Мы представляем протокол расследовать биомаркеров выражение mRNA надкостницы, полученных клеток (PDC) под воздействием витамина С (витамин C) и 1,25-дигидрокси витамин D [1,25-(OH)2D3]. Кроме того мы оценить способность PDC дифференцироваться в остеоциты, хондроцитов и адипоцитов.
Мезенхимальных стволовых клеток (МСК) присутствуют в различных тканях и может быть дифференцирована в многочисленные типы клеток, в том числе остеобластов. Среди Стоматологическая источники MSCs надкостницы является легко доступной ткани, которая была обнаружена содержать MSCs в слой камбия. Однако этот источник имеет еще не изучены широко.
Было продемонстрировано, что витамин D3 и 1,25-(OH)2D3 стимулировать в vitro дифференцировки МСК в остеобластов. Кроме того витамин С способствует рост клеток формирования и костного коллагена. Однако ни в одном исследовании еще изучается воздействие витамина D3 и витамина С на MSCs.
Здесь мы представляем метод изоляции MSCs от человека надкостницей альвеолярного и проверить гипотезу о том, что 1,25-(OH)2D3 может оказывать osteoinductive влияние на эти клетки. Мы также расследовать присутствие MSCs в человека надкостницей альвеолярного и оценить клеточной адгезии и распространения. Оценить способность витамина С (как элемент управления) и различных концентраций 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8и 10−7 М) для изменения ключа мРНК биомаркеров в изолированные выражение MSCs mRNA щелочной фосфатазы (ALP), кости sialoprotein (BSP), ядро привязки фактор альфа-1 (CBFA1), коллаген-1, и остеокальцин (OCN) измеряются с помощью реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Хотя в последние годы были разработаны многочисленные соответствующие методы, кости реконструкции по-прежнему ограничивается несколько ограничений и оценки степени необходимой реконструкции часто невозможно. Для эстетических и функциональных целей в дополнение к благоприятным долгосрочного успеха требуется увеличение жестких тканей. Методы, обычно используемые для таких процедур включают автогенной и аллогенных костной пластики, xenografting и Аллопластические костной пластикой. Среди различных видов костного трансплантата аутогенная костных имплантатов, считаются наиболее эффективным. Однако доноров сайт заболеваемости, нарушенной кровоснабжения и ограниченные ткани доступности1 были основные недостатки для автогенной костной пластикой. Кроме того аллогенной костных имплантатов и ксенотрасплантатов были связаны с передачи болезни. В настоящее время синтетические костных имплантатов широко используются для решения этих проблем. Однако с их отсутствием Остеогенные потенциал, клинические исходы различались. Материалы, такие как целлюлоза, связанные с колебаниями объема, инфекции и отсутствие силы.
Костной аугментации с помощью тканевой инженерии вызвала значительный интерес. В этой технике мезенхимальных стволовых клеток (МСК) первоначально используются для поощрения остеобластов дифференциация, которая затем пересадили на сайт потери костной массы для достижения кости ремонт. В настоящее время эта процедура применяется в клеточной терапии. Достижения реконструкции кости путем извлечения ограниченное количество ткани проще и менее инвазивные по сравнению с другими методами.
Потенциальная роль MSCs как инструмента на основе ячеек терапии, направленной на стоматологические регенерации является формирующейся интерес среди различных исследовательских групп. Исследования подтвердили, что MSCs может быть продифференцированным от следующих типов тканей: костного мозга, жировой, синовиальной мембраны, перицит, Трабекулярная кость, человека пуповины и тканей зуба в2,3. Общие источники MSCs костного мозга и жировой тканей зуба. По сравнению с MSCs, полученные из жировой ткани и костного мозга, преимущества Стоматологическая стволовых клеток являются доступность и менее заболеваемости после сбора урожая. По сравнению с эмбриональных стволовых клеток, MSCs, производный от зубной ткани появляются nonimmunogenic и не связаны с3сложные этические проблемы.
