Summary
אנו מציגים פרוטוקול לחקור את סמנים ביולוגיים של mRNA ביטוי של קרום העצם, נגזר תאים (שיתפקדו) הנגרמת על ידי ויטמין C (ויטמין C), 1,25-dihydroxy ויטמין D [1,25-(OH)2D3]. בנוסף, נוכל להעריך את היכולת של בקר קבוצת מחשבים ראשי להבדיל לתוך osteocytes, chondrocytes ו- adipocytes.
Abstract
גזע mesenchymal (MSCs) קיימים במגוון של רקמות, יכול להיות מובחן סוגי תאים רבים, לרבות תאי העצם. בין מקורות שיניים MSCs, קרום העצם היא רקמה נגיש בקלות, אשר זוהה להכיל MSCs בשכבה cambium. עם זאת, מקור זה לא כבר נרחב נחקרה.
ויטמין D3 ו- 1,25-(OH)2D3 הוכחו לעורר במבחנה הבידול של MSCs לתוך תאי העצם. בנוסף, ויטמין C מסייע צמיחת תאים היווצרות ועצם קולגן. עם זאת, אף מחקר עדיין חקרה את ההשפעות של ויטמין D3 וויטמין C על MSCs.
כאן, אנו מציגים שיטה אנליטית MSCs מן האדם קרום העצם מכתשיים לבחון את ההשערה כי 1,25-(OH)2D3 לנצל השפעה osteoinductive על תאים אלה. אנו גם לחקור את הנוכחות של MSCs ב קרום העצם מכתשיים אנושי, להעריך אדהזיה לתאי גזע והתפשטות. כדי להעריך את היכולת של ויטמין C (כמו פקד), ריכוזים שונים של 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8ו 10−7 מ') לשנות מפתח סמנים mRNA הביטוי מבודד MSCs mRNA של phosphatase אלקליין (ALP), עצם sialoprotein (BSP), ליבה מחייבת גורם אלפא-1 (CBFA1), קולגן-1 ואוסטאוקלצין (OCN) נמדדים באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת (RT-PCR).
Introduction
למרות אינספור טכניקות הרלוונטיים פותחו בשנים האחרונות, עצם שחזור נותר מוגבל על-ידי אילוצים מרובים ולאחר הערכת שמידת השחזור נחוץ לעתים קרובות בלתי אפשרי. רקמה קשה הגדלת נדרשת כדי להשיג את המטרות אסתטי ופונקציונלי בנוסף שיעור הצלחה לטווח ארוך חיובית. שיטות משמש בדרך כלל הליכים כאלה כוללים בעזרת השתלת עצם autogenous, allogenic, האורתופדיה אלופלסטי בעזרת השתלת עצם. בין סוגים שונים של עצם, שתלי עצם autogenous נחשבים היעיל ביותר. עם זאת, תחלואה האתר התורם vascularity פרוץ, רקמות מוגבל זמינות1 כבר החסרונות העיקריים עבור בעזרת השתלת עצם autogenous. בנוסף, שתלי עצם allogenic ו- xenografts קושרו עם העברת מחלות. כיום, שתלי עצם סינתטי נמצאים בשימוש נרחב כדי לפתור בעיות אלה. עם זאת, עם פוטנציאל osteogenic חוסר שלהם, התוצאות הקליניות יש מגוונות. חומרים כגון תאית משויכות תנודות נפח זיהום, חוסר כוח.
בניית עצם באמצעות הנדסת רקמות יצר עניין רב. בטכניקה זו, גזע mesenchymal (MSCs) בתחילה משמשים כדי לקדם אוסטאובלסט בידול, אשר מושתלים ואז לאתר של איבוד העצם כדי להשיג את עצם תיקון. הליך זה מוחל כרגע בטיפול תא. השגת שיקום העצם על-ידי חילוץ כמות מוגבלת של רקמות היא פשוט פחות פולשני לעומת שיטות אחרות.
התפקיד הפוטנציאלי של MSCs ככלי מבוססת תא טיפולים מכוון התחדשות שיניים הוא עניין המתעוררים בקרב קבוצות מחקר שונות. מחקרים אישרו כי ניתן להבחין MSCs מן הסוגים הבאים של רקמות: מח עצם, אדיפוז, synovial ממברנה, pericyte, עצם trabecular, הטבור אנושי ו-2,רקמות שיניים3. מקורות נפוצים של MSCs כוללים מח עצם, רקמת שומן ברקמות שיניים. לעומת MSCs נגזר רקמת שומן, מח עצם, היתרונות של תאי גזע שיניים הם נגישות קלה ותחלואה פחות קטיפתו. לעומת תאי גזע עובריים, MSCs נגזר רקמות שיניים מופיעים nonimmunogenic, אינם משויכים דאגות אתיות מורכבות3.
בשנת 2006, האגודה הבינלאומית נייד טיפול מומלץ שימוש בתקנים הבאים כדי לזהות MSCs: ראשית, MSCs חייב להיות מסוגל הצמדת פלסטיק. שנית, MSCs חייבת להיות חיובית עבור אנטיגנים משטח CD105, CD73 ו- CD90 ושלילית עבור הסמנים ומונוציטים, מקרופאגים, תאי B בנוסף אנטיגנים hematopoietic CD45 CD344. כקריטריון הסופי, MSCs דרושה היכולת להתמיין שלושת הסוגים הבאים של תאים בתנאים סטנדרטיים של בידול במבחנה : תאי העצם, adipocytes ו- chondrocytes4. עד היום, שישה סוגים של תאי הגזע האנושי שיניים יש כבר מבודד ו מאופיין. הסוג הראשון שבודד רקמה אנושית זולה, כינה זולה שיניים כמחנכת תאי גזע5. לאחר מכן, שלושה סוגים נוספים של MSCs שיניים יש מבודד, המאופיינת: תאי גזע של השיניים נשירים exfoliated6, חניכיים רצועה7ו- papilla הפסגה8. לאחרונה, שיניים נגזר זקיק9, נגזר רקמת חניכיים10, ניצן שיניים גזע cells(DBSCs)11וציסטה periapical MSCs (hPCy-MSCs)12 גם זוהו.
Friedenstein היה הראשון להגדיר MSCs13. MSCs התערוכה פוטנציאל גבוה בתי־ספר, אפשר לגרום להם להבדיל לפני להיות מושתלים, מה שמרמז כי הם מועמדים אידיאליים עבור תהליכי הרגנרציה10.
למרות רוב המחקרים יש להשתמש במח העצם כמקור של תאי גזע, תאי נגזר קרום העצם (שיתפקדו) היו גם בשימוש לאחרונה14. קרום העצם נגיש בקלות רבה יותר מאשר הוא במח העצם. לכן, בטכניקה זו, אנו משתמשים קרום העצם מכתשיים כדי לבטל את הצורך חתכים נוספים במהלך הניתוח וכדי להקטין תחלואה postsurgical בחולים. קרום העצם היא רקמת החיבור טפסים הציפוי החיצוני של עצמות ארוכות, ומורכב משתי שכבות נפרדות: סיבי השכבה החיצונית המורכבת fibroblasts, קולגן וסיבים אלסטיים15, השכבה הפנימית עשיר תא cambium במגע ישיר עם משטח העצם. השכבה cambium מכיל אוכלוסיה לתא מעורב, בעיקר fibroblasts16, תאי העצם17, pericytes18ו subpopulation קריטי מזוהה MSCs19,20,21. רוב המחקרים דיווחו כי שיתפקדו דומים, אם לא עדיפה, על הנגזרות מח העצם בתאי גזע (bMSCs) עצם ריפוי והתחדשות22,23,24. קרום העצם נגיש בקלות ותערוכות האפקטיביות משובי מעולה. עם זאת, מחקרים מעטים התמקדו26,25,27קרום העצם.
לגבי עצם תיקון, ונוהגין קליניים כרוך את השתלת של חידוש ובתאים מוגבר בתוך פיגומים תומכת. המחקרים האחרונים התמקדו רכישת תאי גזע באזורים הפגומים ונקיטה ובתאים התחדשות רקמות20. רופאי שיניים צופים גם יישומים עתידיים של התחדשות העצם חניכיים, טיפולי חניכיים, שתלים דנטליים. לגבי האתר התורם, קרום העצם ניתן בקלות לקצור על ידי מנתחים שיניים כללית. זה משווה לטובה נגד מח סטרומה תאים, כמו קרום העצם ניתן לגשת במהלך ניתוח אוראלי שגרתית. לפיכך, מטרת מחקר זה היא להקים עבור קציר שיתפקדו פרוטוקול להעריך את המורפולוגיה, קובץ מצורף, הכדאיות ואת התפשטות תאי גזע אנושי קרום העצם.
