Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Aislamiento de células madre mesenquimatosas del periostio Alveolar humano y efectos de la vitamina D en la actividad osteogénica de células derivadas del periostio

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57166
Automatic Translation
1,2, 3, 1,4,5,6, 1,7,8
1Chang Gung University, 2Department of Periodontics, Chang Gung Memorial Hospital, 3California Northstate University College of Medicine, 4Department of Nephrology, Clinical Poison Center, Chang Gung Memorial Hospital, 5Kidney Research Center, Chang Gung Memorial Hospital, 6Center for Tissue Engineering, Chang Gung Memorial Hospital, 7Department of Periodontics, Chang Gung Memorial Hospital, 8College of Oral Medicine, Taipei Medical University

Summary

Presentamos un protocolo para investigar los biomarcadores de la expresión de mRNA de células derivadas del periostio (PDC) inducidas por la vitamina C (vitamina C) y 1, 25-dihidroxi vitamina D [1,25-(OH) D23]. Además, evaluamos la capacidad de PDC se diferencian en osteocitos, condrocitos y adipocitos.

Abstract

Las células madre mesenquimales (MSCs) están presentes en una variedad de tejidos y puede diferenciarse en numerosos tipos celulares, incluyendo osteoblastos. Entre las fuentes dentales de MSCs, el periostio es un tejido fácilmente accesible, que se ha identificado a contener MSCs en la capa de cambium. Sin embargo, esta fuente no todavía sido ampliamente estudiada.

Vitamina D3 y 1,25-(OH)2D3 se han demostrado para estimular en vitro la diferenciación de MSCs en osteoblastos. Además, la vitamina C facilita crecimiento de colágeno formación y hueso celular. Sin embargo, ningún estudio ha investigado aún los efectos de la vitamina D3 y la vitamina C en MSCs.

Aquí, presentamos un método de aislamiento MSCs de periostio alveolar humano y examinar la hipótesis de que 1,25-(OH)2D3 puede ejercer un efecto Osteoinductor en estas células. También investigar la presencia de MSCs en el periostio alveolar humano y evaluar proliferación y adhesión de la célula de vástago. Para evaluar la capacidad de la vitamina C (como control) y diferentes concentraciones de 1,25-(OH)2D3 (10−1010−9, 10−8y 10−7 M) a alterar clave biomarcadores de mRNA en la expresión del mRNA de MSCs aislada de la fosfatasa alcalina (ALP), ósea sialoprotein (BSP), atascamiento de la base del factor alfa-1 (CBFA1), colágeno-1 y osteocalcina (OCN) se calculan utilizando la reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (RT-PCR).

Introduction

Aunque se han desarrollado numerosas técnicas relevantes en los últimos años, los huesos restos de reconstrucción limitada por restricciones múltiples y estimar que el grado de reconstrucción necesaria es a menudo imposible. Aumento de tejido duro es necesaria para alcanzar objetivos estéticos y funcionales además de una tasa de éxito a largo plazo favorable. Métodos comúnmente utilizados para estos procedimientos incluyen injerto óseo autógeno y alógeno, xenografting y el injerto de hueso de alloplastic. Entre los distintos tipos de injerto óseo, injertos de hueso autógeno se consideran los más efectivos. Sin embargo, morbosidad del sitio donante, vascularización comprometida y de la disponibilidad limitada de tejido1 han sido grandes inconvenientes para el injerto de hueso autógeno. Además, injertos óseos alógenos y xenoinjertos se han asociado con la transmisión de la enfermedad. En la actualidad, injertos óseos sintéticos son ampliamente utilizados para resolver estos problemas. Sin embargo, con su falta de potencial osteogénico, los resultados clínicos han variado ampliamente. Materiales como la celulosa están asociados con fluctuaciones de volumen, infección y la falta de fuerza.

Aumento óseo mediante ingeniería de tejidos ha generado considerable interés. En esta técnica, las células madre mesenquimales (MSCs) se utilizan inicialmente para promover la diferenciación de osteoblastos, que luego se trasplantan al sitio de la pérdida ósea para lograr la reparación del hueso. Este procedimiento se aplica actualmente en terapia celular. Lograr la reconstrucción del hueso mediante la extracción de una cantidad limitada de tejido es más simple y menos invasivo en comparación con otros métodos.

