Summary
선물이 파생 된 세포 (PDCs) 비타민 C (비타민 C) 및 1, 25-dihydroxy 비타민 D [1,25-(OH)2D3]에 의해 유도 된의 mRNA 식 biomarkers를 조사 하는 프로토콜. 또한, 우리는 osteocytes, chondrocytes, adipocytes에 차별 하는 Pdc의 능력을 평가 합니다.
Abstract
중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 다양 한 조직에에서 존재 하 고 osteoblasts를 포함 한 여러 세포 유형으로 분화 될 수 있다. MSCs의 치과 소스, 가운데는 레이어의 레이어에서 MSCs를 포함 하도록 확인 되었습니다는 쉽게 접근할 수 있는 조직입니다. 그러나,이 소스는 하지 아직 광범위 하 게 연구 되었습니다.
비타민 D3 와 1,25-(OH)2D3 생체 외에서 MSCs의 차별화를 실현 osteoblasts 자극 입증 되었습니다. 또한, 비타민 C는 콜라겐 형성과 뼈 세포의 성장을 촉진 한다. 그러나, 아무 연구는 MSCs에 비타민 D3 와 비타민 C의 효과 조사 아직 있다.
여기, 우리 인간의 치경과에서 MSCs를 분리 하는 방법을 제시 1,25-(OH)2D3 이 세포에 osteoinductive 효과 발휘 수 가설을 검사 하 고. 우리는 또한 인간의 치경과에서 MSCs의 존재를 조사 하 고 줄기 세포 접착 및 확산 평가. 평가 하기 위해 비타민 C (컨트롤)로 서의 능력 및 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8및 10−7 M)의 다양 한 농도 변경 키에 mRNA 생체 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산)의 고립 된 MSCs mRNA 표현 뼈 sialoprotein (BSP), 코어 바인딩 요소 알파-1 (CBFA1), 콜라겐-1, 및 osteocalcin (OCN) 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 사용 하 여 측정 됩니다.
Introduction
비록 최근 몇 년 동안에서 수많은 관련 기술 개발 되었습니다, 뼈 재건 남아 여러 제약 조건에 의해 제한 하 고 필요한 재구성의 정도 종종 가능한 추정. 하드 조직 확대는 유리한 장기 성공률 뿐만 아니라 심 미와 기능 목표를 달성 해야 합니다. 이러한 절차에 대 한 일반적으로 사용 되는 방법에는 자생과 allogenic 뼈 접목, xenografting, 및 alloplastic 뼈 접목 포함 됩니다. 뼈 이식의 다양 한 종류 중에서 자생 뼈 이식 가장 효과적으로 간주 됩니다. 그러나, 기증자 사이트 사망률, 손상된 vascularity, 그리고 제한 된 조직 여부1 자생 뼈 접목에 대 한 주요 단점이 있다. 또한, allogenic 뼈 이식 술과 xenografts 되었습니다 관련 질병 전송 된. 현재, 합성 뼈 이식 이러한 문제를 해결 하기 위해 널리 사용 됩니다. 그러나, osteogenic 잠재력의 그들의 부족, 임상 결과 널리 다양 했습니다. 셀 룰 로스 등 재료는 볼륨 변동, 감염, 및 힘의 부족에 연관 된다.
사용 하 여 조직 공학 뼈 확대는 상당한 관심을 생성 했다. 이 기술에서는, 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 처음 사용 osteoblast 분화를 촉진 하는 다음 뼈 복구를 달성 하기 위해 뼈 손실의 사이트에 이식 됩니다. 이 절차는 현재 셀에 적용 됩니다. 제한 된 양의 조직 추출 하 여 뼈 재건을 달성은 간단 하 고 덜 침략 다른 방법에 비해입니다.
세포 기반 치료 치과 재생 목적을 위한 도구로 MSCs의 잠재적인 역할은 다양 한 연구 그룹 중 신흥 관심입니다. MSCs는 다음과 같은 유형의 조직에서 분화 될 수 있다 연구 확인: 골 수, 지방, 활 액 막, pericyte, 배수 뼈, 인간의 탯 및 치과 조직2,3. MSCs의 일반적인 소스는 골 수, 지방 조직, 그리고 치과 조직을 포함합니다. 지방 조직과 골 수에서 파생 된 MSCs와 비교는 치과 줄기 세포의 장점은 쉬운 접근성 및 더 적은 사망률 수확 후입니다. 배아 줄기 세포와 비교해, MSCs 치과 조직에서 파생 된 nonimmunogenic 나타나고 복잡 한 윤리적 문제3와 연결 되지 않습니다.
2006 년에, 세포 치료에 대 한 국제 사회 MSCs를 식별 하는 다음과 같은 표준을 사용 하 여 권장: 첫째, MSCs 수 있어야 합니다 플라스틱 연결. 둘째, MSCs CD105, CD73, CD90 표면 항 원에 대 한 긍정적이 고 부정적인 monocytes, 대 식 세포, B 세포는 조 혈 항 CD45와 CD344에 대 한 표식에 대 한 있어야 합니다. 최종 조건으로 MSCs는 다음 세 가지 유형의 차별화 생체 외에서 의 표준 조건 하에서 세포로 분화 할 수 있어야 합니다: osteoblasts, adipocytes, 및 chondrocytes4. 날짜 하려면, 6 종류 인간의 치과 줄기 세포의 고립 된 고 특징 되었습니다. 첫 번째 유형은 인간의 펄프 조직 으로부터 격리 되었고 출생 후 치과 펄프의 줄기 세포5되 나. 그 후, 치과 MSCs의 3 개의 추가적인 종류 고립 되었고 특징: 피부 박피 낙 엽이6,7치 주 인 대, 그리고 꼭대기 시8에서 줄기 세포. 더 최근에, 치과 여 포에서 파생 된9, gingival 조직 파생10, 치과 봉 줄기 cells(DBSCs)11, periapical 낭종 MSCs (hPCy-MSCs)12 도 확인 되었습니다.
세계적은 MSCs13정의 하는 첫번째 이었다. MSCs는 높은 확산 잠재력을 전시 하 고 이식 되 전에 분화를 조작할 수 있습니다 재생 절차10에 대 한 이상적인 후보자 다는 것을 건의 하.
비록 대부분의 연구는 줄기 세포의 원천으로 골 수를 사용 하 고과 파생 된 세포 (PDCs)도 있다14최근에 사용한. 과 골 보다 더 쉽게 접근할 수 있습니다. 따라서,이 기술을 사용 하 여 치경과 수술 중 추가 절 개에 대 한 필요성을 제거 하 고 환자의 postsurgical 사망률을 줄이기 위해. 과 결합 조직 하는 긴 뼈의 외부 안 대기를 형성 하 고 두 가지 계층으로 구성 됩니다: 외부 섬유 층 섬유 아 세포, 교원 질 및 탄력 있는 섬유15와 직접 접촉에서 내부 셀 풍부한 레이어의 레이어 구성 와 함께 뼈 표면. 레이어의 레이어에 포함 되어 있는 혼합된 셀 인구, 주로 섬유 아 세포16, osteoblasts17,18, pericytes 및 MSCs19,,2021로 식별 하는 중요 한 부분 모집단. 대부분의 연구는 Pdc는 비교를 하지 않을 경우 골 수 유래 줄기 세포 (bMSCs)에서 우수한 뼈 치유와 재생22,,2324을 보고 있다. 과 쉽게 접근할 수 이며 탁월한 재생 효과 전시. 그러나, 몇 가지 연구는과25,,2627에 집중 했다.