ויטמין D מטבוליטים להשפיע על ויוו עצם-מינרליים שיווי משקל דינמי. מחקר אחד דיווח 24R,25-(OH)2D3 הטופס הפעיל של ויטמין D אינו חיוני הבידול osteoblastic של MSCs (hMSCs) אנושי28. עצם הומאוסטזיס ותיקון מוסדרים על ידי רשת של מטבוליטים3 ויטמין D, של איזה 1,25-(OH)2D3 (קלציטריול) הוא פעיל ביותר מבחינה ביולוגית, הרלוונטי בוויסות בריאות העצם. ויטמין D3 חיונית הסתיידות29. במחקר אחד שימוש בעכברים קונמינג לבן בן d-2, הגופים embryoid בעכברים ציינו כי תוספי ויטמין C, ויטמין D באופן יעיל קידם את הבידול של תאי העצם ESC-derived30. בין שלה פעילויות ביולוגיות נוספות, 1,25-(OH)2D3 מעוררת את הבידול במבחנה של hMSCs על תאי העצם, אשר ניתן לנטר מבוסס על הגדלת פעילות האנזים אלקליין פוספטאז (ALP) או OCN ג'ין ביטוי.
מחקרים מעטים גילו קשר מנה-תגובה של טיפולים בשילוב עם ויטמין C ו 1,25-(OH)2D3 ב שיתפקדו האנושי עם דגש מיוחד על הנדסת רקמות העצם. לפיכך, במחקר זה, אנו בוחנים את ריכוז אופטימלי לטיפול יחיד או בשילוב של 1,25-(OH)2D3 , ויטמין C להשראת הבידול osteogenic של האדם שיתפקדו. המטרה של פרוטוקול זה היא כדי לקבוע אם אוכלוסיה תא מבודד קרום העצם מכתשיים שיניים מכיל תאים בעלי פנוטיפ של MSC, תאים אלה יכול להיות מורחבת בתרבות (במבחנה) ואם הבדיל כדי ליצור את הרקמה הרצויה . בנוסף, נוכל להעריך את היכולת של בקר קבוצת מחשבים ראשי להבדיל לתוך osteocytes, chondrocytes ו- adipocytes. החלק השני של המחקר בוחן את ההשפעות של ויטמין C ו 10−1010−9, 10−8, 10−7 מ' 1,25-(OH)2D3 על הפעילות osteogenic של בקר קבוצת מחשבים ראשי. המטרה העיקרית של מחקר זה הוא להעריך את הפונקציות של ויטמין C ו- 1,25-(OH)2D3 במהלך הבידול osteoblastic של שיתפקדו על ידי פעילות ALP, גנים פרו-osteogenic, כגון ALP, קולגן-1, OCN, BSP ו- CBFA1. בנוסף, מחקר זה קובע את התנאים osteoinductive האופטימלי עבור שיתפקדו אנושי על בסיס ממצאים אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול המחקר אושרה על ידי המוסדיים סקירה לוח של צ'אנג קונג ממוריאל החולים. כל המשתתפים מסופקים בכתב הסכמה מדעת.
1. רקמות הכנה
- הקציר חידוש רקמות מחולים במהלך ניתוח שיניים (איור 1). לאחר הרהור דש בהרדמה מקומית, קחי פיסה של רקמת קרום העצם העצם מכתשיים באמצעות מפריד חידוש31.
- לאחר הקטיף, לאחסן את הפרוסות חידוש רקמות של 5 מ מ × 2 מ מ מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS) עם U/mL 300 של פניצילין, 300 מ"ג/מ"ל של סטרפטומיצין. העברת הרקמות למעבדה תוך 24 שעות.
- מינצ השברים מכתשי חידוש רקמות עם אזמלים עד טחון היטב ולשמור את הדגימות מעבר 0 בינוני (מורכב של U/mL 300 של פניצילין 300 מ"ג/מ"ל של סטרפטומיצין, α-מ 5% סרום שור בעובר [FBS]) תרבותי בתוך אינקובטור ב 37 ° C עם humidified האוויר (5% פחמן דו-חמצני). בחממה, להכין קערה מים כדי לשמור על לחות.
- לשנות את המדיום לאחר 3 ימים פעמיים בשבוע לאחר מכן.
- כאשר התאים הגיעו subconfluence (80%), לשחרר את התאים חסיד עם 200 µL של 0.25% טריפסין בחממה (37 מעלות צלזיוס) למשך 3 דקות, ולאחר מכן השתמש 4.5 מ של המדיום כדי לסיים את התגובה.
- צלחת התאים שוב מעבר טרי 1 בינוני (α-מ, 10% FBS, 100 יחידות/mL פנצילין ולאחר μg/mL 100 של סטרפטומיצין). צלחת הוא 5 × 103 תאים (לפי ספירת של hemocytometer).
- לבצע כל קטע עוקבות אחרי התאים להשיג למפגש 80%31.
הערה: בראשית, המדיום יהיה כתום אדום. לאחר שלושה ימים בערך, צבע בינוני אמור להשתנות בגוון צהבהב. הפעם הכפלה של התאים הוא בערך 30-40 h, הזקוקים 7 ימים במשך 3-5 דורות. - תרבות שיתפקדו מבודדים בα-מ בתוספת 10% FBS, U/mL 100 של פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל של סטרפטומיצין בתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
- להתבונן צמיחת תאים מדי יום ולהחליף את מדיום הגידול פעמיים בשבוע. השתמש כדי החמישית-הדור השלישי תאים לניסויים נוספים.
2. דנ
- קציר 1 × 106 תאים דרך מערכת העיכול טריפסין:
- להוסיף 200 µL של טריפסין 0.25%. לאחר 3 דקות, השתמש 4.5 מ של תרבות בינוני המכיל FBS כדי לסיים את התגובה של טריפסין ולאסוף באמצעות צנטריפוגה (1500 סל ד, 5 דקות, 22 ° C).
- לשטוף את כדורי תא שלוש פעמים באמצעות 1 x DPBS. Resuspend תאי µL 200 1 x מאגר permeabilization. לספור את התאים עם hemocytometer.
- לבחון את סמני פני ביטוי הביע של שיתפקדו דרך לזרום cytometry (תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון)32. להשתמש נוגדנים חד-שבטיים (MAb) נגד CD19 (fluorescein isothiocyanate (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (Phycoerythrin [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (PE) ותזמורת כלי קשת-1 (אלכס), ד ר הלע (FITC)32.
- הוסף את הנוגדנים דגימות והתרבות בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- לשטוף את התאים עם 1 x DPBS שלוש פעמים.
- לתקן את התאים באמצעות 2% פורמלדהיד והמשך עם ניתוח cytometry זרימה32.
3. תא המצורף ואת הכדאיות עם Osteogenic, Adipogenic ו Chondrogenic בידול
זירוז התמיינות התאים לתוך osteogenic, adipogenic, ו chondrogenic שושלות מאת culturing חידוש התאים כל שלושה מעברים על שש-ובכן צלחות עם מדיה התמיינות ספציפיים.
- עבור בידול osteogenic, התרבות התאים α-מ ב צפיפות של תאים 5000 לכל טוב על צלחות תרבות שש-. טוב.
- על השגת 80% הנהרות, התרבות התאים המדיה המכילה α-גברתי, 5% FBS, β-glycerophosphate (10 מ מ),−7 M 10 דקסמתזון (0.1 מ מ), ו- 5 מ ל חומצה אסקורבית (100 אמ). תרבות הפקד שליליים בתקשורת בהיקף של α-מ ו-5% FBS.
- לשנות את המדיה פעמיים בשבוע.
- לאחר 4 שבועות, להעריך את הפוטנציאל של התאים כדי להתמיין השושלת osteogenic על ידי מכתימה את התאים באמצעות וזמינותו של פון Kossa, המפרידה הנוכחות של הפקדות מסויד ב תרבות33.
- להוסיף 10% פורמלין לתיקון. בתוך 30 דקות, להוסיף 5% כסף חנקתי, להתייחס מתחת לאור אולטרה סגול (UV) לשעה בטמפרטורת החדר.
- להוסיף נה 5%2כדי4 ארבע פעמים, המאפשר 3 דקות על כל תגובה. לבסוף, יש לשטוף את התאים פעמיים עם מים מזוקקים.
הערה: פון Kossa מכתים הוא תגובה משקעים איפה יוני כסף ואנטיביוטיקה פוספט מגיבים בנוכחות חומר חומצי; טכניקה מכתימים זו אינה ספציפית סידן. במחקר זה, כאשר התאים ובדוקים שטופלו כסף חנקתי פתרון, סידן — אשר הוא מופחת על ידי אור UV חזקה – הוחלף על ידי כסף, אשר הפך גלוי כמו כסף מטאלי.
- עבור בידול adipogenic, התרבות התאים-צפיפות של תאים 5000 לכל טוב על לוחות שש-ובכן תרבות המכיל α-מ.
- על השגת 80% הנהרות, התרבות התאים המדיה המכילה α-מ, 5% FBS, 0.5 מ מ 3-איזובוטיל-1-methylxanthine (100 מ"ג/מ"ל), 1% פניצלין 10 דקסמתזון−6 מ' (1 מ מ) אינסולין (5 מ"ג/מ"ל), indomethacin (60 מ מ).
- תרבות הפקד שליליים בתקשורת בהיקף של α-מ ו-5% FBS.
- לאחר 6-9 שבועות, להשתמש בשמן O אדום כדי להכתים את התאים להדגיש טיפות שומנים בדם, ובכך לקביעת הנוכחות של בידול adipogenic33:
- להוסיף 10% פורמלין לתיקון. בתוך 30 דקות, מכתים התאים עם 0.5% שמן אדום O בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 60% אלכוהול איזופרופיל למשך 3 דקות בכל פעם; לבסוף, יש לשטוף את התאים עם מים מזוקקים.