El papel potencial de MSCs como una herramienta para las terapias basadas en células para regeneración dental es un emergente interés entre varios grupos de investigación. Estudios han confirmado que MSCs pueden ser distinguidos de los siguientes tipos de tejidos: médula ósea, membrana sinovial adiposa, pericyte, hueso trabecular, cordón umbilical humano y tejidos dentales2,3. Fuentes comunes de MSCs incluyen médula ósea, tejido adiposo y los tejidos dentarios. En comparación con MSCs derivadas de tejido adiposo y la médula ósea, las ventajas de células madre dentales son de fácil accesibilidad y menor morbilidad después de la cosecha. En comparación con las células madre embrionarias, MSCs derivados de tejido dental aparecen nonimmunogenic y no se asocian a problemas éticos complejos3.

En 2006, la sociedad internacional de terapia celular recomendado utilizando los siguientes estándares para identificar MSCs: en primer lugar, MSCs deben ser capaces de unir al plástico. En segundo lugar, MSCs deben ser positivas para los antígenos de superficie de CD105 y CD73, CD90 y negativa para los marcadores de monocitos, macrófagos y células B además de las hematopoyéticos antígenos CD45 y CD344. Como criterio final, MSCs deben ser capaces de distinguir en los siguientes tres tipos de células en condiciones normales de diferenciación en vitro : osteoblastos, adipocitos y condrocitos4. Hasta la fecha, seis tipos de células madre dentales humanas han sido aislados y caracterizados. El primer tipo fue aislado de tejido pulpar humano y había denominado células madre de pulpa dental postnatal5. Posteriormente, se han aislado y caracterizado tres tipos adicionales de MSCs dentales: células madre de dientes de hojas caducas exfoliada6, el ligamento periodontal7y la papila apical8. Más recientemente, deriva del folículo dental9, derivados del tejido gingival10, brote dental madre cells(DBSCs)11y quiste periapical MSCs (hPCy-MSCs)12 se también han identificado.

Friedenstein fue el primero en definir MSCs13. MSCs presentan una alto potencial de proliferación y pueden manipularse para diferenciar antes de ser trasplantado, lo cual sugiere que son candidatos ideales para procedimientos regenerativos10.

Aunque la mayoría de los estudios ha utilizado la médula ósea como fuente de células madre, células derivadas del periostio (PDC) también han sido utilizados recientemente14. El periostio es más fácilmente accesible que es la médula ósea. Por lo tanto, en esta técnica, utilizamos periostio alveolar para eliminar la necesidad de incisiones adicionales durante la cirugía y para reducir la morbilidad postquirúrgica en los pacientes. El periostio es el tejido conectivo que forma el revestimiento exterior de los huesos largos y se compone de dos capas distintas: la capa fibrosa externa compuesta de fibroblastos, colágeno y fibras elásticas15y la capa interior de t-célula-rico de cambium en contacto directo con la superficie del hueso. La capa de cámbium contiene una población de células mixta, principalmente fibroblastos16, osteoblastos17, del pericitos18y una subpoblación crítico identificado como MSCs19,20,21. Mayoría de los estudios ha reportado que PDC es comparable, si no superior, a células madre procedentes de médula ósea (bMSCs) en hueso curativo y regeneración22,23,24. El periostio es fácilmente accesible y exhibe excelente eficacia regenerativa. Sin embargo, pocos estudios se han centrado en el periostio25,26,27.

Con respecto a la reparación del hueso, la práctica clínica actual consiste en el trasplante de células progenitoras perióstica amplificado en andamios de apoyo. Estudios recientes se han centrado en la adquisición de células madre en regiones defectuosas y empleando células progenitoras para regeneración de tejido20. Los dentistas también anticipan futuro aplicación de regeneración periodontal del hueso en tratamientos periodontales e implantes dentales. Con respecto al sitio donador, el periostio puede ser cosechado fácilmente por odontólogos generales. Esto se compara favorablemente contra células estromales de la médula ósea, como el periostio puede accederse durante cirugía bucal rutinaria. Así, el objetivo de este estudio es establecer un protocolo para la recolección de PDC y evaluar la morfología, accesorio, viabilidad y proliferación de las células madre humanas de periostio.

Metabolitos de vitamina D afectan en vivo mineral óseo equilibrio dinámico. Un estudio informó que la 24R,25-(OH)3 2D forma activa de vitamina D es esencial para la diferenciación osteoblástica de humano MSCs (hMSCs)28. Homeostasis del hueso y la reparación son reguladas por una red de metabolitos de vitamina D3 , de que 1,25-(OH)2D3 (calcitriol) es biológicamente más activo y relevante en la regulación de la salud de los huesos. Vitamina D3 es esencial para la calcificación29. En un estudio utilizando ratones de Kunming blanco de 2-d de edad, los cuerpos de embryoid en los ratones indican que suplementos de vitamina C y vitamina D promovieron eficazmente la diferenciación de osteoblastos derivados de ESC30. Entre sus otras actividades biológicas, 1,25-(OH)2D3 estimula la diferenciación en vitro de hMSCs a osteoblastos, que pueden ser monitoreados basados en el incremento en la actividad de la enzima fosfatasa alcalina (ALP) o gen de la OCN expresión.