뼈 수리에 관한 현재 임상 실습 지원 건설 기계 내에서 증폭 periosteal 조상 세포의 이식 포함 됩니다. 최근 연구는 줄기 세포 결함이 지역에서 취득 하 고 조상 세포 조직 재생20채용에 집중 했다. 치과 의사는 또한 치 주 치료 및 치아에 치 주 뼈 재생의 미래 응용 프로그램을 예상합니다. 기증자 사이트에 대해서는 쉽게 일반 치과 의사에 의해 수확 될 수 있습니다. 이과 일상적인 구강 수술 하는 동안 액세스할 수 있습니다으로 골 수 기질 세포에 대 한 호의적으로 비교 합니다. 따라서,이 연구의 목적은 이다 형태학, 첨부 파일, 생존, 그리고 인간의 줄기 세포의 확산을 평가 하 고 수확 하는 Pdc에 대 한 프로토콜을 설정 하.
비타민 D 대사 산물에는 vivo에서 뼈 미네랄 동적 평형에 영향을. 한 연구 보고는 24R,25-(OH)2D3 활성 형태의 비타민 D 인간의 MSCs (hMSCs)28의 osteoblastic 감 별 법을 위해 필수적 이다. 뼈 항상성 및 수리는 1,25-(OH)의2D3 (calcitriol)은 생물학적으로 가장 적극적이 고 뼈 건강의 규칙에 관련 된 비타민 D3 대사 산물의 네트워크에 의해 규제 됩니다. 비타민 D3 석 회화29필수적 이다. 한 연구 2-d-오래 곤 흰 쥐를 사용 하 여, 쥐에서 embryoid 몸 비타민 C와 비타민 D 보충제 효과적으로 ESC 파생 osteoblasts30의 차별화 추진 표시. 다른 생물의 활동 중 1,25-(OH)2D3 osteoblasts, 모니터링할 수 있는 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 효소 활동이 나 OCN 유전자에는 증가에 따라에 hMSCs의 생체 외에서 분화를 자극 식입니다.
몇 연구 뼈 조직 공학에 특정 초점 인간의 Pdc에 결합된 치료 비타민 C와 1,25-(OH)2D3 의 복용량 응답 관계를 감지 했습니다. 따라서,이 연구에서 우리는 1,25-(OH)2D3 의 단일 또는 복합 치료에 대 한 최적의 농도 비타민 C 인간의 Pdc의 osteogenic 분화 유도 대 한 검사. 이 프로토콜의 목표는 치과 치경과에서 고립 세포 인구 세포와 MSC 표현 형이이 세포를 문화 (생체 외에서) 확장 하 고 원하는 조직을 형성 하기 위하여 분화 수 여부를 들어 있는지 확인 하는 . 또한, 우리는 osteocytes, chondrocytes, adipocytes에 차별 하는 Pdc의 능력을 평가 합니다. 연구의 두 번째 부분은 Pdc의 osteogenic 활동에 비타민 C와 10−10, 10−9, 10−8및 10−7 M 1,25-(OH)2D3 의 효과 평가합니다. 이 연구의 주 목적은 ALP 활동과 ALP, 같은 프로 osteogenic 유전자에 의해 Pdc의 osteoblastic 감 별 법 동안 비타민 C와 1,25-(OH)2D3 의 기능을 평가 하는 콜라겐 1, OCN, BSP, 및 CBFA1. 또한,이 연구는 이러한 결과에 따라 인간의 Pdc에 대 한 최적의 osteoinductive 조건을 결정 합니다.
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Protocol
연구 프로토콜은 기관 검토 위원회의 장 궁 기념 병원에 의해 승인 되었다. 모든 참가자는 서 면된 동의 제공합니다.
1. 조직 준비
- 치과 수술 (그림 1) 중 환자에서 periosteal 조직 수확. 플랩 반사 로컬 마 취, 후31periosteal 구분 기호 사용 하 여 치조 뼈에서과 직물의 조각을 가져가 라.
- 수확 후 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS) 페니실린의 300 U/mL와 스의 300 mg/mL에서에서 약 5 m m × 2 mm의 periosteal 조직 조각을 저장 합니다. 24 시간 이내 실험실에 전송 조직.
- 잘 다진 고 37 ° C에서 인큐베이터에서 배양 통로 0 매체 (페니실린의 300 U/mL와 스, α-MEM, 및 5% 태아 둔감 한 혈 청 [FBS] 300 mg/mL로 구성)에서 샘플을 유지 때까지 scalpels와 치경 periosteal 조직 파편을 말하다 습도 공기 (5% 이산화탄소)입니다. 인큐베이터에서 습도 유지 하기 위해 물통을 준비 합니다.
- 3 일 후에 그리고 그 후에 주 당 두번 매체를 변경 합니다.
- 셀 subconfluence (80%)에 도달, 3 분 인큐베이터 (37 ° C)에서 0.25 %trypsin 200 µ L 부착 셀 놓고 매체의 4.5 mL을 사용 하 여 반응을 종료.
- 신선한 통행 1 매체에서 다시 셀 접시 (α-MEM, 10 %FBS, 페니실린, 100 단위/mL와 스의 100 μ g/mL). 플레이트는 5 × 103 셀 (로 hemocytometer 계산)입니다.
- 셀 80% 합류31달성 후 각 후속 통로 수행 합니다.
참고: 처음에, 매체는 붉은 오렌지 있을 것입니다. 약 3 일 후, 중간 색상 노란 그늘을 변경 해야 합니다. 셀의 두 배로 대략 30-40 h, 7 일 3-5 세대에 대 한 필요. - 문화 α-MEM에 고립 된 Pdc 보충 10 %FBS, 페니실린, 100 U/mL 및 100 mg/mL의 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 스.
- 세포 성장을 매일 관찰 하 고 두 번 주당 성장 매체를 대체. 제 3-5 세대 세포를 사용 하 여 모든 추가 실험에 대 한.
2. Cytometry
- 트립 신 소화를 통해 수확 1 × 106 셀:
- 0.25 %trypsin 200 µ L를 추가 합니다. 3 분 후 FBS를 포함 하는 문화 매체의 4.5 mL 사용 하 여 트립 신의 반응을 종결 하 고 원심 분리 (1500 rpm, 5 분, 22 ° C)를 통해 수집.
- 3 번 1 x DPBS를 사용 하 여 셀 펠 릿을 세척. 200 µ L 1 x permeabilization 버퍼에 셀 resuspend hemocytometer 셀을 계산 합니다.
- 교류 cytometry (형광 활성화 된 세포 분류)32통해 Pdc의 표현 표현된 표면 마커를 검사 합니다. CD19에 대하여 단일 클론 항 체 (MAb)를 사용 하 여 (fluorescein isothiocyanate (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (Phycoerythrin [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (PE), STRO-1 (알렉스), 및 HLA-DR (FITC)32.
- 30 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 문화와 샘플에 항 체를 추가 합니다.
- 1 x DPBS 셀 세 번 씻어.