הערה: שמן אדום O הוא lysochrome (מסיס בשומן) diazo צבע המשמש עבור צביעה של שומנים נייטרלי, בעיקר אסטרים triacylglycerol ליפופרוטאין, כולסטרול. לצבוע מתמוסס ב טיפות השומנים בתא, מאדימה את טיפות השומנים.
- להוסיף 10% פורמלין לתיקון. בתוך 30 דקות, מכתים התאים עם 0.5% שמן אדום O בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 60% אלכוהול איזופרופיל למשך 3 דקות בכל פעם; לבסוף, יש לשטוף את התאים עם מים מזוקקים.
- עבור chondrocyte בידול, התרבות תאים על לוחות שש-ובכן תרבות עם כל טוב המכיל תאים 5000.
- להוסיף על בידול בינוני שמכילים α-מ 5% FBS,−7 M 10 דקסמתזון (0.1 מ מ), נתרן פירובט (100 µg/mL), אינסולין-transferrin-סלניום-A (1 × ITS), הפיכת גורם גידול-β (10 ng/mL), 5 מ ל חומצה אסקורבית (100 מיקרומטר).
- תרבות הפקד שליליים בתקשורת בהיקף של α-מ ו-5% FBS.
- אחרי 4-5 שבועות, להשתמש Alcian כחול מכתים כדי להדגיש את פוליסכרידים חומצי, כגון glycosaminoglycans או סוגים מסוימים של mucopolysaccharides, ב- הסחוס של התאים כדי לקבוע הנוכחות של בידול chondrocyte33.
- להוסיף 10% פורמלין לתיקון. בתוך 30 דקות, להוסיף 3% חומצה אצטית ולאפשר 2 דקות בשביל התגובה. לאחר מכן, לשטוף עם מים מזוקקים שלוש פעמים, להוסיף 1% Alcian כחול 8GX הדגירה במשך 30 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים. לבסוף, להוסיף 3% חומצה אצטית ושטוף במשך 3 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים לסיים.
הערה: חלקי התא במיוחד כתם על ידי זה דיי להיות כחול עד כחול-ירוק אחרי מכתים, והם נקראים "alcianophilic".
- להוסיף 10% פורמלין לתיקון. בתוך 30 דקות, להוסיף 3% חומצה אצטית ולאפשר 2 דקות בשביל התגובה. לאחר מכן, לשטוף עם מים מזוקקים שלוש פעמים, להוסיף 1% Alcian כחול 8GX הדגירה במשך 30 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים. לבסוף, להוסיף 3% חומצה אצטית ושטוף במשך 3 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים לסיים.
4. השפעות של 25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2יח3) על פרכת
- לפצל את P3 כדי שיתפקדו P5 שש קבוצות ותרבות על 6-ובכן צלחות עם מדיה תרבות שונים:
- קבוצת שלילי (α-מ ו-5% FBS);
- קבוצת ויטמין C (α-מ 5% FBS, 10 מ מ β-glycerophosphate, דקסמטסון 10−7 ז + 100. ויטמין C);
- וקבוצה 10−7 M 1,25-(OH)2D3 (α-מ, 5% FBS, 10 מ מ β-glycerophosphate, ואת דקסמתזון מ'−7 10 + 10−7 M 1,25-(OH)2יח3).
- להוסיף 2 מ"ל של המדיום באינקובטור (37 מעלות צלזיוס) כל טוב ושנה המדיום פעמיים בכל שבוע.
5. הפוך תמלול/כמותי תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת
- לאחר d 7 אוסטאובלסט בידול, לבודד את הרנ א הכולל על קרח באמצעות תגובה כימית המסחרי (ראה טבלה של חומרים):
- להוסיף 1 מ"ל של ריאגנט בידוד כל טוב. להוסיף 200 µL של bromochloropropane להשאיר 10 דקות ליצירת RNA בשכבות ולאחר מכן צנטריפוגה-במהירות של 10,000 סל ד למשך 15 דקות ב 4 º C.
- לאחר צנטריפוגה, להוסיף 500 µL של 2-פרופנול µL 500 של RNA המכיל supernatant. לזרז את הרנ א על הקרח ולאפשר 15 דקות עבור התגובה.
- לאחר הניתוח, צנטריפוגה-12,000 סל"ד למשך 15 דקות ב 4 ° C, לאחר מכן הרנ א ממוקם בתחתית הצינורית. לאחר מכן, להסיר את תגובת שיקוע באמצעות 1 מ"ל של 75% אלכוהול לרחצה, צנטריפוגה-7,500 סל"ד למשך 8 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס.
- הסר את תגובת שיקוע ולהשתמש concentrator ואקום לייצור RNA מהחלק התחתון של הנוזל. לשחזר עם מים.
- הפוך לתמלל את הרנ א (1 μg) באמצעות myeloblastosis העופות וירוס רוורס טרנסקריפטאז. קבע את תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) לפעול ב 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ואחריו 50 ° C עבור 60 דקות ולאחר מכן 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, לפני שמירה לבסוף ב 4 º C.
- לסנתז הראשון-גדיל DNA משלימים (cDNA). לבצע PCR כמותי (qPCR) באמצעות 5 μL של 1:10 מדולל cDNA. התנהלות RT-PCR כמותי (לרביעיית-PCR) באמצעות תחל ALP, BSP, OCN, CBFA1 של קולגן-1.
הערה: כדי למנוע זיהום דנ א י, רצפי ואחורה כל פריימר עוצבו על exons נפרדים. - לבצע qPCR באמצעות תבנית בסיס PCR מסחרי לערבב (ראה טבלה של חומרים) בהתאם להוראות היצרן. הגדר הצנטרפוגה תרמי ב 50 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות ולאחריו 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן 40 מחזורי כל אחד ב- 95 ° C 15 s ולאחריו 60 ° C 60 s.
הערה: פרוטוקול SYBR גם דורש שלב עקומת להמיס, אשר מנוהלת ב 95 ° C 15 s, 60 ° C 60 s ולאחר מכן 95 ° C 15 s. - לנרמל את ערכי הסף מחזור ALP, BSP, CBFA1, קולגן-1, ו- OCN לזה של הגן משק בית GAPDH. 34
- פריימר זוגות מפורטים בטבלה של חומרים.
6. פעילות פוספטאז אלקליין
- להעריך את פעילות האנזים ALP של התאים באמצעות טכניקה שתואר לעיל35, אשר ממירה p- nitrophenyl פוספט p- nitrophenol; p- nitrophenyl פוספט הוא מצע פוספטאז הופך צהוב כאשר dephosphorylated על ידי ALP, כפי שנקבע ב 405 ננומטר אורך גל. לנרמל את הסיכום p- nitrophenol נוצר בהתבסס על החלבון הכולל כפי שנקבע על ידי וזמינותו ברדפורד.
- להשוות בין הפעילויות ALP של הפקד (α-גברתי, 5% FBS), ויטמין C (α-גברתי, 5% FBS, 10 מ מ β-glycerophosphate, דקסמטסון 10−7 ז + 100 אמ ויטמין C), 1,25-(OH)2D3 (α-מ, 5% FBS, 10 מ מ β-glycerophosphate, 10−7 M דקסאמתאזון + 10−8 M 1,25-(OH)2יח3), ו ויטמין C +2D 1,25-(OH)3 (α-גברתי, 5% FBS, 10 מ מ β-glycerophosphate, דקסמטסון 10−7 ז + 100 אמ ויטמין C +1,25-(OH)2יח3) קבוצות אחרי שבוע 1, 2, 3, ו 4 של תרבות.
- לבצע הליך שאיבת חלבון קרח:
- לגרד את התאים מן הלוחות 6-ובכן ולהוסיף 50 µL פירוק המאגר. כתוצאה מכך, במקום התאים על הקרח למשך 30 דקות להשמיד את התאים חינם החלבון.
- לאחר 30 דקות, צנטריפוגה-13000 סל ד ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר צנטריפוגה, לחלץ את תגובת שיקוע עבור אחסון ושימוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עבור כל מבחני כמותית, הנתונים מוצגים כמו הממוצע ± סטיית התקן (SD). כל ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות הסטודנט t-מבחן. בסך הכל, דגימות 34 התקבלו עם המשתתף שהגיל 48.1 ± 12.3 י' 11 הדוגמאות הללו התקבלו חולים זכר ו- 23 של המטופלות. עשרים ושמונה דגימות, התקבלו האזורים טוחנת ושישה מאזורים הקדמי; 26, התקבלו את הלסת העליונה ו- 8 של הלסת התחתונה. משך רעה בין ההליך שיניים התרבות היה 0.5 ± 0.1 h. של הדגימות ובדוקים 34, 20 הניב בהצלחה מושבות MSC, עם שיעור הבידוד מוצלח של 58.8%. אין הבדלים משמעותיים נצפו בכל הפרמטרים בין בהצלחה ולא את שיתפקדו מבודדת ללא הצלחה (גיל ממוצע: ± 48.8 13.0 לעומת 47.1 ± 11.5 y, סקס: 7 גברים [35%] לעומת 4 גברים [28.6%], מיקום: 15 מאזורים טוחנת [75] לעומת 13 [92.9%] ו- 15 מ הלסת העליונה [75] לעומת 11 [78.6%], בהתאמה).