Algunos estudios han detectado una relación dosis-respuesta de los tratamientos combinados con vitamina C y 1,25-(OH)2D3 en PDC humana con un enfoque particular en la ingeniería de tejido óseo. Por lo tanto, en este estudio, examinamos la concentración óptima para el tratamiento único o combinado de 1,25-(OH)2D3 y la vitamina C para inducir la diferenciación osteogénica de PDC humana. El objetivo de este protocolo es determinar si una población de células aislada del periostio alveolar dental contiene células con un fenotipo MSC y si estas células pueden ser ampliadas en la cultura (en vitro) y distinguidas para formar el tejido deseado . Además, evaluamos la capacidad de PDC se diferencian en osteocitos, condrocitos y adipocitos. La segunda parte del estudio evalúa los efectos de la vitamina C y 10−1010−9, 10−8y 10−7 M 1,25-(OH)2D3 en la actividad osteogénica del PDC. El objetivo principal de este estudio es evaluar las funciones de la vitamina C y 1,25-(OH)2D3 durante la diferenciación osteoblástica de PDC por actividad de la ALP y genes pro-osteogénicos, como ALP, colágeno 1, OCN, BSP y CBFA1. Además, este estudio determina las condiciones de óptimo osteoinductores para humano PDC basado en estos resultados.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

El protocolo de estudio fue aprobado por el institucional de Junta de Chang Gung Memorial Hospital. Todos los participantes proporcionaron consentimiento informado por escrito.

1. preparación de tejido

  1. Cosechan los tejidos periósticos de pacientes durante una cirugía dental (figura 1). Después de la reflexión de la aleta bajo anestesia local, tome un pedazo de tejido del periostio del hueso alveolar utilizando un separador perióstico de31.
  2. Después de la cosecha, almacenar las rebanadas de tejido perióstico de aproximadamente 5 mm × 2 mm en de Dulbecco tampón fosfato salino (DPBS) con 300 U/mL de penicilina y 300 mg/mL de estreptomicina. Transferencia de los tejidos al laboratorio dentro de 24 h.
  3. Pique los fragmentos de tejido perióstico alveolar con bisturí hasta bien picada y mantener las muestras en medio paso 0 (compuesto de 300 U/mL de penicilina y 300 mg/mL de estreptomicina, α-MEM y 5% de suero bovino fetal [SBF]) cultivadas en una incubadora a 37 ° C con aire humidificado (5% dióxido de carbono). En la incubadora, preparar un estanque para mantener la humedad.
  4. Cambiar el medio después de 3 días y dos veces por semana después de eso.
  5. Cuando las células han alcanzado subconfluence (80%), suelte las células adherentes con 200 μL de tripsina 0,25% en la incubadora (37 ° C) durante 3 minutos y luego usar 4,5 mL de medio para terminar la reacción.
  6. Placa las células otra vez en medio fresco paso 1 (α-MEM, 10% FBS, 100 unidades/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina). La placa es 5 x 103 células (como contada por un hemocitómetro).
  7. Cabo cada paso subsecuente después de que las células alcanzar 80% confluencia31.
    Nota: Al principio, el medio será rojo anaranjado. Después de aproximadamente tres días, el color medio debe cambiar a un tono amarillento. El tiempo de duplicación de las células es de aproximadamente 30-40 h, que necesitan 7 días para 3 a 5 generaciones.
  8. Cultura el PDC aislado en α-MEM había suplementado con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 mg/mL de estreptomicina en una incubadora (37 ° C, 5% CO2).
  9. Observar el crecimiento de las células diariamente y reemplace el medio de crecimiento dos veces por semana. Utilizan células de tercera a quinta generación para todos los otros experimentos.

