होते हैं ।
ग्रीनहाउस और जलवायु कक्षों में हमेशा की तरह प्रकाश स्रोतों सोडियम वाष्प या फ्लोरोसेंट लैंप, जो संतोषजनक संयंत्र विकास को बढ़ावा देने के कई नुकसान है से मिलकर बनता है । सबसे पहले, वे समय है जो न केवल तीव्रता में, लेकिन गुणवत्ता में (अपनी टिप्पणियों) वर्णक्रमीय उत्पादन परिवर्तन पर उंर । हालांकि, केवल तीव्रता आमतौर पर लगातार इतनी नजर रखी है कि प्रकाश की गुणवत्ता में परिवर्तन का ध्यान नहीं जा सकता है लेकिन अभी भी महत्वपूर्ण प्रभाव है । दूसरा, लैंप के दोनों प्रकार के उच्च प्रकाश तीव्रता, जो खुद को संयंत्र विकास पर गहरा शारीरिक प्रभाव है और किसी भी प्रकाश निर्भर प्रभाव मुखौटा हो सकता है पर गर्मी उत्पंन करते हैं । तीसरा, इन प्रकाश स्रोतों के वर्णक्रमीय उत्पादन चर रहा है और काफी प्राकृतिक सूरज की रोशनी के विपरीत7। इन सभी खामियों को दूर किया गया है एल ई डी के मामले में)8,9,10,11. वे मुश्किल से उत्सर्जन में किसी भी परिवर्तन के साथ एक लंबे जीवनकाल है, बहुत उच्च प्रकाश तीव्रता पर भी बर्बाद गर्मी का उत्पादन नहीं है और वे बहुत अपने वर्णक्रमीय उत्पादन के विषय में लचीला कर रहे हैं ।
यहाँ हम वर्णन कैसे एक जलवायु चैंबर लाल, नीले, और सफेद प्रकाश के लिए अलग एलईडी रोशनी की विशेषता स्थापित करने के लिए और समय के साथ संयंत्र के विकास के विभिन्न मापदंडों का पालन करें । हम ताजा वजन, पत्ती क्षेत्र, stomata घनत्व, और संश्लेषक प्रदर्शन को मापने । एक ही समय में, हम ठीक से सांख्यिकीय मूल्यांकन की स्थापना के महत्व को प्रदर्शित करता है ।
संयंत्र के विकास का अध्ययन करने में पहला कदम वांछित परिस्थितियों के अनुसार जलवायु चैंबर स्थापित कर रहा है । यह आसानी से संबंधित सॉफ्टवेयर (चित्र 1a) के कार्यक्रम मुखौटा में सभी चर टाइपिंग द्वारा किया जाता है । इस चरण में, कई संशोधनों प्रकाश शासन और/या तापमान को बदलने के द्वारा लागू किया जा सकता है । लगातार तापमान, आर्द्रता, और प्रकाश की स्थिति (चित्रा 2) की निगरानी करने के लिए प्रयोग को बर्बाद करने से तकनीकी विफलता को रोकने के लिए सुनिश्चित करें । यह प्रतिलिपि परिणाम प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण बिंदु है । हालांकि इस सेट अप कई चर प्रदान करता है और flexibly समायोजित किया जा सकता है, यह अपनी सीमाएं हैं । वर्तमान में उपलब्ध एलईडी रोशनी सूरज की रोशनी की नकल नहीं कर सकते एक सौ प्रतिशत और एक जलवायु चैंबर के अंदर जलवायु परिस्थितियों पूरी तरह से प्रतिबिंबित क्या नहीं कर सकते है क्या15के बाहर जा रहा है ।
व्यापक रूप से इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट बल्ब एलईडी रोशनी की तुलना में अधिक बहुमुखी हैं, कम ऊर्जा की जरूरत है, और वस्तुतः कोई गर्मी विकिरण दिखाओ । इन लाभों इनडोर खेती के बड़े उद्योग का नेतृत्व किया है के लिए जलवायु मंडलों और ग्रीनहाउस16एल ई डी के साथ सुसज्जित । इस क्षेत्र में सूचना दी विशाल सफलताओं को देखते हुए, एलईडी तकनीक निश्चित रूप से कई और अधिक आवेदन मिल जाएगा ।