תא בידוד, מורפולוגיה: Osteogenic, chondrogenic, adipogenic והבדלה
ימים 1-9, שיתפקדו הקימו מושבות ואשכולות כדורית. רוב התאים הציג מראה ציר, היו הומוגניות במיקרוסקופ ניגוד שלב (איור 2). לאחר 14d של תרבות, המורפולוגיה תא הופיע פלך בצורת כפי שנצפו תחת המיקרוסקופ שלב-ניגודיות. בעקבות תאי דור ראשון, כבר לא התאים גדל אשכולות אבל הציג התפשטות אחידה נרחבות.
MSCs היו בצורת כישור עם תהליכים לא סדיר, מחובר היטב להמנה תרבות לאחר 1-3 d של ראשי תרבות (איור 2 א). התרבות הראשונית הציג קטן, עגול תאים ותאים בצורת כישור תחת מיקרוסקופ אופטי. התאים בתרבית הציג צורה הומוגנית, פיברובלסט דמוי פלך מן המעבר הראשון (איור 2 א). המחקר בידול חשף כי שיתפקדו יכול להיות subpassaged, הבדיל במבחנה לתוך תאי העצם (איור 2b), chondrocytes (איור 2 c) ו adipocytes (איור דו-ממדי).
בסוף הבידול osteogenic, פון Kossa מכתים מצביעות על הימצאות פיקדונות סידן ובידול osteogenic (איור 2b). תוצאות אלו בחום ציינו כי בקרב אוכלוסיות חידוש תאים, ובתאים בעלי פוטנציאל להבדיל לתוך התאים osteogenic.
כדי להעריך את הייצור של proteoglycans, Alcian כתם כחול שימש אינדיקטור לקביעת הנוכחות של בידול chondrocyte (איור 2 c). התאים הבדיל בהצלחה לתוך chondrocytes. תוצאות אלה הציע כי בקרב אוכלוסיות חידוש תאים, ובתאים בעלי פוטנציאל להבדיל לתוך התאים chondrogenic.
התאים היו תרבותי בתקשורת ספציפי כאמור לעורר adipogenic בידול. לאחר 8 שבועות, שמן אדום ש-o שימש כדי להבחין בקיומה של ליפידים תאיים. הבאים מכתים, תאיים שומן מיקרוסקופיים טיפות נצפו בדגימות הבדיל חמש (איור דו-ממדי).
ניתוח תזרים cytometric סמן משטח הביטוי עבור בקר קבוצת מחשבים ראשי
Assay cytometric זרימה נערך כדי לאשר את הביטוי של סמן משטח mesenchymal על פני השטח של התאים. סמני MSC CD73, CD90, כלי קשת-1, CD44 היו חיובי בחריפות שיתפקדו, ואילו סמני השושלת hematopoietic CD19, CD34, CD45, ד ר הלע היו שליליות.
השפעות שונות ויטמין D 3 ריכוזי על פרכת
למרות התוצאות אישרו את ההשפעות החיוביות של 1,25-(OH)2D3 (קלציטריול) על פעילות osteogenic, נצפו הבדלים משמעותיים סטטיסטית רק בקרב חלק מהשינויים קיפול בביטויים mRNA של osteogenic אנזימים. אולי ניתוח זה מוטה על ידי ערכי SD גבוהה, אשר ניתן לייחס את הסטיות בודדים בין המחשבים המארחים.
הביטוי RNA שליח של phosphatase אלקליין
השינויים קיפול בביטוי ה-mRNA של ALP אחרי שבוע של תרבות 7.43 (SD = 3.96) קבוצת ויטמין C ו- 7.15 (SD = 4.88), 9.30 (SD = 5.63), 12.92 (SD = 7.95), ו- 6.60 (SD = 6.33) ב 10−10, 10−9, 10−8 , וקבוצות 10−7 מ' 1,25-(OH)2D3 , בהתאמה (איור 4a). רמות ביטוי mRNA של ALP ויטמין C, 10−8 מ' 1,25-(OH)2D3ו 10−9 מ' 1,25-(OH)2D3 קבוצות היו גבוהות באופן משמעותי (p < 0.05) מאשר אלה קבוצות אחרות, המציינת את הביטוי ALP mRNA מוגבר בקבוצות אלה. הפקד הוגדר הערך 1. העליות קיפול הבאים בביטויים ALP mRNA נצפו במחקר זה: 7.43-fold בקבוצה ויטמין C; 9.30-fold בקבוצה 10−9 מ' 1,25-(OH)2D3 ; ו 12.92-fold הקבוצה3 10−2D 1,25-(OH)8 מ'.
למרות שינוי קיפול גדול הביטויים ALP mRNA נצפתה הקבוצה3 10−2D 1,25-(OH)8 מ', אין הבדלים משמעותיים סטטיסטית נצפו לגבי אלה רמות הביטוי בין קבוצה זו את שלילי וקבוצות ויטמין C (p = 0.20 ו- p = 0.52, בהתאמה).
ALP הוא סימן חזק לקביעת הבידול osteogenic מוקדמת של תאים. ALP גם משמש ectoenzyme לפירוק רב-תכליתי אי-אורגנית והוא משחרר פוספט במהלך מינרליזציה36. שיתפקדו מטופלים עם ויטמין C, 10−8 ו 10−9 מ' 1,25-(OH)2D3 הציג הבדלים משמעותיים בהשוואה לאלה של קבוצות אחרות (איור 4a).
ביטוי RNA שליח של עצם sialoprotein
השינויים קיפול בביטויים mRNA של BSP לאחר שבוע של תרבות היו 3.21 (SD = 1.20) ו- 4.18 (SD = 2.55), 10.34 (SD = 10.31), 24.91 (SD = 23.44), ואת 5.24 (SD = 3.54) של ויטמין C ו 10−10, 10−9, 10−8 , וקבוצות 10−7 מ' 1,25-(OH)2D3 , בהתאמה (איור 4b). הביטויים BSP mRNA היו גבוהים יותר בקבוצה3 10−2D 1,25-(OH)8 מ', אבל עם אין מובהקות סטטיסטית לעומת הביטויים המתאימים קבוצות אחרות.
הביטויים BSP mRNA של ויטמין C ו- 10−10 מ' 1,25-(OH)2D3 קבוצות היו גבוהות באופן משמעותי (p < 0.05) מאשר אלה קבוצות אחרות, המציין כי ויטמין C ו 10−10 מ' 1,25-(OH) 2 D3 קידום הביטוי BSP. הפקד הוגדר הערך 1. את ויטמין C ו- 10−10 מ' 1,25-(OH)2D3 הקבוצות הציגו 3.21 - ו 4.18 פי עלייה הביטויים BSP mRNA, בהתאמה. 10−9 מ' וקבוצות 10−8 מ' 1,25-(OH)2D3 הציג ביטויי BSP mRNA גבוה יותר מאשר קבוצות אחרות. 10−9 ו- 10−8 מ' 1,25-(OH)2D קבוצות3 הציג 10.34 - ו 24.91 פי עלייה הביטויים BSP mRNA, בהתאמה, אך עלייה זו לא היה משמעותי סטטיסטית (p > 0.05). הסבר אפשרי הוא כי תאי גזע היו לא כל המתקבל המשתתף באותו. לפיכך, ההבדלים הפוטנציאליים ייתכן שהגדלת הגרמנים, כתוצאה מכך מושפעים התוצאות הסטטיסטיות.
ביטוי RNA שליח של CBFA1
השינויים קיפול בביטויים CBFA1 mRNA אחרי שבוע של תרבות היו 0.96 (SD = 0.10) ו- 0.90 (SD = 0.26), 1.01 (SD = 0.25), 1.31 (SD = 0.32 נקודות), ו- 1.12 (SD = 0.35) של ויטמין C ו- 10−10, 10−9, 10−8 , וקבוצות 10−7 מ' 1,25-(OH)2D3 , בהתאמה (איור 4 c). 10−8 מ' 1,25-(OH)2D3 הקבוצה הציגה ביטויים CBFA1 mRNA גבוהה יותר. אין שינויים מסומנים נצפו בביטויים ג'ין CBFA1 mRNA בקבוצות טיפול או בקבוצת הביקורת. בנוסף, אין עלייה משמעותית נצפתה בביטוי סמני mRNA אחרי התוספת של ויטמין C או 1,25-(OH)2D3. יתר על כן, אין הבדלים משמעותיים בין קבוצות נצפו.
הביטוי RNA שליח של קולגן-1
השינויים קיפול בביטוי ה-mRNA של קולגן-1 לאחר שבוע של תרבות היו 0.98 (SD = 0.17) ו- 0.85 (SD = 0.16), 1.05 (SD = 0.16), 1.52 (SD = 0.36), ו- 1.01 (SD = 0.33) של ויטמין C ו 10−10, 10−9, 10−8 , וקבוצות 10−7 מ' 1,25-(OH)2D3 , בהתאמה (איור 4 d). הביטויים mRNA קולגן-1 היו גבוהים יותר בקבוצה 10−8 מ' 1,25-(OH)2D3 אבל עם אין הבדלים משמעותיים סטטיסטית לעומת הביטויים המתאימים קבוצות אחרות.