2. citometría de flujo

  1. Cosecha 1 × 106 células a través de la digestión de la tripsina:
    1. Añadir 200 μL de tripsina 0.25%. Después de 3 min, usar 4,5 mL del medio de cultivo que contiene FBS para terminar la reacción de la tripsina y recopilar a través de centrifugación (1500 rpm, 5 min, 22 ° C).
    2. Lavar los gránulos de células tres veces utilizando 1 x DPBS. Resuspender las células en 200 μL de 1 x de buffer de permeabilización. Contar las células con un hemocitómetro.
  2. Examinar los marcadores superficiales expresados expresados de lo PDC por flujo citometría (clasificación celular activado por fluorescencia)32. Uso de anticuerpos monoclonales (MAb) contra CD19 (isotiocianato de fluoresceína (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (ficoeritrina [PE]), CD45 (FITC), (PE) CD73, CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (PE), STRO-1 (Alex) y HLA-DR (FITC)32.
    1. Añadir los anticuerpos a las muestras y la cultura en la oscuridad a 4 ° C por 30 minutos.
    2. Lavar las células con 1 x DPBS tres veces.
    3. Fijar las células con formaldehído al 2% y continuar con flujo cytometry análisis32.

3. apego y viabilidad con osteogénico, Adipogenic y diferenciación condrogénica de células

Inducir la diferenciación de las células en osteogénico, adipogenic y condrogénica por cultivo de las células periósticas en todos los tres pasajes en pozo de seis placas con medios de diferenciación específica.

  1. Para la diferenciación osteogénica, la cultura las células α-MEM con una densidad de 5000 células por pocillo en pozo de seis placas.
    1. Las células en medios que contienen α-MEM, 5% de la cultura en el logro de 80% de confluencia, FBS, β-glicerofosfato (10 mM), 10−7 M dexametasona (0,1 mM) y 5 mL de ácido ascórbico (100 uM). Cultura del control negativo en los medios de comunicación que consiste en α-MEM y el 5% FBS.
    2. Cambiar los medios de comunicación dos veces por semana.
    3. Después de 4 semanas, evaluar el potencial de las células a diferenciarse en un linaje osteogénico mediante tinción de las células utilizando un ensayo de von Kossa, que distingue la presencia de depósitos calcificados en la cultura33.
      1. Añadir el formol al 10% para fijación. Dentro de 30 min., añadir nitrato de plata 5% y tratar bajo luz ultravioleta (UV) por 1 h a temperatura ambiente.
      2. Añadir 5% Na24 cuatro veces, lo que permite 3 minutos para cada reacción. Por último, se lavan las células dos veces con agua destilada.
        Nota: La coloración de Von Kossa es una reacción de precipitación donde los iones de plata y fosfato reaccionan en presencia de materiales ácidos; Esta técnica de tinción no es específica para calcio. En este estudio, cuando el investigado las células fueron tratadas con solución de nitrato de plata, calcio, que es reducida por la luz UV fuerte — fue sustituido por plata, que llegó a ser visible como plata metálica.
  2. Para la diferenciación de adipogenic, cultura las células a una densidad de 5000 células por pocillo en pozo de seis placas que contienen α-MEM.
    1. En el logro de 80% de confluencia, las células en medios que contienen α-MEM 5% FBS, 0.5m m 3-isobutil-1-metilxantina (100 mg/mL), 1% de penicilina, de la cultura 10−6 M dexametasona (1 mM), insulina (5 mg/mL) e indometacina (60 mM).
    2. Cultura del control negativo en los medios de comunicación que consiste en α-MEM y el 5% FBS.
    3. Después de semanas de 6 – 9, utilizar aceite O rojo para teñir las células y para destacar gotas de lípidos, determinando la presencia de adipogenic diferenciación33:
      1. Añadir el formol al 10% para fijación. Dentro de 30 minutos, mancha las células con 0,5% aceite rojo O a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego lavar las células 3 veces con isopropanol al 60% durante 3 minutos cada vez; por último, lavar las células con agua destilada.
        Nota: Aceite rojo O es un lysochrome (soluble en la grasa) tinte diazo utilizado para tinción de lípidos neutros, principalmente ésteres del triacilglicerol, lipoproteínas y colesterol. El colorante se disuelve en las gotitas de lípidos en la célula, rojo que da vuelta las gotitas de lípidos.
  3. Para la diferenciación de condrocitos, células en cultivo en pozo de seis placas con cada bien que contenga 5000 células.
    1. Añadir una diferenciación medio α que contiene-MEM 5% FBS, 10−7 M dexametasona (0,1 mM), piruvato de sodio (100 μg/mL), insulina-transferrina-selenio-A (1 × ITS), factor de crecimiento transformante-β (10 ng/mL) y 5 mL de ácido ascórbico (100 μm).
    2. Cultura del control negativo en los medios de comunicación que consiste en α-MEM y el 5% FBS.
    3. Después de 4 – 5 semanas, usar tinción para destacar los polisacáridos ácidos, tales como los glicosaminoglicanos o algunos tipos de mucopolisacáridos en el cartílago de las células para determinar la presencia de la diferenciación de condrocitos33Azul alcián.
      1. Añadir el formol al 10% para fijación. Dentro de 30 min, Añadir ácido acético al 3% y dejar 2 minutos para la reacción. Posteriormente, lavar con agua destilada tres veces, agregue 1% azul de Alcian 8GX incubados por 30 min y luego lavar con agua destilada. Finalmente, Añadir ácido acético al 3% y lavado por 3 min y luego lavar con agua destilada hasta el final.
        Nota: Las partes de la célula que tiñe específicamente por este colorante se convierten en azul a verde después de tinción y se llaman "alcianófilas."