- 2% 포름알데히드를 사용 하 여 셀을 수정 하 고 교류 cytometry 분석32진행.
3. 세포 부착 및 Osteogenic와 생존, Adipogenic, 및 Chondrogenic 차별화
로 셀에 차별화를 유도 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 계보 특정 차별화 미디어 6-잘 접시에 모든 3 개의 구절에서 periosteal 세포를 배양 하 여.
- Osteogenic 차별화 6-잘 문화 접시에 잘 당 5000 세포의 밀도에서 α-MEM에 셀 문화.
- 80%의 합류에, α-MEM, 5%를 포함 하는 미디어에 셀 문화 FBS, β-glycerophosphate (10 mM), 10−7 M dexamethasone (0.1 m m), 그리고 의약품의 5 mL (100 uM). Α-MEM 및 5%의 구성 된 미디어에 부정적인 제어 문화 FBS.
- 두 번 주당 미디어를 변경 합니다.
- 4 주 후, 문화33석 회화 예금의 존재를 구별 하는 von Kossa 분석 결과 사용 하 여 셀을 얼룩이 여 osteogenic 혈통으로 차별화 하는 세포의 잠재력을 평가 합니다.
- 10% 포 르 말린 고정에 대 한 추가 합니다. 30 분 이내 5% 실버 질 산을 추가 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 자외선 (UV)에서 취급 합니다.
- 추가 5% 나24 4 시간, 3 분 각 반응에 대 한 허용. 마지막으로 증류수로 두 번 셀 세척.
참고: Von Kossa 얼룩은 강 수 반응은 이온과 인산 염이; 산 성 물질의 존재에 반응 이 얼룩 기법 칼슘에 특정 하지 않습니다. 이 연구에서 때 조사 셀 실버 질산염 솔루션, 칼슘으로 치료 했다-는 강한 자외선에 의해 감소 된다-실버, 메탈 릭 실버로 표시 된에 의해 대체 되었다.
- Adipogenic 차별화, α-MEM을 포함 하는 6-잘 문화 접시에 잘 당 5000 세포의 밀도에 세포 문화.
- 80%의 합류에, α-MEM, 5 %FBS, 0.5 m m 3-isobutyl-1-methylxanthine (100mg/mL), 1% 페니실린을 포함 하는 미디어에 셀 문화 10−6 M dexamethasone (1mm), 인슐린 (5 mg/mL), 및 indomethacin (60 mM).
- Α-MEM 및 5%의 구성 된 미디어에 부정적인 제어 문화 FBS.
- 사용 6-9 주 후, 기름 빨간 O 셀 얼룩 및 지질 방울, 그로 인하여 adipogenic 차별화33의 존재 확인을 강조:
- 10% 포 르 말린 고정에 대 한 추가 합니다. 30 분 이내 얼룩 0.5% 셀 오일 10 분 동안 실 온에서 붉은 O 고 다음 씻어 3 시간 3 분 동안 60% 소 프로 파 놀과 셀 때마다; 마지막으로, 증류수와 셀 세척.
참고: 기름 빨간 O 중성 지질, 얼룩에 사용 되는 lysochrome (지 용 성) 디 아조 염료는 주로 triacylglycerol, 단백과 콜레스테롤 에스테 르. 염료도 지질 방울은 빨강 셀에 지질 작은 물방울에 녹 인 다.
- 10% 포 르 말린 고정에 대 한 추가 합니다. 30 분 이내 얼룩 0.5% 셀 오일 10 분 동안 실 온에서 붉은 O 고 다음 씻어 3 시간 3 분 동안 60% 소 프로 파 놀과 셀 때마다; 마지막으로, 증류수와 셀 세척.
- Chondrocyte 차별화, 각각 6-잘 문화 접시에 문화 세포 포함 5000 셀 잘.
- 차별화 중간 포함 α-MEM, 5 %FBS, 10−7 M dexamethasone (0.1 m m), 나트륨 pyruvate (100 µ g/mL), 인슐린-처리가-셀 렌-A (1 × ITS), 변형 성장 인자-β (10 ng/mL), 및 의약품 (100 µ M)의 5 mL를 추가 합니다.
- Α-MEM 및 5%의 구성 된 미디어에 부정적인 제어 문화 FBS.
- 4-5 주 후 Alcian 블루 얼룩 있다 또는 일부 유형의 chondrocyte 차별화33의 존재를 결정 하는 세포의 연골에서 mucopolysaccharides와 같은 산 성 류를 강조 하기 위해 사용 합니다.
- 10% 포 르 말린 고정에 대 한 추가 합니다. 30 분 이내 3% 아세트산을 추가 하 고 반응에 대 일 분을 허용 합니다. 그 후, 증류수로 세 번 씻어 30 분 동안 incubated 1 %Alcian 블루 8GX를 추가 하 고 증류수로 씻어. 마지막으로, 3% 초 산 및 3 분, 세척을 추가 하 고 완료를 증류수로 씻어.
참고: 특히 블루가이 염료에 의해 얼룩에 블루 그린 셀 부분의 후 얼룩이 지 고 "alcianophilic" 라고
- 10% 포 르 말린 고정에 대 한 추가 합니다. 30 분 이내 3% 아세트산을 추가 하 고 반응에 대 일 분을 허용 합니다. 그 후, 증류수로 세 번 씻어 30 분 동안 incubated 1 %Alcian 블루 8GX를 추가 하 고 증류수로 씻어. 마지막으로, 3% 초 산 및 3 분, 세척을 추가 하 고 완료를 증류수로 씻어.
4. 골에 25 Dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3)의 효과
- 6 그룹와 다양 한 문화 미디어 6-잘 접시에 문화 P5 Pdc에 P3 분할:
- 음수 그룹 (α-MEM 및 5 %FBS);
- 비타민 C 그룹 (α-MEM, 5 %FBS, 10 m m β-glycerophosphate, 및 10−7 M dexamethasone + 100 uM 비타민 C);
- 그리고 10−7 M 1,25-(OH)2D3 그룹 (α-MEM, 5 %FBS, 10 m m β-glycerophosphate, 및 10−7 M dexamethasone + 10−7 M 1,25-(OH)2D3).
- 각 잘에서 인큐베이터 (37 ° C)에 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 변경 매체 매주 두 번.
5. 리버스 전사/정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응
- 상업적인 시 약을 사용 하 여 얼음에 총 RNA 격리 osteoblast 차별화의 7d, 후 ( 재료의 표참조):
- 각 잘을 절연 시 약의 1 mL를 추가 합니다. Bromochloropropane의 200 µ L을 추가 하 고 계층화 된 RNA를 생성 하기 위해 10 분 동안 떠나 다음 4 ° c.에 15 분 동안 10000 rpm에서 원심
- 원심, 후 표면에 뜨는 포함 RNA의 500 µ L를 2-프로 판 올의 500 µ L를 추가 합니다. 얼음에 RNA 침전 하 고 반응에 대 일 분을 허용 합니다.
- 절차 후 후 RNA는 튜브의 하단에 4 ° C에서 15 분 동안 12000 rpm에서 원심. 그 후, 세척에 대 한 75% 알콜의 1 mL를 사용 하 여는 상쾌한을 제거 하 고 4 ° C에 8 분 7500 rpm에서 원심
- 상쾌한을 제거 하 고 진공 집중 장치를 사용 하 여 액체의 바닥에서 RNA를 생산. 물으로 복구.