10−8 מ' 1,25-(OH)2D3 קבוצות שליטה הציג הבדלים משמעותיים סטטיסטית בתוצאות שלהם (p < 0.05). הפקד הוגדר הערך 1. נצפתה עלייה 1.52-fold הביטויים mRNA קולגן-1. את 10−10 מ' 1,25-(OH)2D3 ו- 10−8 מ' 1,25-(OH)2D3 הקבוצות הציג הבדלים משמעותיים בתוצאות שלהם (p < 0.05).
ביטוי RNA שליח אוסטאוקלצין
השינויים קיפול בביטויים OCN mRNA אחרי שבוע של תרבות היו 0.60 (SD = 0.1) ו- 0.78 (SD = 0.18), 1.13 (SD = 0.55), התחלתי של 2.59 (SD = 1.59), ו- 1.61 (SD = 0.73) של ויטמין C ו- 10−10, 10−9, 10−8 , וקבוצות 10−7 מ' 1,25-(OH)2D3 , בהתאמה (איור 4e). הביטויים OCN mRNA היו גבוהים יותר בקבוצה 10−8 מ' 1,25-(OH)2D3 אבל עם אין הבדלים משמעותיים סטטיסטית לעומת הביטויים המתאימים קבוצות אחרות.
אין עלייה משמעותית נצפתה בביטויים סמני OCN mRNA אחרי התוספת של ויטמין C או 1,25-(OH)2D3. עם זאת, הביטויים OCN mRNA ירד לאחר הטיפול ויטמין C. הפקד הוגדר הערך 1. הביטויים OCN הבזליים הציגה ירידה משמעותית 0.6-fold (p < 0.05) במהלך התמיינות osteoblastic. ה-mRNA OCN ביטויים היו גבוהות באופן משמעותי (p < 0.001) בתאים בתרבית 10−8 מ' 1,25-(OH)2D3 מאשר בביטויים המתאימים של הקבוצות האחרות, אשר הציג קיפול הממוצע של עלייה של 2.59. עם זאת, תוצאות אלו לא היו משמעותיים מבחינה סטטיסטית (p > 0.05). הסבר אפשרי הוא תאי גזע היו לא כל המתקבל המשתתף באותו; לפיכך, ההבדלים הפוטנציאליים ייתכן שהגדלת הגרמנים, כתוצאה מכך מושפעים התוצאות הסטטיסטיות.
ALP פעילות assay
מחקר קודם הראה שאת2D 1,25-(OH)3 הוא היעיל ביותר-ריכוז של 10−8 מ'; לכן, 10−8 מ' היה בשימוש קבוצת הניסוי כדי להשוות את יכולת osteogenic של 1,25-(OH)2D3 עם זה של התשליל, ויטמין C, וויטמין C + 1,25-(OH)2D3 קבוצות. היכולת osteogenic באה לידי הפעילות אלפ. לאחר שבוע של תרבות (איור 5a), מקפלים השינויים בפעילות ALP היו 1.00 (SD = 0.00), 1.92 (SD = 0.89), 3.77 (SD = 1.66), ו- 1.46 (SD = 0.49) בשלילי, C, D, ו- C + D, בהתאמה. בין כל הקבוצות, הבדלים משמעותיים סטטיסטית נצפו רק בין הקבוצות D ושלילי (p = 0.03; איור 5a). לאחר 2 שבועות של תרבות, השינויים קיפול בפעילות ALP (איור 5b) היו 1.00 (SD = 0.00), 2.32 (SD = 1.68), 4.98 (SD = 3.02), ו- 4.86 (SD = 2.73) בשלילי, C, D, ו- C + D, בהתאמה. אין הבדלים משמעותיים סטטיסטית נצפו בכל הקבוצות. לאחר 3 שבועות של תרבות, השינויים קיפול בפעילות ALP (איור 5 c) היו 1.00 (SD = 0.00), 2.93 (SD = 2.15), 5.76 (SD = 3.60), ו- 5.61 (SD = 3.88) בשלילי, C, D, ו- C + D, בהתאמה. שוב, אין הבדלים משמעותיים סטטיסטית נצפו באחת הקבוצות (איור 5 c). לאחר 4 שבועות של תרבות, השינויים קיפול בפעילות ALP (איור 5 d) היו 1.00 (SD = 0.00), 2.83 (SD = 1.97), 3.79 (SD = 0.77), ואת 4.24 (SD = 2.87) בשלילי, C, D, ו- C + D, בהתאמה. . הנה, הקבוצות D ושלילי הציג הבדלים משמעותיים סטטיסטית (p = 0.00; איור 5 d).
שבוע 1, רק 10−8 מ' 1,25-(OH)2D3 הקבוצה הציג הבדלים משמעותיים לעומת קבוצת הביקורת (p = 0.03). שבוע 2,2D 1,25-(OH)8 M−3 10 וקבוצות ויטמין C הציג הבדלים משמעותיים לעומת קבוצת הביקורת (p = 0.0498). שבוע 3, אף אחת מקבוצות הציג הבדלים משמעותיים לעומת קבוצת הביקורת. שבוע 4, 10−8 מ' 1,25-(OH)2D3 הקבוצה הציג הבדלים משמעותיים לעומת קבוצת הביקורת. זה ציין שאת 10−8 מ' 1,25-(OH)2D3 קידום פעילות אלפ...
בקצרה, 10−8 מ' 1,25-(OH)2D3 הקבוצה הציג גדל ALP וביטוי mRNA קולגן-1; קבוצת ויטמין C הציג ALP המשופר וביטוי BSP mRNA; הקבוצה3 10−2D 1,25-(OH)9 מ' הציג ביטוי ALP mRNA המשופר. שבוע 1, נצפתה פעילות מוגברת של ALP קבוצות3 2D ויטמין C, 1,25-(OH) אבל עם אין הבדלים משמעותיים סטטיסטית לעומת רמות הביטוי המקביל של קבוצות אחרות. שבועות 2 עד 4, ויטמין C ו- 1,25-(OH)2D3 קבוצות הציג תוצאות דומות. לכן, תוצאות אלו יכול לא ברור להבהיר את ההשפעות סינרגטי של ויטמין C ו- 1,25-(OH)2D3 על הבידול osteogenic של התאים (ALP פעילות).
איור 1: קרום העצם מכתשיים אנושי. חידוש רקמות נבצרו במהלך ניתוח שיניים. הכוכבית מציינת המיקום של קרום העצם מכתשיים.
איור 2: לימוד בידול. MSCs היו בצורת כישור עם תהליכים לא סדיר, מחובר היטב לאחר 1-3 d של תרבות ראשי לצלחת תרבות (A; הכוכבית מציינת המיקום של תא גזע mesenchymal). בתנאים in vitro לקשרי תרבות, MSCs היו subpassaged, הבדיל לתוך תאי העצם (B, הכוכבית השחורה מציינת את האזור מוכתמת פון Kossa), chondrocytes (C, כחול הכוכבית מציינת את האזור מוכתמת. Alcian כחול), ו- adipocytes (D, הכוכבית ורוד מציינת את האזור מוכתמת שמן אדום O). איור 2 שימוש חוזר הבינלאומי למחקר ביורפואי, נפח 2016, 3529561 מזהה סעיף25. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Flow cytometry. סמני פני השטח לידי MSCs היו CD73 (65.2%), CD90 (75.6%), כלי קשת-1 (65.2%) ו- CD44 (88.1%) אבל לא CD45 (1.34%), CD34 (1.61%), CD19 (2.18%), או ד ר הלע (2.20%). "%" באיור מציין יחס חיובי. קבוצת הביקורת (α-מ ו-5% FBS) מיוצג על-ידי הקו האדום. קבוצת הניסוי מיוצג על ידי הקו הכחול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: mRNA ביטויים. ביטויים mRNA של בידול אוסטאובלסט למשך שבוע. BSP ALP (B) (A), CBFA1 (ג), (ד) COL- ואני OCN (E). p < 0.05 הוא *, 0.01 < p הוא * *, p < 0.001 הוא * * *. השינוי קיפול mRNA הוא לעומת שליטה (α-מ ו-5% FBS). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: פעילות פוספטאז אלקליין. פעילות פוספטאז אלקליין assay אוסטאובלסט בידול עבור (A) שבוע 1, השבוע (ב') 2, (ג) שבוע 3, ו- (ד) בשבוע 4. p < 0.05 הוא *, p < 0.01 הוא * *, 0.001 < p הוא * * *. השינוי הקיפול הוא לעומת שליטה (α-גברתי, 5% FBS). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודאליות טיפוליות שפותחו לאחרונה, כלומר רקמות הנדסה פרוגרמה MSCs, יש יתרונות רבים. MSCs, אשר נמצאים בכמה סוגי רקמות, תאים multipotent יכולים להתמיין מגוון תאי רקמה תפקודית mesodermal37 הינם תאים אחרים כגון תאי העצם.