В 2006 году Международного общества клеточной терапии рекомендуется использование следующих стандартов для определения MSCs: во-первых, должна быть способна крепления пластика MSCs. Во-вторых служба MSCs должна иметь для поверхностных антигенов CD105, CD73 и CD90 положительными и отрицательными для маркеров для моноциты, макрофаги и клетки B помимо гемопоэтических антигены CD45 и CD344. Как последний критерий, MSCs должны быть способны дифференцироваться в следующих трех типов клеток при стандартных условиях в vitro дифференциации:4остеобластов, адипоциты и хондроцитов. На сегодняшний день, были изолированы и характеризуется шесть видов Стоматологическая стволовых клеток человека. Первый тип был изолирован от ткани человека целлюлозы и называется послеродовой пульпы зуба стволовых клеток5. Впоследствии, были изолированы и охарактеризовал три дополнительные виды стоматологических MSCs: стволовые клетки из вспученного молочных зубов6, периодонтальной связки7и апикального сосочка8. Совсем недавно также были определены Стоматологическая фолликула, полученных9, десневой ткани производные10, стоматологическая бутон стволовых cells(DBSCs)11и периапикальных кисты MSCs (hPCy-MSCs)12 .
Фриденштайн был первым, чтобы определить MSCs13. MSCs экспонат высокий потенциал распространения и можно манипулировать, чтобы дифференцировать до трансплантации, который свидетельствует о том, что они являются идеальными кандидатами для регенеративной процедуры10.
Хотя большинство исследований использовали как источник стволовых клеток костного мозга, клетки надкостницы производные (PDC) также были использованы недавно14. Надкостницы является более доступным, чем в костном мозге. Таким образом в этой технике, мы используем надкостницей альвеолярного устранить потребность в дополнительных надрезов во время операции и уменьшить послеоперационный заболеваемости пациентов. Надкостницы является соединительной ткани, который формирует наружной облицовки длинных костей и состоит из двух отдельных слоев: волокнистый слой состоит из15фибробластов, коллагеновые и эластичные волокна и внутренние ячейки богатых камбия слоя в прямой контакт с поверхностью кости. Слой камбия содержит смешанные клетки населения, главным образом фибробластов16, остеобласты17, pericytes18и критических субпопуляция, определены как MSCs19,,2021. Большинство исследований сообщили, что PDC сопоставимых, если не превосходит, костного мозга, полученных стволовых клеток (bMSCs) в кость заживление и регенерацию22,23,24. Надкостницы легко доступен и демонстрирует отличную эффективность регенерации. Однако несколько исследований были сосредоточены на надкостницы25,,2627.
Относительно кости ремонт текущий клинической практике предполагает трансплантации периостальная прогениторных клеток усиливается в рамках поддержки подмостей. Недавние исследования были сосредоточены на приобретении стволовых клеток в дефектных регионах и используя клетки-предшественники для регенерации ткани20. Стоматологи также предвидеть будущее применение пародонтальных костной регенерации в лечение пародонта и зубных имплантатов. Относительно донора сайта надкостницы могут быть легко собраны общие зубной хирургов. Это выгодно против стромальных клеток костного мозга, как надкостнице могут быть доступны во время рутинной челюстно-лицевой хирургии. Таким образом цель данного исследования – создать протокол для уборки PDC и для оценки морфологии, привязанности, жизнеспособность и распространения стволовых клеток человека надкостницы.
Метаболиты витамина D влияет на динамического равновесия в vivo кости минеральные. Одно исследование сообщало, что 24R,25-(OH)2D3 активная форма витамина D имеет важное значение для osteoblastic дифференциация человека MSCs (использования)28. Кость гомеостаза и ремонт регулируются сети3 метаболитов витамина D, из которых 1,25-(OH)2D3 (кальцитриола) является наиболее биологически активных и соответствующие в регулировании здоровья костей. Витамин D3 имеет важное значение для кальцификации29. В одном исследовании с использованием 2-d старый Куньмин белых мышей embryoid органов в мышей указал, что витамин С и витамин D добавки эффективно способствует дифференциации ESC-производные остеобластов30. Среди его биологической деятельности 1,25-(OH)2D3 стимулирует дифференциация в vitro использования остеобластов, которые могут контролироваться исходя из увеличения активность фермента щелочной фосфатазы (ALP) или OCN гена выражение.