- 리버스는 RNA 녹음 (1 μ g) 조류 myeloblastosis 바이러스 역전사를 사용 하 여. 마지막으로 4 ° c.에 유지 하기 전에 60 분 그리고 85 ° C 5 분, 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 50 ° c 10 분 동안 25 ° C에 실행 되도록 설정
- 첫 번째 가닥 보완 DNA (cDNA) 음성 합성. 정량 PCR (정량) 5를 사용 하 여 수행 μ 1:10 희석 cDNA. 양적 RT-PCR (qRT-PCR) 실시 ALP, BSP, OCN, CBFA1, 및 콜라겐-1에 대 한 프라이 머를 사용 하 여.
참고: 신호에 의해 DNA 오염을 방지 하려면 각 뇌관의 정방향 및 역방향 시퀀스 별개 exons에 설계 되었습니다. - 상업적인 PCR 마스터를 사용 하 여 정량 Pcr을 수행 믹스 ( 재료의 표참조) 제조업체의 지침에 따라. 2 분 뒤에 10 분 동안 95 ° C 그리고 다음 40 주기 각각 15 95 ° C에서 50 ° C에서 열 cycler 설정 s 60 위한 60 ° C 이어서 s.
참고: SYBR 프로토콜 또한 필요 15 95 ° C에 실행 되는 용융 곡선 단계, s 60 위한 60 ° C s, 그리고 95 ° C 15에 대 한 s. - ALP, BSP, CBFA1, 사이클 임계값 값을 정상화 콜라겐-1, 그리고 내부 관리 유전자 GAPDH의 OCN. 34
- 뇌관 쌍은 재료의 테이블에에서 나열 됩니다.
6. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동
- 앞에서 설명한 기법35, p-nitrophenol; p-nitrophenyl 인산 염 변환을 사용 하 여 셀의 ALP 효소 활동 평가 p-nitrophenyl 인산은 노란색으로 405 nm 파장에서 결정 된 ALP에 의해 dephosphorylated 때 인산 가수분해 효소 기질. 전체 표준화 p-nitrophenol 형성 Bradford 분석 실험에 의해 결정 되는 총 단백질에 따라.
- 컨트롤의 ALP 활동 비교 (α-MEM, 5 %FBS), 비타민 C (α-MEM, 5 %FBS, 10 m m β-glycerophosphate, 10−7 M dexamethasone + 100 uM 비타민 C), 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5 %FBS, 10 m m β-glycerophosphate, 및 10−7 M dexamethasone + 10−8 M 1,25-(OH)2D3), 그리고 비타민 C + 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5 %FBS, 10 m m β-glycerophosphate, 10−7 M dexamethasone + 100 uM 비타민 C +1,25-(OH)2D3) 그룹의 문화 1, 2, 3, 그리고 4 주 후.
- 얼음에서 단백질 추출 절차를 수행:
- 6 잘 플레이트에서 세포를 긁어와 세포의 용 해 버퍼의 50 µ L를 추가 합니다. 그 후, 세포를 파괴 하 고 단백질을 무료로 30 분 얼음에 셀을 놓습니다.
- 30 분 후 15 분 동안 4 ° C에서 13000 rpm에서 원심. 원심, 후 저장에 대 한 상쾌한 추출 하 고 사용 합니다.
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Representative Results
모든 양적 분석 실험에 대 한 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)으로 표시 됩니다. 모든 통계 분석은 학생의 t를 사용 하 여 수행 되었다-테스트. 총, 34 샘플 48.1의 평균 참가자 나이 가져온 ± 12.3 y. 11 이러한 샘플의 남성 환자와 여성 환자에서 23에서 입수 했다. 20-8 샘플 앞쪽 영역;에서 6 어 금 니 지역에서 가져온 26는 maxilla는 mandible에서 8에서 얻은 했다. 치과 절차와 문화 사이의 평균 기간 0.5 ± 0.1 h 이었다. 34 조사 샘플의 20는 성공적으로 58.8%의 성공적인 분리 속도와 MSC 식민지 나왔고. 매개 변수 사이 상당한 차이가 관찰 되었다는 성공적으로 및 실패 격리 된 Pdc (나이 의미: 48.8 ± 13.0 47.1 ± 11.5 y, 성 대: 4 남자 [28.6%], 위치 대 7 남자 [35%]: 13 [92.9%], 대 [75%] 어 금 니 지역에서 15 및 15에서 11 [78.6%], 대 maxilla [75%] 각각).
세포 분리 및 형태학: Osteogenic, chondrogenic, 및 adipogenic 차별화
일 1-9에서에서 Pdc 식민지 및 구형 클러스터 형성. 대부분의 세포 스핀 들 모양을 전시 그리고 균질 단계 대조 현미경 (그림 2) 했다. 문화의 14 d, 후 셀 형태 스핀 들-모양 단계 대조 현미경 관찰로 나타났다. 1 세대 셀 다음 이상 셀 클러스터에 그러나 광범위 하 고 균일 한 확산을 전시.
MSCs 스핀 들 모양의 불규칙 한 프로세스와 고 주 문화 (그림 2a)의 1-3 d 후 문화 접시에 단단히 고정 되어. 초기 문화 전시 작고, 둥근 세포 및 스핀 들 모양의 세포는 광학 현미경. 배양된 세포 (그림 2a)의 첫 대목에서 균질, 구와 같은 스핀 들 모양을 전시. 차별화 연구 Pdc subpassaged 수 osteoblasts (그림 2b), chondrocytes (그림 2c), adipocytes (그림 2d)으로 체 외에서 분화 밝혔다.
Osteogenic 차별화의 끝에, 폰 Kossa 얼룩 칼슘 예금과 osteogenic 차별화 (그림 2b)의 존재를 표시. 이러한 결과 강하게 periosteal 셀 인구 가운데 조상 세포 osteogenic 세포로 분화 하는 잠재력 소유 표시.
평가 proteoglycans의 생산, Alcian 블루 얼룩 chondrocyte 차별화 (그림 2c)의 존재를 결정 하기 위한 지표로 서 사용 되었다. 셀은 chondrocytes로 성공적으로 분화 된다. 이 결과, periosteal 셀 인구 가운데 조상 세포 chondrogenic 세포로 분화 하는 잠재력 소유 제안.
셀은 adipogenic 차별화 하 앞에서 언급 한 특정 미디어에 교양 있었다. 8 주 후, 오일 레드 O 세포내 지질의 존재를 감지 하는 데 사용 되었다. 다음 얼룩, 세포내 미세한 지방 방울 5 차별화 된 샘플 (그림 2d)에서 관찰 되었다.
Pdc에 대 한 흐름 cytometric 표면 마커 식 분석
흐름 cytometric 분석 결과 엽 표면 마커는 세포의 표면에의 식을 확인을 실시 했다. MSC 마커 CD73, CD90, STRO-1, 그리고 CD44 조 혈 혈통 마커 CD19, CD34, CD45, 및 HLA-DR 부정 했다 반면, Pdc에 강력 하 게 긍정적인 했다.