קרום העצם משמש משרה עבור ובתאים והוא בתור אספקת עשיר להערכת עצם עוטף38. במחקר שלנו, של הדגימות ובדוקים 34, 20 הניב בהצלחה מושבות MSC, עם שיעור הבידוד מוצלח של 58.8%. MSCs נגזר קרום העצם נבחרו במחקר זה מבוסס על התפשטות ויכולות בידול osteogenic שלהם. קצב התפשטות התאים חידוש היה גבוה בהרבה מזה של תאי סטרומה מח22. לגבי היכולת osteogenic של קרום העצם, Ousual24 טענו כי היכולת osteogenic של תאי גזע נגזר קרום העצם (PMSCs) היה נחות BMSCs. עם זאת, יושימורה העיד כי היכולת osteogenic של PMSCs ביצועים טובים יותר של BMSCs39. הייאשי ואח. הפגינו חידוש MSCs למבוגרים כמו מועמדים אידיאליים עבור התחדשות רקמות העצם24. בנוסף, חידוש MSCs למבוגרים נחשבים שימושי קיצור תקופת התרבות תאים, ובכך להקטין את העלות והן את הסיכון של זיהום22. על פי הדיווחים, הזדקנות משפיעה גם על הפעילות mitogenic של תאים osteoprogenitor40. מחקר דיווח 1,25-(OH)2D3 המושרה תואר גבוה יותר של גירוי של במבחנה אוסטאובלסט בידול ב hMSCs מן המשתתפים (גיל 65 < y) הצעיר41. המחקר הנוכחי מעורב השימוש של חידוש תאים המתקבל בוגרים צעירים (בגילאי < 65 y). מחקרים נוספים נדרשים כדי להשוות את יכולת התחדשות העצם חידוש תאים בין תורמים צעירים וקשישים.
במחקר זה, אוכלוסיה תא הופרדה בהתבסס על המאפיין פלסטיק-חסיד, כפי שתואר על ידי Friedenstein et al. 13. שיתפקדו שנקטפו כאן דבקה הפלסטיק התרבות תאים. הקריטריונים esenchymal (CD 73, CD 90, ותזמורת כלי קשת-1 ו- CD 44) של אנטיגנים משטח של תאים אלה תרבויות העיקרי הציג ביטויי משמעותית. יתר על כן, סמנים hematopoietic (CD 45, CD 34, CD 19 ו ד ר הלע) נעדרו, המציין כי התאים בתרבית היו ממוצא mesenchymal. הבידול osteogenic, chondrogenic ו- adipogenic של שיתפקדו יכולים להיגרם משימוש במדיה התמיינות ספציפיים, כפי שמתואר מחקרים אחרים הערכת דגימות המתקבל רקמות ו מח עצם חניכיים42. התוצאות של המחקר הנוכחי המחמירות תקני מינימלי עבור ההגדרה פנוטיפי ופונקציונליים של MSCs האנושית על ידי האגודה הבינלאומית הסלולר4. במחקר הנוכחי, MSCs מן קרום העצם האנושי היו מבודדים, מורחב, אשר חשף מאפיינים דומים לאלה המתוארים בדרך כלל של BMSCs.
מחקרים הציעו כי דקסאמתאזון, ascorbate ו β-glycerophosphate לגרום BMSCs לעבור התמיינות osteogenic43. מחקר נוסף הראה את 1α, 25-dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2יח3) בשילוב עם חומצה אסקורבית קידום תאי גזע בידול44. לכן, דקסאמתאזון, ascorbate ו β-glycerophosphate נוספו במחקר זה כדי לקדם את הבידול בתאי גזע. הדפוסים שנצפו היו דומים כל שלוש דוגמאות התא החולה. במחקר זה, תצורתן של MSCs אותרו בהצלחה של קרום העצם מכתשיים עם שיעור הבידוד של 58.8%. אין הבדלים משמעותיים סטטיסטית נצפו בשיעור ההצלחה ביחס לגיל, מין ומיקום.
במחקר ניסויי חקר שני חומרים, כלומר 1,25-(OH)2D3 וויטמין C, אשר שניהם יכול לעורר את הבידול osteogenic של תאי גזע. מחקר 200845 הצביעו 1,25-(OH)2D3 הוא קריטי עבור עצם חילוף החומרים, הומאוסטזיס סידן וזה משפיע על מערכת הלב וכלי הדם באמצעות מנגנונים עדיין כדי להבין עד הסוף. ב אחר הקודם המחקר46, 1,25-(OH)2D3 מגורה במבחנה הבידול של MSCs אנושי לתוך תאי העצם. היכולת של 1,25-(OH)2D3 כדי לגרום BMSCs מובחן להבדיל לתוך תאים דמויי אוסטאובלסט במבחנה הוכח במספר מחקרים חקר מערכות שונות46. מחקרים הראו גם כי, בעת הוספת תרביות של תאים דמויי אוסטאובלסט, 1,25-(OH)2D3 מעכב שגשוג הסלולר אבל מגדילה את הביטוי של סמנים osteoblastic כגון ALP, osteopontin, OCN מטריקס Gla חלבון47,48. מחקר קודם דיווחו 1,25-(OH)2D3 בדרך כלל מעכב שגשוג תאי גורמת אוסטאובלסט בידול49. אחד במבחנה מחקר שנערך על תאים מאתר ציינו כי 1,25-(OH)2D3 יכול לקדם את השלבים הראשונים של osteoblastogenesis9. בנוסף, מחקר אחר במבחנה הציע כי, כדי MSCs,1,25-(OH) גם מוקדמת וגם מאוחרת2D3 יכול לעורר סמנים בידול osteogenic, כולל ALP, osteopontin, BSP ו OCN43.
שניהם OCN — נחשב אחראי על השליטה של מטריקס סינתזה — ו- 1A1 קולגן – החלבון מטריקס הנפוץ ביותר — הם עצם חומצי מכריע חלבונים מטריקס לשחק תפקיד חיוני מטריקס סינתזה. בנוסף, הם האופיינית בוגרים יוצרי המטריקס תאי העצם. 50 מחקר קודם דיווחו כי 1,25-(OH)2D3 טיפול מגורה הביטוי 1A1 הקולגן מוגבר אך לא CBFA1 או ALP ג'ין ביטוי34. הערכות של גנים המעורבים osteoblastic בידול חשפו כי 1,25-(OH)2D3 טיפול מוגבר הביטוי של OCN51,52,53. במחקר שלנו, התוצאות הראו שכי2D 1,25-(OH)3 מפעילה השפעות חיוביות על פעילות osteogenic. 10−8 M 1,25-(OH)2D3 לעומת קבוצות אחרות, הפגינו ביטוי מוגבר mRNA של ALP, BSP, CBFA1, OCN Col1. בין אלה, התוצאות עבור ALP ו- Col1 להגיע מובהקות סטטיסטית. לכן, תנאים אופטימליים התקבלו בעת שימוש 10−8 M 1,25-(OH)2D3. ביטוי mRNA BSP בקבוצה 10−10 M 1,25-(OH)2D3 גדל באופן משמעותי (p < 0.05). עם זאת, אין הבדלים משמעותיים סטטיסטית נצפו משתנה קיפול בביטויים mRNA של CBFA1 ושל OCN. בעת סקירת בביטוי mRNA הגן, התוצאות של הניסוי הצביעו על במבחנה בידול osteogenic. בהתבסס על ממצאים אלה, פרכת שנצפתה השליליות, ויטמין C, ו- 10−10, 10−9, 10−7 M 1,25-(OH)2D3 קבוצות היה חלש יותר 1,25-(OH) 10−8 M2D3 קבוצה. תוצאות אלו הובילו החששות כי 1,25-(OH)2D3 מספרים ראשוניים שיתפקדו על-ידי upregulating קולטני מטריקס החלבונים הדרושים עבור מינרליזציה (קולגן 1A1).
מחקר קודם דיווח OCN כיעד מרכזי של 1,25-(OH)2D3, שהגדילה במידה ניכרת OCN ביטוי52. ניתן לראות בתצהיר OCN סמן הבידול osteogenic של בקר קבוצת מחשבים ראשי. בנוסף, ביטוי OCN יוערכו כמו סמן osteogenic המנוח54. OCN הוא סמן אמין עבור עצם היווצרות ואת פרכת55. לכן, הביטוי OCN בדרך כלל קשורה היכולות מינרליזציה של תאים. OCN הוא סמן רגיש של תאי העצם בוגרת. להשוואה במבחנה osteogenic, ביטוי OCN mRNA גבוהות במידה ניכרת נצפתה בקבוצה 10−8 M 1,25-(OH)2D3 .