जब phenotype देख और विशेष रूप से पत्ती क्षेत्र के निर्धारण के लिए यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि पुराने पौधों में ओवरलैप (चित्रा 3) छोड़ देता है । इस प्रकार, पूरे rosettes के चित्रमय मूल्यांकन के लिए गलत हो जाता है । उस मामले में, यह बहुत अधिक सही करने के लिए बंद सभी पत्तियों में कटौती और वहां से जाना है ।
विकास व्यवहार का मूल्यांकन और विभिन्न स्थितियों के तहत वृद्धि और विकास के विशेष रूप से मतभेद एक पर्याप्त नमूना आकार पर निर्भर करता है. इस अध्ययन में, संश्लेषक उपज (चित्रा 5), ताजा वजन ( चित्रा 7), और पत्ती क्षेत्र (चित्रा ८अ) के निर्धारण के लिए कम से कम छह संयंत्रों का उपयोग किया गया था लेकिन अध्ययन के प्रारंभ में 30 व्यक्तिगत बीजों को लगाया गया ताकि यह सुनिश्चित हो सके यह पहले, पर्याप्त बीज अंकुरित, और दूसरा, “ठेठ” पौधों का एक विकल्प बनाया जा सकता है । यहां तक कि एक ही आबादी के भीतर, यानी सटीक एक ही शर्त के तहत एक ही ट्रे में एकल बर्तन में पौधों, अलग phenotypes दिखाया । यह तो पाठ्यक्रम के सांख्यिकीय विश्लेषण के दौरान मानक विचलन में प्रतिबिंबित है, लेकिन डेटा की व्याख्या आम तौर पर अधिक विश्वसनीय है जब छोटे सांख्यिकीय त्रुटियाँ (चित्रा 8B) मनाया जाता है ।
पाम द्वारा संश्लेषक प्रदर्शन की माप (चित्रा 4, चित्रा 5) कई मापदंडों के लिए किया जा सकता है । इस मामले में, ध्यान PSII उपज पर था Y (द्वितीय) एक उदाहरण के रूप में, लेकिन यह भी गैर-photochemical शमन, विनियमित और गैर विनियमित ऊर्जा अपव्यय या प्रकाश छूट की मात्रा उपज निर्धारित करने के लिए संभव है । यहां महत्वपूर्ण पत्ता सतह के पार समान रूप से वितरित और फिर विभिंन पौधों से कम से कम छह पत्तियों को मापने के प्रति पत्ती का चयन करने के लिए ंयूनतम पांच AOIs है । इस विधि की खामी यह है कि साई पर कोई प्रभाव नहीं पाया जा सकता है; उस प्रयोजन के लिए, विभिंन उपकरणों की जरूरत है ।
The authors have nothing to disclose.
F.S. इस अध्ययन के कुछ हिस्सों के माध्यम से Rhenac ग्रीन टेक एजी से समर्थन स्वीकार करता है । जे और बीएसफ ने DFG (SFB TR175) से फंडिंग प्राप्त की ।
Climatic chamber equipped with LED panels | Rhenac Green Tec AG | These chambers are custom made. | |
Spectrometer | OceanOptics | USB-650 | |
Imaging PAM | Walz | IMAGING-PAM M-Series | There are several suitable models depending on the broader use. |
Microscope+ 40x objective | Leica | DM1000 | Other companies also produce suitable microscopes. |
Software ImageJ | Free download from website | ||
Plant RNA extraction kit | Qiagen | 74903 | |
Bioanalyser | Agilent | G2939BA | Needs an additional computer |