다양 한 비타민 D의 효과 3 골에 농도
통계적으로 유의 한 차이 osteogenic의 mRNA 식 배 변경의 일부 중 서만 관찰 했다 osteogenic 활동에 1,25-(OH)2D3 (calcitriol)의 긍정적인 효과 확인 하는 결과, 비록 효소입니다. 이 분석 호스트 간에 개별 편차에 높은 SD 값으로 편견 수 있습니다.
알칼리 성 인산 가수분해 효소의 메신저 RNA 표현
ALP 7.43 문화의 1 주 후의 mRNA 표정에서 배 변화 (SD 3.96 =) 비타민 C 그룹 및 7.15 (SD = 4.88), 9.30 (SD = 5.63), 12.92 (SD = 7.95), 그리고 6.60 (SD = 6.33) 10−10, 10−9, 10−8 , 그리고 10−7 M 1,25-(OH)2D3 그룹, 각각 (그림 4a). 비타민 C, 10−8 M 1,25-(OH)2D3, 그리고 10−9 M 1,25-(OH)2D3 그룹에서 ALP의 mRNA 식 수준 보다 상당히 높은 (p < 0.05) 했다 나타내는 다른 그룹에이 그룹에서 ALP mRNA 식 증가. 컨트롤 값이 1로 설정 되었습니다. ALP mRNA 식에 다음 배 증가이 연구에서 관찰 되었다: 7.43-fold 비타민 C 그룹; 9.30-fold 10−9 M 1,25-(OH)2D3 그룹; 12.92-fold 그리고 10−8 M 1,25-(OH)2D3 그룹에.
이러한 식 수준이이 그룹 사이 관한 통계적으로 유의 한 차이가 관찰 되었다 ALP mRNA 식에서 큰 배 변화 10−8 M 1,25-(OH)2D3 그룹에서 관찰 되었다, 비록 고 부정과 비타민 C 그룹 (p = 0.20 p = 0.52, 각각).
ALP 셀의 초기 osteogenic 분화 결정에 대 한 강력한 지표 이다. ALP는 또한 무기 파이 인산의 저하에 대 한 ectoenzyme로 하 고 강화36중 인산 염을 해제 합니다. Pdc 비타민 C로 치료 그리고 10−8 그리고 10−9 M 1,25-(OH)2D3 전시 다른 그룹 (그림 4a)에서 그와 비교할 때 큰 차이가.
뼈 sialoprotein의 메신저 RNA 표현
문화의 1 주 후 BSP의 mRNA 식에서 배 변화 했다 3.21 (SD = 1.20) 4.18 고 (SD = 2.55), 10.34 (SD = 10.31) 24.91, (SD 23.44 =)와 5.24 (SD = 3.54) 비타민 C와 10−10, 10−9, 10−8 , 그리고 10−7 M 1,25-(OH)2D3 그룹, 각각 (그림 4b). BSP mRNA 식 10−8 M 1,25-(OH)2D3 그룹에서 더 높았다 그러나 아무 통계적 의미와 다른 그룹에서 해당 식에 비해.
비타민 C와 10−10 M 1,25-(OH)2D3 그룹에서 BSP mRNA 표정은 상당히 높은 (p < 0.05) 보다는 비타민 C와 10−10 M를 나타내는 다른 그룹에 1,25-(OH) 2 D3 는 BSP 식 승진. 컨트롤 값이 1로 설정 되었습니다. 비타민 C와 10−10 M 1,25-(OH)2D3 그룹 3.21 4.18 배 증가 BSP mRNA 식에 각각 전시. 10−9 M 그리고 10−8 M 1,25-(OH)2D3 그룹은 다른 그룹 보다 더 높은 BSP mRNA 식 전시. 10−9 및 10−8 M 1,25-(OH)2D3 그룹 전시 10.34 24.91 배 증가 BSP mRNA 식에 각각, 하지만이 증가 통계적으로 유의 한 (p > 0.05). 가능한 설명은 줄기 세포 되지 않은 것 같은 참가자 로부터 얻은 모두 이다. 따라서, 잠재적인 차이 SD 증가 수 있습니다 하 고 결과적으로 통계 결과 영향을.
CBFA1의 메신저 RNA 표현
CBFA1 mRNA 식 문화 1 주 후에 배 변화 했다 0.96 (SD 0.10 =) 및 0.90 (SD 0.26 =), 1.01 (SD = 0.25), 1.31 (SD = 0.32), 1.12와 (SD = 0.35) 비타민 C 그리고 10−10, 10−9, 10−8 그리고 10−7 M 1,25-(OH)2D3 그룹, 각각 (그림 4c). 10−8 M 1,25-(OH)2D3 그룹 더 높은 CBFA1 mRNA 식 전시. 표시 변경 CBFA1 mRNA 유전자 식 또는 컨트롤 그룹 치료 그룹에서 관찰 되었다. 또한, 크게 증가 비타민 C 또는 1,25-(OH)2D3의 추가 후 mRNA 마커의 식에서 관찰 되었다. 또한, 상당한 intergroup 차이가 관찰 되었다.
메신저 RNA 표현의 콜라겐-1
문화의 1 주 후 콜라겐-1의 mRNA 식에서 배 변화 했다 0.98 (SD = 0.17)와 0.85 (SD = 0.16), 1.05 (SD = 0.16), 1.52 (SD 0.36 =), 및 1.01 (SD = 0.33) 비타민 C와 10−10, 10−9, 10−8 , 그리고 10−7 M 1,25-(OH)2D3 그룹, 각각 (그림 4 d). 콜라겐 1 mRNA 표현 했다 높은 10−8 M 1,25-(OH)2D3 그룹 하지만 다른 그룹에서 해당 식에 비해 통계적으로 유의 한 차이가.
10−8 M 1,25-(OH)2D3 및 제어 그룹 (p < 0.05) 그들의 결과에 통계적으로 유의 한 차이 전시. 컨트롤 값이 1로 설정 되었습니다. 콜라겐 1 mRNA 식에 1.52-fold 증가 관찰 했다. 10−10 M 1,25-(OH)2D3 와 10−8 M 1,25-(OH)2D3 그룹 (p < 0.05) 그들의 결과에 상당한 차이 전시.
메신저 RNA의 표현 osteocalcin
OCN mRNA 식 문화 1 주 후에 배 변화 했다 0.60 (SD = 0.1)와 0.78 (SD = 0.18), 1.13 (SD = 0.55), 2.59 (SD = 1.59), 그리고 1.61 (SD = 0.73) 비타민 C 그리고 10−10, 10−9, 10−8 그리고 10−7 M 1,25-(OH)2D3 그룹, 각각 (그림 4e). OCN mRNA 표현 했다 높은 10−8 M 1,25-(OH)2D3 그룹 하지만 다른 그룹에서 해당 식에 비해 통계적으로 유의 한 차이가.
크게 증가 비타민 C 또는 1,25-(OH)2D3의 추가 후 OCN mRNA 마커의 식에서 관찰 되었다. 그러나, OCN mRNA 식 비타민 C 치료 후 감소. 컨트롤 값이 1로 설정 되었습니다. 기저 OCN 식 osteoblastic 감 별 법 동안 중요 한 0.6-fold 감소 (p < 0.05)를 전시. 식을 했다 상당히 높은 (p < 0.001) 교양된 10−8 M 1,25-(OH)2D3 셀에 보다 해당 식에는 다른 그룹의 평균 배 전시 OCN mRNA의 증가 그러나 2.59.,이 결과 통계적으로 중요 한 되지 않았습니다 (p > 0.05). 가능한 설명은 이다 줄기 세포 되지 않은 것 같은 참가자;에서 얻은 모든 따라서, 잠재적인 차이 SD 증가 수 있습니다 하 고 결과적으로 통계 결과 영향을.