מחקר אחד ציין כי פעילות ALP מעוכבים על ידי הפיכת גורם הגדילה בטא (0.1-10 ng/mL), קידום עם2D 1,25-(OH)3 (50 ננומטר)46. תוצאות אלו לרמז שאת2D 1,25-(OH) 10−8 מ'3 מעודדת את ההתפתחות ההבשלה ועצם תאי גזע. ALP פעילות בריכוזים שנצפה אופטימלית של 10−8 M 1,25-(OH)2D3 היה לעומת זאת בריכוזים המתאימים של ויטמין c. שיתפקדו הביע ALP פעילות. יתר על כן, התוספת של 1,25-(OH)2D3 גברה הפעילות ALP וקידם את הבידול osteoblastic ב שיתפקדו. כל שלוש הגדרות, ויטמין C, 10−8 M 1,25-(OH)2D3, וויטמין C + 10−8 M 1,25-(OH)2D3 פעילות אלפ-שבועות 1 (איור 4a), 2 (איור 4b), 3 ( מוגברת איור 4 c), ו- 4 (איור 4 d) על ידי קיפול מספר בהשוואה לזה של קבוצת הביקורת השלילית. בשבועות 1 ו- 4, ALP פעילות גדל באופן משמעותי בקבוצה 10−8 M 1,25-(OH)2D3 . שבוע 2, ALP פעילות גדל באופן משמעותי את ויטמין C ו 10−8 M 1,25-(OH)2D3 קבוצות.
באמצעות מחקר השוואתי של MSCs אנושיים שונים-קטע 3, Sakaguchi et al. 56 נמצא כי BMSCs ו- PMSCs בעלי יכולות osteogenic דומות. לכן, התקופה התרבות התא יכול להתקצר סביר באמצעות חידוש תאים, אשר בתורו להפחית את הסיכון עלות וזיהום. השימוש hMSCs במעבר מוקדם מונע את ההשפעות senescent של הרחבת בתרבות. Ousual של יושימורה להשתמש MSCs מעבר 3 ו subcultured עבור 2 שבועות תחת תנאים בידול osteogenic35. לכן, מעבר הזמן להתייחס כאשר משווים את פעילות הסלולר של מקורות תאים שונים. במחקר זה, דור שלישי שיתפקדו שימשו בגלל הפוטנציאל osteogenic של תאי גזע של דורות מאוחרים יותר של בקר קבוצת מחשבים ראשי הוא נמוך יותר מזה של תאי גזע של בקר קבוצת מחשבים ראשי הדור השלישי.
כאשר תרבותי במדיום בנסיוב אדם, קרום העצם תאי גזע יכולים לא רק לשמור על צורתם, אבל ניתן גם לצרף, לשמור על פעילות, ולהשיג צמיחת תאים. לסיכום, בהתבסס על תוצאות אלו, שיתפקדו האדם להחזיק את היכולת לשרוד, להתרבות, להבדיל לתוך ה osteogenic היוחסין במבחנה, שהוא חיוני בהערכת יעילות ויוו. קרום העצם עשיר MSCs ולכן מתאים הנדסת רקמות. קרום העצם המתקבל gingiva מהווה פחות סיבוכים. לכן, העצם מכתשיים נחשב אתר אידיאלי התורם. התוצאות הפגינו בבירור את האפשרות של בידוד MSCs מן קרום העצם ולהשיג בידול שלהם לתוך תאי העצם, chondrocytes ו- adipocytes באופן דומה. במחקר זה, ההשפעות של ויטמין C על הפוטנציאל osteogenic של בקר קבוצת מחשבים ראשי הושוו באלו של 1,25-(OH)2D3 בריכוזים שונים. הריכוז היעיל ביותר היה 10−8 M 1,25-(OH)2D3. 10−8 M 1,25-(OH)2D3 הטיפול לאורך כל תקופת תרבות היה שיטה יעיל וחסכוני של גרימת בידול osteogenic ב שיתפקדו. לסיכום, ויטמין C ו- 1,25-(OH)2D3 לקדם את הבידול osteogenic של בקר קבוצת מחשבים ראשי. עם זאת, אלה הפגינו ללא תופעות סינרגטי משמעותי בתוצאות פעילות אלפ. בהתחשב גודל מדגם קטן, דוגמאות נוספות נדרשות להערכה נוספת. לפיכך, שיתפקדו תרבותי בתנאים osteogenic עשוי להיות שימושי עבור הנדסת רקמות העצם ומציעים את היתרון של התפשטות הסלולר גבוה יותר.
השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה כוללים שלבים 1.2 ו- 1.3 (החל ההליך culturing תוך 24 שעות מרגע הקטיף ותחזוקה ראויה לאחר מכן). זיהום של הרקמה יש להמנע, השימוש הטכניקה aseptic היא חובה. מגבלה אחת של פרוטוקול זה זה, בהשוואה לחיזוי בתאי גזע של מח העצם או רקמת שומן, לחיזוי תאי גזע מרקמות שיניים היא מוגבלת מבחינת המספר הנמוך של תאים אותם ניתן לקבל באמצעות טכניקה זו.
זיהוי ואפיון של חידוש תאי גזע יכולים לספק מידע רב ערך לגבי הפונקציות ורכיבי פוטנציאל הרגנרציה של רקמה זו, כמו גם את תחולתן בטיפול משובי. מצב אופטימלי הושג באמצעות 10−8 M 1,25-(OH)2D3. לכן, הטיפול של בקר קבוצת מחשבים ראשי עם 10−8 M 1,25-(OH)2D3 מקדם בידול osteogenic. מחקרים עתידיים יש לבחון את היישום ב- vivo של 10−8 M 1,25-(OH)2D3 עבור הנדסת רקמות העצם יעיל וחסכוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
פרוטוקול המחקר אושרה על ידי ועדת הבדיקה מוסדי עבור קליני מחקר של צ'נג קונג לבית חולים (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, 102-1619C, 101-4728B ו- 103-4223C). מחקר זה נתמך על ידי בית החולים ממוריאל קונג צ'אנג (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 ו NMRPG3C0151). כתב יד זה נערך על-ידי עריכה אקדמית וואלאס.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt | Sigma | 49752 | |
| 35-mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Alkaline phosphatase | ABI | Hs01029144_m1 | |
| Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit | BioVision | K412-500 | |
| avian myeloblastosis virus reverse transcriptase | Roche | 10109118001 | |
| CD146 | BD | 561013 | |
| CD19 | BD | 560994 | |
| CD34 | BD | 560942 | |
| CD44 | BD | 561858 | |
| CD45 | BD | 561088 | |
| CD73 | BD | 561014 | |
| CD90 | BD | 561974 | |
| Cell banker1 | ZEAOAQ | 11888 | |
| core binding factor alpha-1 | ABI | Hs00231692_m1 | |
| dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| GAPDH | ABI | Hs99999905_m1 | |
| HLA-DR | BD | 562008 | |
| indomethacin | Sigma | I7378 | |
| insulin | sigma | 91077C | |
| insulin–transferrin–selenium-A | Sigma | I1884 | |
| MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) | Life | 4346907 | |
| MicroAmp optical adhesive film | Life | 4311971 | |
| Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification | HyClone | SH30265.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333-56 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| STRO-1 | BioLegend | 340103 | |
| SYBER Green PCR Master Mix | AppliedBiosystems | 4309155 | |
| TaqMan Master Mix | Life | 4304437 | |
| transforming growth factor-β | Sigma | T7039 | |
| Trizol reagent (for RNA isolation) | Life | 15596018 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| collagen-1 | Invitrogen | forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3 reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3' |
|
| OCN | Invitrogen | forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3' reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3' |
|
| BSP | Invitrogen | forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3' reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3' |
|
| Commercial ALP primers | |||
| Commercial CBFA1 primers |
References
- Kao, R. T., Murakami, S., Beirne, O. R. The Use of Biologic Mediators and Tissue Engineering in Dentistry. Periodontol. 50, 127-153 (2000).
- Rosenbaum, A. J., Grande, D. A., Dines, J. S. The Use of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Engineering: A Global Assessment. Organogenesis. 4, 23-27 (2008).
- Yen, T. H., Wright, N. A., Poulsom, R. Bone Marrow Stem Cells: From Development to Therapy. Horizons in Medicine. Franklyn, J. 16, Royal College of Physicians of London. London, UK. 249-257 (2004).
- Dominici, M., et al. Minimal Criteria for Defining Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. The International Society for Cellular Therapy Position Statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal Human Dental Pulp Stem Cells (DPSCs). In Vitro and In Vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13625-13630 (2000).
- Miura, M., et al. Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5807-5812 (2003).
- Seo, B. M., et al. Investigation of Multipotent Postnatal Stem Cells from Human Periodontal Ligament. Lancet. 364, 149-155 (2004).
- Sonoyama, W., et al. Mesenchymal Stem Cell-Mediated Functional Tooth Regeneration in Swine. PLOS ONE. 1, e79 (2006).
- Morsczeck, C., et al. Isolation of Precursor Cells (PCs) from Human Dental Follicle of Wisdom Teeth. Matrix Biol. 24, 155-165 (2005).
- Mitrano, T. I., et al. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81, 917-925 (2010).
- Di Benedetto, A., Brunetti, G., Posa, F., Ballini, A., et al. Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Dental Bud: Role of Integrins and Cadherins. Stem Cell Res. 15, 618-628 (2015).
- Marrelli, M., Paduano, F., Tatullo, M. Cells Isolated from Human Periapical Cysts Express Mesenchymal Stem Cell-like Properties. Int J Biol Sci. 9 (10), Published online Nov 16 1070-1078 (2013).
- Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in Transplants of Bone Marrow Cells. J Embryol Exp Morphol. 16, 381-390 (1966).
- Perka, C., Schultz, O., Spitzer, R. S., Lindenhayn, K., Burmester, G. R., Sittinger, M. Segmental Bone Repair by Tissue-Engineered Periosteal Cell Transplants with Bioresorbable Fleece and Fabrin Scaffolds in Rabbits. Biomaterials. 21, 1145-1153 (2000).