Несколько исследований обнаружили доза-ответная реакция комбинированного лечения с витамином С и 1,25-(OH)2D3 человека PDC с особым упором на кости тканевой инженерии. Таким образом в этом исследовании, мы изучить оптимальные концентрации для одного или комбинированного лечения 1,25-(OH)2D3 и витамина С для стимулирования Остеогенные дифференциация человека PDC. Целью настоящего Протокола является определить, содержит ли популяции клеток, изолированных от стоматологических альвеолярного надкостницы ячейки с MSC фенотипа и ли эти клетки могут быть расширены в культуре (в пробирке) и дифференцированной сформировать желаемый ткани . Кроме того мы оценить способность PDC дифференцироваться в остеоциты, хондроцитов и адипоцитов. Вторая часть исследования оценивает эффекты витамина C и 10−10, 10−9, 10−8и 10−7 1,25-(OH) М2D3 на Остеогенные активность PDC. Основная цель этого исследования заключается в оценке функции витамина С и 1,25-(OH)2D3 во время osteoblastic дифференциация PDC ALP активности, и про Остеогенные генов, например, ALP, коллаген-1, OCN, BSP и CBFA1. Кроме того это исследование определяет условия оптимального osteoinductive для человека PDC, основываясь на этих выводах.
Недавно разработанные терапевтические модальности, а именно ткани инженерных, влекущее за собой MSCs, имеет многочисленные преимущества. MSCs, которые присутствуют в нескольких типов тканей, являются Multipotent с клетки, которые могут дифференцироваться в различных функциональных mesodermal ткан?…
The authors have nothing to disclose.
Протокол исследования был одобрен Советом по рассмотрению институциональных для клинических исследований из Чжан Гун Мемориальный госпиталь (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, C 102-1619, 101-4728B и 103-4223C). Это исследование было поддержано Чжан Гун Мемориальный госпиталь (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 и NMRPG3C0151). Этот манускрипт был отредактирован Уоллес академических редактирования.
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt | Sigma | 49752 | |
35-mm culture dishes | Corning | 430165 | |
3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
6 well plate | Corning | 3516 | |
Alkaline phosphatase | ABI | Hs01029144_m1 | |
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit | BioVision | K412-500 | |
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase | Roche | 10109118001 | |
CD146 | BD | 561013 | |
CD19 | BD | 560994 | |
CD34 | BD | 560942 | |
CD44 | BD | 561858 | |
CD45 | BD | 561088 | |
CD73 | BD | 561014 | |
CD90 | BD | 561974 | |
Cell banker1 | ZEAOAQ | 11888 | |
core binding factor alpha-1 | ABI | Hs00231692_m1 | |
dexamethasone | Sigma | D4902 | |
DPBS | Gibco | 14190250 | |
FBS | Gibco | 26140-079 | |
GAPDH | ABI | Hs99999905_m1 | |
HLA-DR | BD | 562008 | |
indomethacin | Sigma | I7378 | |
insulin | sigma | 91077C | |
insulin–transferrin–selenium-A | Sigma | I1884 | |
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) | Life | 4346907 | |
MicroAmp optical adhesive film | Life | 4311971 | |
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification | HyClone | SH30265.02 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333-56 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
STRO-1 | BioLegend | 340103 | |
SYBER Green PCR Master Mix | AppliedBiosystems | 4309155 | |
TaqMan Master Mix | Life | 4304437 | |
transforming growth factor-β | Sigma | T7039 | |
Trizol reagent (for RNA isolation) | Life | 15596018 | |
β-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
collagen-1 | Invitrogen | forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3 | |
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3' | |||
OCN | Invitrogen | forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3' | |
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3' | |||
BSP | Invitrogen | forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3' | |
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3' | |||
Commercial ALP primers | |||
Commercial CBFA1 primers |