ALP 활동 분석 결과
이전 연구는 1,25-(OH)2D3 는 10−8 M;의 농도에서 효과적인 증명 따라서, 10−8 M 네거티브의 1,25-(OH)2D3 의 osteogenic 능력, 비타민 C 및 비타민 C + 1,25-(OH)2D3 그룹 비교 테스트 그룹에서 사용 되었다. Osteogenic 능력 ALP 활동에 의해 표현 되었다. 1 주일 후 문화 (그림 5a), ALP 활동에서 배 변화 했다 1.00 (SD = 0.00), 1.92 (SD = 0.89), 3.77 (SD = 1.66), 그리고 1.46 (SD = 0.49) 부정, C, D와 C + D에 각각. 모든 그룹 간의 통계적 차이 D와 부정적인 그룹 사이 관찰 되었다 (p = 0.03; 그림 5a)입니다. 2 주 후 문화, ALP 활동 (그림 5b)에서 배 변화 했다 1.00 (SD = 0.00), 2.32 (SD = 1.68), 4.98 (SD = 3.02), 그리고 4.86 (SD = 2.73) 부정, C, D와 C + D에 각각. 그룹에서 통계적으로 유의 한 차이가 관찰 되었다. 3 주 후 문화, ALP 활동 (그림 5c)에서 배 변화 했다 1.00 (SD = 0.00), 2.93 (SD = 2.15), 5.76 (SD 3.60 =), 및 5.61 (SD = 3.88) 부정, C, D와 C + D에 각각. 또, 그룹 (그림 5c)에서 통계적으로 유의 한 차이가 관찰 되었다. 4 주 후 문화, ALP 활동 (그림 5 d)에서 배 변화 했다 1.00 (SD = 0.00), 2.83 (SD = 1.97), 3.79 (SD = 0.77), 및 4.24 (SD = 2.87) 부정, C, D와 C + D에 각각. 여기, D와 부정적인 그룹 전시 통계적으로 유의 한 차이 (p = 0.00; 그림 5 d)입니다.
주 1, 10−8 M 1,25-(OH)2D3 그룹 전시 제어 그룹에 비해 큰 차이가 (p = 0.03). 주 2, 10−8 M 1,25-(OH)2D3 와 비타민 C 그룹 전시 컨트롤 그룹과 비교 하는 중요 한 차이 (p = 0.0498). 주 3에서 그룹의 컨트롤 그룹에 비해 큰 차이가 전시. 주 4, 10−8 M 1,25-(OH)2D3 그룹 컨트롤 그룹에 비해 상당한 차이 전시. 이 표시는 10−8 M 1,25-(OH)2D3 ALP 활동 승진.
간단히, 10−8 M 1,25-(OH)2D3 그룹 전시 증가 높은 산 및 콜라겐 1 mRNA 표정; 비타민 C 그룹 전시 크게 향상 된 ALP와 BSP mRNA 식; 그리고 10−9 M 1,25-(OH)2D3 그룹 크게 향상 된 ALP mRNA 식 전시. 주 1, ALP 활동 증가 비타민 C와 1,25-(OH)2D3 그룹 하지만 다른 그룹에서 해당 식 수준에 비해 통계적으로 유의 한 차이가 관찰 되었다. 4 주 2, 비타민 C와 1,25-(OH)2D3 그룹 모두 비슷한 결과 전시. 따라서, 이러한 결과 셀 (ALP 활동)의 osteogenic 차별화에 비타민 C와 1,25-(OH)2D3 의 시너지 효과 명확 하 게 명료 하지 않을 수 있습니다.
그림 1: 인간의 치경과. Periosteal 조직 치과 수술 동안 수확 했다. 별표는 치경과의 위치를 나타냅니다.
그림 2: 분화 연구. MSCs는 불규칙 한 프로세스와 스핀 들 모양의 되었고 후에 1-3 d의 기본 문화 문화 접시에 단단히 고정 되어 (A; 별표 나타냅니다 중간 엽 줄기 세포의 위치). 조건 하에서 생체 외에서 문화, MSCs subpassaged 되었고 osteoblasts로 분화 (B, 검은 별표 나타냅니다 von Kossa에서 스테인드 영역), chondrocytes (C, 파란색 별표 나타냅니다에 의해 스테인드 영역 Alcian 파랑), 그리고 adipocytes (D, 핑크 별표 나타냅니다에 의해 스테인드 지역 기름 빨간 O). 그림 2 는 생물 의학 연구 국제, 볼륨 2016, 문서 ID 352956125에서 다시 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Flow cytometry. 표면 마커 MSCs 표현 했다 CD73 (65.2%), CD90 (75.6%), STRO-1 (65.2%), 그리고 CD44 (88.1%) 하지만 하지 CD45 (1.34%), CD34 (1.61%), CD19 (2.18%), 또는 HLA-DR (2.20%). "%"는 그림에 긍정적인 비율을 나타냅니다. 제어 그룹 (α-MEM 및 5 %FBS) 빨간 선으로 표시 됩니다. 실험 그룹 파란 선으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: mRNA 식. 주 1 osteoblast 차별화의 mRNA 식입니다. ALP (B) BSP (A), (C) CBFA1, (D) 열-내가, 그리고 (E) OCN. p < 0.05입니다 *, p < 0.01은 * *, p < 0.001입니다 * * *. MRNA 배 변화 제어 대는 (α-MEM 및 5 %FBS). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동 분석 결과 (A) osteoblast 차별화의 1 주, (B) 주 2, (C) 주 3, 및 (D) 주 4. p < 0.05는 *, p < 0.01은 * *, p < 0.001입니다 * * *. 배 변화 제어 대는 (α-MEM, 5 %FBS). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
최근에 개발한 치료 양식 적임, 즉 조직 MSCs, 수 반하는 공학에 수많은 장점이 있습니다. 여러 조직 종류에 있는 MSCs 기능 mesodermal 조직 세포37 의 다양 한 차별화 수 있는 multipotent 셀과 다른 셀 osteoblasts 등 있습니다.