- Taylor, J. F. The Periosteum and Bone Growth. Hall, B. K. , CRC Press. Boca Raton. Bone Growth VI (1992).
- Squier, C., Ghoneim, S., Kremenak, C. Ultrastructure of the Periosteum from Membrane Bone. J Anat. 171, 233-239 (1990).
- Aubin, J., Triffitt, J. Mesenchymal Stem Cells and Osteoblast Differentiation. Principles of Bone Biology. Bilezikian, J., Raisz, L. G., Rodan, G. A. , Academic Press. San Diego. 59-81 (2002).
- Diaz-Flores, L., Gutierrez, R., Lopez-Alonso, A., Gonzalez, R., Varela, H. Pericytes as a Supplementary Source of Osteoblasts in Periosteal Osteogenesis. Clin Orthop Relat Res. 275, 280-286 (1992).
- Lim, S. M., Choi, Y. S., Shin, H. C., Lee, C. W., Kim, S. L., Kim, D. I. Isolation of Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Using Immunophenotypes for Chondrogenesis. Biotechnol Lett. 27, 607-611 (2005).
- Stich, S., et al. Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Express Distinct Chemokine Receptors and Migrate Upon Stimulation with CCL2, CCL25, CXCL8, CXCL12, and CXCL13. Eur J Cell Biol. 87, 365-376 (2008).
- Choi, Y. S., et al. Multipotency and Growth Characteristic of Periosteum-Derived Progenitor Cells for Chondrogenic, Osteogenic, And Adipogenic Differentiation. Biotechnol Lett. 30, 593-601 (2008).
- Agata, H., et al. Effective Bone Engineering with Periosteum-Derived Cells. J Dent Res. 86, 79-83 (2007).
- Ribeiro, F. V., et al. Periosteum-Derived Cells as an Alternative to Bone Marrow Cells for Bone Tissue Engineering Around Dental Implants. A Histomorphometric Study in Beagle Dogs. J Periodontol. 81, 907-916 (2010).
- Hayashi, O., et al. Comparison of Osteogenic Ability of Rat Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Periosteum and Adipose Tissue. Calcif Tissue Int. 82, 238-247 (2008).
- Hong, H. H., Hong, A., Yen, T. H., Wang, Y. L. Potential Osteoinductive Effects of Calcitriol onthe m-RNA of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Alveolar Periosteum. BioMed Res Int. , Article ID 3529561 (2016).
- Knothe, U. R., Dolejs, S., Miller, R. M., Knothe Tate, M. L. Effects of Mechanical Loading Patterns, Bone Graft, and Proximity to Periosteum on Bone Defect Healing. J Biomech. 43, 2728-2737 (2010).
- McBride, S. H., Dolejs, S., Brianza, S., Knothe, U. R., Knothe Tate, M. L. Net Change in Periosteal Strain During Stance Shift Loading After Surgery Correlates to Rapid de novo Bone Generation in Critically Sized Defects. Ann Biomed Eng. 39, 1570-1581 (2011).
- Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28 (5), 644-658 (2014).
- Mostafa, N. Z., et al. Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells Cultured with Dexamethasone, Vitamin D3, Basic Fibroblast Growth Factor, and Bone Morphogenetic Protein-2. Connect Tissue Res. 53 (2), 117-131 (2012).
- Sun, Y., Yang, X., Li, F., Dou, Z. Study on Differentiation of Embryonic Stem Cells into Osteoblast in vitro Inducing by 1,25(OH)2VD3. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22 (9), 1117-1120 (2008).
- Ishii, M., Koike, C., Igarashi, A., et al. Molecular Markers Distinguish Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from Fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 332, 297-303 (2005).
- Maund, S. L., Barclay, W. W., Hover, L. D., et al. Interleukin-1α Mediates the Antiproliferative Effects of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Prostate Progenitor/Stem Cells. Cancer Res. 71, 5276-5286 (2011).
- Mitrano, T. I., Grob, M. S., Carrión, F., Nova-Lamperti, E., Luz, P. A., Fierro, F. S., Quintero, A., Chaparro, A., Sanz, A. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81 (6), 917-925 (2010).
- Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28, 644-658 (2014).
- Ippolito, G., Schiller, P. C., Ricordi, C., Roos, B. A., Howard, G. A. Age Related Osteogenic Potential of Mesenchymal Stromal Stem Cells from Human Vertebral Bone Marrow. J Bone Miner Res. 14, 1115-1122 (1999).
- D'Stucki, U., et al. Temporal and Local Appearance of Alkaline Phosphatase Activity in Early Stages of Guided Bone Regeneration. A Descriptive Histochemical Study in Humans. Clin Oral Implants Res. 12, 121-127 (2001).
- Caplan, A. I., Bruder, S. P. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med. 7, 259-264 (2001).
- Knothe Tate, M. L., Falls, T., McBride, S. H., Atit, R., Knothe, U. R. Mechanical Modulation of Osteochondroprogenitor Cell Fate. Int J Biochem Cell Biol. 40, 2720-2738 (2008).
- Yoshimura, H., Muneta, T., Nimura, A., Yokoyama, A., Koga, H., Sekiya, I. Comparison of Rat Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow, Synovium, Periosteum, Adipose Tissue, and Muscle. Cell Tissue Res. 327, 449-462 (2007).
- Tanaka, H., Ogasa, H., Barnes, J., Liang, C. T. Actions of bFGF on Mitogenic Activity and Lineage Expression in Rat Osteoprogenitor Cells: Effect of Age. Mol Cell Endocrinol. 150, 1-10 (1999).
- Zhou, S., et al. Clinical characteristics influence in vitro action of 1,25-dihydroxyvitamin D(3) in human marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 27 (9), 1992-2000 (1992).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Jørgensen, N. R., Henriksen, Z., Sorensen, O. H., Civitelli, R. Dexamethasone, BMP-2, and 1,25-dihydroxyvitamin D enhance a more differentiated osteoblast phenotype: validation of an in vitro model for human bone marrow-derived primary osteoblasts. Steroids. 69, 219-226 (2004).
- Khanna-Jain, R., et al. Vitamin D(3) Metabolites Induce Osteogenic Differentiation in Human Dental Pulp and Human Dental Follicle Cells. J Steroid BiochemMol Biol. 122 (3), 133-141 (2010).
- Lee, J. H., O'Keefe, J. H., Bell, D., Hensrud, D. D., Holick, M. F. Vitamin D Deficiency an Important, Common, and Easily Treatable Cardiovascular Risk Factor? J Am Coll Cardiol. 52, 1949-1956 (2008).
- Liu, P., Oyajobi, B. O., Russell, R. G., Scutt, A. Regulation of osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells: interaction between transforming growth factor-beta and 1,25(OH)(2) vitamin D(3) In vitro. Calcif Tissue Int. 65 (2), 173-180 (1999).
- Beresford, J. N., Gallagher, J. A., Russell, R. G. G. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 and Human Bone-Derived Cells In Vitro: Effects on Alkaline Phosphatase, Type I Collagen and Proliferation. Endocrinology. 119, 1776-1785 (1986).
- Price, P. A., Baukol, S. A. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Increases Synthesis of the Vitamin K-Dependent Bone Protein by Osteosarcoma Cells. J Biol Chem. 255, 11660-11663 (1986).
- Kawase, T., Oguro, A. Granulocyte Colony-Stimulating Factor Synergistically Augments 1, 25-Dihydroxyvitamin D3-Induced Monocytic Differentiation in Murine Bone Marrow Cell Cultures. Horm Metab Res. 36, 445-452 (2004).
- Fujisawa, R., Tamura, M. Acidic Bone Matrix Proteins and Their Roles in Calcification. Front Biosci. (Landmark Ed). 17, 1891-1903 (2012).
- van Driel, M., et al. Evidence that Both 1α,25 Dihydroxyvitamin D3 and 24-Hydroxylated D3 Enhance HuMan Osteoblast Differentiation and Mineralization. J Cell Biochem. 99, 922-935 (2006).
- Atkins, G. J., et al. Metabolism of Vitamin D3 in Human Osteoblasts: Evidence for Autocrine and Paracrine Activities of 1 α ,25-Dihydroxyvitamin D3. Bone. 40, 1517-1528 (2007).
- Kerner, S. A., Scott, R. A., Pike, J. W. Sequence Elements in the Human Osteocalcin Gene Confer Basal Activation and Inducible Response to Hormonal Vitamin D3. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4455-4459 (1989).
- Viereck, V., et al. Differential Regulation of Cbfa1/Runx2 and Osteocalcin Gene Expression by Vitamin-D3, Dexamethasone, and Local Growth Factors in Primary Human Osteoblasts. J Cell Biochem. 86, 348-356 (2002).
- Shi, X., et al. In-vitro osteogenesis of synovium stem cells induced by controlled release of bisphosphate additives from microspherical mesoporous silica composite. Biomaterials. 30, 3996-4005 (2009).
- Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of Human Stem Cells Derived from Various Mesenchymal Tissues: Superiority of Synovium as a Cell Source. Arthritis Rheum. 52, 2521-2529 (2005).