과 조상 세포에 대 한 틈새 시장으로 하며 뼈에 대 한 풍부한 맥 관 구조 공급으로38을 포위 한다. 34 조사 샘플의 우리의 연구에서 20는 성공적으로 58.8%의 성공적인 분리 속도와 MSC 식민지 나왔고. MSCs는과에서 파생 된 그들의 확산 및 osteogenic 분화 능력에 따라이 연구에서 선정 됐다. Periosteal 세포의 확산 속도22골 수 기질 세포 그것 보다 훨씬 높았다. 과의 osteogenic 능력에 관한 Ousual24 과 파생 된 줄기 세포 (PMSCs)의 osteogenic 능력은 BMSCs의 열 등 한 주장. 그러나, 요 시 PMSCs의 osteogenic 능력 BMSCs39의 실적이 인증. 하 야 시 외. 뼈 조직 재생24에 대 한 이상적인 후보로 periosteal 성인 MSCs를 보여주었다. 또한, periosteal 성인 MSCs 간주 됩니다 셀 문화 기간에 유용한 비용 및 오염22의 위험 감소. 보도 따르면, 노화도 osteoprogenitor 셀40mitogenic 활동을 영향을 줍니다. 연구 보고 1,25-(OH)2D3 유도 osteoblast 차별화의 hMSCs 젊은 참가자 (세 < 65 y)41에서 생체 외에서 의 자극의 더 높은 학위. 현재 연구 젊은 성인 (세 < 65 y)에서 얻은 periosteal 셀의 사용을 참여. 더 연구는 오래 되 고 젊은 기증자 사이 periosteal 세포의 뼈 재생 능력을 비교 해야 합니다.
이 연구는 셀 인구는 고립 된 그것의 플라스틱 부착 속성에 따라 세계적 외에 설명 된 대로. 13. 여기 수확은 Pdc 셀 문화 플라스틱 준수. 이러한 기본 문화 세포의 표면 항 원의 esenchymal 마커 (CD 73, CD 90, STRO-1, 그리고 CD 44) 중요 한 식 전시. 또한, 조 혈 마커 (CD 45, CD 34, CD 19, 및 HLA-DR) 결 석, 경작된 한 세포 간 엽 기원 했다 나타내는 했다. Pdc의 osteogenic, chondrogenic, 및 adipogenic 분화 수 유도 될 특정 차별화 미디어를 사용 하 여 다른 연구 평가 gingival 조직 및 골42에서 얻은 샘플에에서 설명 된 대로. 현재 연구의 결과 인간의 MSCs 세포 치료4에 대 한 국제 사회에 의해 허용의 phenotypic 및 기능 정의 대 한 최소한의 기준을 준수 합니다. 현재 연구에서 인간의 MSCs 고립 되었고 확장는 일반적으로 BMSCs의 설명 된 것과 유사한 특성을 밝혔다.
연구는 dexamethasone, 하는데, 그리고 β-glycerophosphate BMSCs osteogenic 차별화43을 일으킬 제안 했다. 또 다른 연구는 승진 ascorbic 산 줄기 세포 감 별 법44와 함께에서 그 1α, 25 dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3)를 시연 했다. 따라서, dexamethasone, 하는데, 그리고 β-glycerophosphate 줄기 세포 분화를 촉진 하는이 연구에 추가 되었다. 패턴 관찰 모든 세 환자 세포 샘플에서 유사 했다. 이 연구에서 MSCs 성공적으로 58.8%의 격리 속도 치경과에서 확인 되었다. 나이, 성별, 및 위치 성공률에 통계적으로 유의 한 차이가 관찰 되었다.
현재 실험 연구 조사 2 개의 물질, 즉 1,25-(OH)2D3 와 비타민 C, 둘 다 줄기 세포의 osteogenic 차별화를 자극 수 있습니다. 2008 연구45 1,25-(OH)2D3 는 칼슘 항상성 및 골 대사에 대 한 중요 한 아직 완전히 이해 하는 메커니즘을 통해 심장 혈관 시스템에 영향을 미치는 표시. 다른 이전 연구46, 1,25-(OH)2D3 는 생체 외에서 인간 MSCs의 차별화를 실현 osteoblasts 자극. 1,25-(OH)2D3 의 능력을 체 외에서 세포 osteoblast 같이로 분화 하 undifferentiated BMSCs 유도 다양 한 시스템46를 탐험 하는 여러 연구에서 입증 되었습니다. 문화 osteoblast 같이 셀에 추가 하면, 1,25-(OH)2D3 이 세포 확산을 억제 하지만 ALP, osteopontin, OCN, 등 매트릭스 Gla osteoblastic 감 적의 식을 증가, 몇몇 학문은 또한 설명 했다 단백질47,48 이전 연구 보고 1,25-(OH)2D3 일반적으로 세포 확산을 억제 고 osteoblast 차별화49유도. 1 생체 외에서 연구 murine 셀에 표시 1,25-(OH)2D3 osteoblastogenesis9의 초기 단계를 홍보할 수 있습니다. 또한, 다른 생체 외에서 연구, 초기 및 런타임에 MSCs,1,25-(OH)를2D3 자극 osteogenic 분화 마커, ALP, osteopontin, BSP와 OCN43를 포함 하 여 제안 했다.
두 OCN-행렬 합성의 제어에 대 한 책임으로 간주-및 콜라겐 1A1-가장 풍부한 매트릭스 단백질-는 중요 한 산 성 뼈 매트릭스 합성에 중요 한 역할을 재생 하는 매트릭스 단백질. 또한, 그들은 특성 매트릭스 형성 osteoblasts 성숙입니다. 50 이전 연구 보고 1,25-(OH)2D3 치료 자극 증가 콜라겐 1A1 식 하지만 하지 CBFA1 또는 높은 산 진 식34. 평가 osteoblastic 감 별 법에 관련 된 유전자의 1,25-(OH)2D3 치료 OCN51,,5253의 식을 증가 밝혀졌다. 우리의 연구 결과는 1,25-(OH)2D3 osteogenic 활동에 긍정적인 영향을 미치는 나타났다. 다른 그룹에 비해, 10−8 M 1,25-(OH)2D3 는 ALP, BSP, CBFA1, OCN, 및 c o l 1의 증가 mRNA 표현을 설명 했다. 이러한 가운데, ALP 및 c o l 1에 대 한 결과 통계적 의미에 도달. 따라서, 최적의 조건 10−8 M 1,25-(OH)2D3을 사용할 때 얻은 했다. 10−10 M 1,25-(OH)2D3 그룹에서 현저 하 게 증가 (p < 0.05) BSP의 mRNA 표현. 그러나, CBFA1와 OCN의 mRNA 식 배 변화에 통계적으로 유의 한 차이가 관찰 되었다. 유전자 mRNA 발현 때, 실험의 결과 표시 osteogenic 차별화 생체 외에서 . 이러한 결과, 네거티브에서 관찰 된 골에 따라 비타민 C, 그리고 10−10, 10−9, 10−7 M 1,25-(OH)2D3 그룹은 10−8 M 1,25-(OH)23 D 보다 약한 그룹. 이러한 결과 매트릭스 단백질 (콜라겐 1A1) 강화에 필요한 1,25-(OH)2D3 upregulating에 의해 Pdc 소수 투기에 지도 했다.
이전 연구는 1,25-(OH)2D3, OCN 식52현저 하 게 증가의 주요 대상으로 OCN을 보고. OCN 증 착 Pdc의 osteogenic 차별화에 대 한 표식으로 볼 수 있습니다. 또한, OCN 식 늦은 osteogenic 마커54으로 평가 하고있다. OCN은 뼈 형성과 골55에 대 한 신뢰할 수 있는 마커입니다. 따라서, OCN 식 세포의 강화 작용 능력에 일반적으로 관련 되어 있습니다. OCN은 성숙한 osteoblasts의 민감한 바이오 마커 이다. 생체 외에서 osteogenic 비교를 위해 현저 하 게 높은 OCN mRNA 식 10−8 M 1,25-(OH)2D3 그룹에서 관찰 되었다.
한 연구 표시 ALP 활동 변형 시키는 성장 인자 beta (0.1-10 ng/mL)에 의해 저해 되었고 1,25-(OH)2D3 로 승진 (50 nM)46. 이러한 결과는 10−8 M 1,25-(OH)2D3 는 줄기 세포 성숙과 뼈 개발을 촉진 의미. 10−8 M 1,25-(OH)2D3 의 최적의 관측된 농도에서 ALP 활동 했다 비타민 c의 해당 농도에서 저것과 비교 된 Pdc는 ALP 활동 표현. 또한, 1,25-(OH)2D3 의 추가 ALP 활동을 증가 하 고 Pdc에 osteoblastic 감 별 법을 승진. 모든 세 가지 설정, 비타민 C, 10−8 M 1,25-(OH)2D3, 그리고 비타민 C + 10−8 M 1,25-(OH)2D에서3 주 1 (그림 4a), 2 (그림 4b), 3 ( 에서 ALP 활동 증가 그림 4 c), 그리고 여러 겹 부정적인 제어 그룹의 저것과 비교 하 여 (그림 4 d) 4. 주 1과 4, ALP 활동 10−8 M 1,25-(OH)2D3 그룹에서 크게 증가 했다. 주 2, ALP 활동 비타민 C와 10−8 M 1,25-(OH)2D3 그룹에서 크게 증가 했다.
통로 3에 다양 한 인간의 MSCs의 비교 연구를 통해 사 카 구치 외. 56 BMSCs와 PMSCs 유사한 osteogenic 능력 보유 발견. 따라서, 셀 문화 기간 차례 비용 및 오염 위험을 줄일 것 이라고 periosteal 셀을 사용 하 여 가능성이 단축 될 수 있습니다. 초기 통로 hMSCs 사용 하 여 문화에 확장의 노화 효과 방지합니다. Ousual와 요 시 osteogenic 차별화 조건35에서 2 주 동안 3 및 subcultured 통로에 MSCs를 사용. 따라서, 통행 시간 다양 한 셀 소스의 세포 활동을 비교 했을 때 고려 되어야 한다. 이 연구에서는 3 세대 Pdc는 Pdc의 최신 세대의 줄기 세포의 osteogenic 잠재력 3 세대 Pdc의 줄기 세포의 그것 보다 더 낮기 때문에 사용 되었다.
인간의 혈 청 매체에 경작 하는 경우과 줄기 세포 뿐만 아니라 그들의 모양을 유지 하지만 수 있습니다 또한 첨부, 활동, 유지 하 고 세포 성장을 달성. 요약 하자면, 이러한 결과 바탕으로, 인간의 Pdc, 증식, 생존과 osteogenic 계보에는 생체 외에서에 vivo에서효능 평가에 중요 한 분화 능력을 보유. 과 MSCs 풍부 이며 따라서 조직 공학에 적합. 과 gingiva에서 얻은 적은 합병증 포즈. 따라서, 치조 뼈는 이상적인 기증자 사이트를 간주 됩니다. 결과 명확 하 게 비슷하게는 MSCs를 분리 하 고 osteoblasts, chondrocytes, adipocytes에 그들의 차별화를 달성의 가능성을 보여주었다. 이 연구에서는 Pdc의 osteogenic 잠재력에 비타민 C의 효과 다양 한 농도에서 1,25-(OH)2D3 의 비교 되었다. 가장 효과적인 농도 10−8 M 1,25-(OH)2D3를 했다. 문화 기간 동안 10−8 M 1,25-(OH)2D3 치료 Pdc osteogenic 차별화를 유도 하는 효과적이 고 경제적인 방법 이었다. 결론적으로, 비타민 C와 1,25-(OH)2D3 의 Pdc osteogenic 차별화 홍보. 그러나, 이러한 ALP 활동 결과에 더 큰 시너지 효과 전시. 작은 샘플 크기를 고려 추가 예제는 추가 평가 필요 합니다. 따라서, Pdc osteogenic 조건 하에서 배양 뼈 조직 공학에 대 한 유용 되 고 높은 세포질 확산의 이점을 제공.
이 프로토콜의 중요 한 단계는 단계 1.2와 1.3 (수확의 24 시간 이내 자란 절차 시작 및 적절 한 유지 보수 그 후). 조직의 오염 피해 야 하 고 무 균 기법의 사용은 필수. 이 프로토콜의 한 가지 한계는, 골 수 나 지방 조직에서 줄기 세포를 소싱에 비해,이 기술을 통해 얻을 수 있는 셀의 낮은 수 제한이 치과 조직에서 줄기 세포를 소싱.
식별 및 periosteal 줄기 세포의 기능과이 조직 재생 치료에 그것의 적용의 재생 잠재력에 관한 귀중 한 정보를 제공할 수 있습니다. 최적의 조건 10−8 M 1,25-(OH)2D3를 사용 하 여 얻은 했다. 따라서, 10−8 M 1,25-(OH)2D3 와 Pdc의 치료 osteogenic 차별화를 촉진합니다. 미래 연구는 10−8 M 1,25-(OH)2D3 효과적이 고 경제적인 뼈 조직 공학의 비보에 응용 프로그램을 검토 해야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
연구 프로토콜은 임상 연구의 장 궁 기념 병원 (IRB99-1828B, 100-3019 C, 99-3814B, 102-1619 C, 101-4728B, 및 103-4223 C)에 대 한 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. 이 연구는 장 궁 기념 병원 (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142, 및 NMRPG3C0151)에 의해 지원 되었다. 이 원고는 월 러 스 학술 편집 편집 했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt | Sigma | 49752 | |
| 35-mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Alkaline phosphatase | ABI | Hs01029144_m1 | |
| Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit | BioVision | K412-500 | |
| avian myeloblastosis virus reverse transcriptase | Roche | 10109118001 | |
| CD146 | BD | 561013 | |
| CD19 | BD | 560994 | |
| CD34 | BD | 560942 | |
| CD44 | BD | 561858 | |
| CD45 | BD | 561088 | |
| CD73 | BD | 561014 | |
| CD90 | BD | 561974 | |
| Cell banker1 | ZEAOAQ | 11888 | |
| core binding factor alpha-1 | ABI | Hs00231692_m1 | |
| dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| GAPDH | ABI | Hs99999905_m1 | |
| HLA-DR | BD | 562008 | |
| indomethacin | Sigma | I7378 | |
| insulin | sigma | 91077C | |
| insulin–transferrin–selenium-A | Sigma | I1884 | |
| MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) | Life | 4346907 | |
| MicroAmp optical adhesive film | Life | 4311971 | |
| Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification | HyClone | SH30265.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333-56 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| STRO-1 | BioLegend | 340103 | |
| SYBER Green PCR Master Mix | AppliedBiosystems | 4309155 | |
| TaqMan Master Mix | Life | 4304437 | |
| transforming growth factor-β | Sigma | T7039 | |
| Trizol reagent (for RNA isolation) | Life | 15596018 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| collagen-1 | Invitrogen | forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3 reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3' |
|
| OCN | Invitrogen | forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3' reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3' |
|
| BSP | Invitrogen | forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3' reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3' |
|
| Commercial ALP primers | |||
| Commercial CBFA1 primers |
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