4. efectos de la 25-dihidroxivitamina D3 (1,25-(OH)2D3) sobre osteogénesis

  1. Divide el P3 a P5 PDC en seis grupos y la cultura en placas de 6 pocillos con diferentes medios de cultivo:
  2. Grupo negativo (α-MEM y el 5% FBS);
  3. Grupo de la vitamina C (α-MEM 5% FBS, glicerofosfato-β de 10 mM y 10−7 M dexametasona + 100 uM vitamina C);
  4. y 10−7 M 1,25-(OH) D2grupo3 (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato de 10 mM y 10−7 M dexametasona + 10−7 M 1,25-(OH)2D3).
  5. Añadir 2 mL del medio a una incubadora (37 ° C) en cada pocillo y cambiar el medio dos veces cada semana.

5. Invierta la reacción en cadena de polimerasa en tiempo real transcripción y cuantitativos

  1. Después de 7 d de la diferenciación de osteoblastos, aislar el ARN total de hielo usando un reactivo comercial (véase Tabla de materiales):
    1. Añadir 1 mL de reactivo de aislamiento a cada pocillo. Añadir 200 μL de bromochloropropane y dejar durante 10 minutos generar RNA capas y luego centrifugar a 10,000 rpm durante 15 min a 4 ° C.
    2. Después de la centrifugación, Añadir 500 μl de 2-propanol a 500 μl del sobrenadante que contiene ARN. Precipitar el ARN en el hielo y dejar 15 minutos para la reacción.
    3. Después del procedimiento, centrifugar a 12.000 rpm durante 15 min a 4 ° C, después de que el ARN se encuentra en la parte inferior del tubo. Posteriormente, retirar el sobrenadante utilizando 1 mL de alcohol del 75% para el lavado y centrifugar a 7.500 rpm durante 8 min a 4 ° C.
    4. Quite el sobrenadante y utilizar un concentrador de vacío para producir arn de la parte inferior del líquido. Recuperar con agua.
  2. Reversa transcribe el RNA (1 μg) utilizando aviar myeloblastosis virus de la transcriptasa reversa. Establecer la reacción en cadena de polimerasa (PCR) a 25 ° C para 10 min seguido de 50 ° C por 60 min y luego 85 ° C por 5 min, antes de finalmente mantener a 4 ° C.
  3. Sintetizar la primera hebra ADN complementario (cDNA). Realizar PCR cuantitativa (qPCR) con 5 μL de 1:10 diluido cDNA. Realizar RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) usando las cartillas para ALP, BSP, OCN, CBFA1 y colágeno-1.
    Nota: Para evitar la contaminación de ADN por las señales, las secuencias de avance y retroceso de cada cartilla fueron diseñadas en diferentes exones.
  4. Realizar qPCR utilizando comercial PCR Master Mix (véase Tabla de materiales) según las instrucciones del fabricante. Establecer el termociclador a 50 ° C por 2 min seguido de 95 ° C por 10 min y luego 40 ciclos cada uno a 95 ° C por 15 s seguido de 60 ° C durante 60 s.
    Nota: El protocolo SYBR también requiere una etapa de curva de fusión, que corre a 95 ° C por 15 s, 60 ° C durante 60 s y luego a 95 ° C por 15 s.
  5. Normalizar los valores de umbral de ciclo para el ALP, BSP, CBFA1, colágeno-1 y OCN a la limpieza gene de la GAPDH. 34
  6. Pares de cartilla se enumeran en la Tabla de materiales.

6. actividad fosfatasa alcalina

  1. Evaluar la actividad de la enzima fosfatasa alcalina de las células mediante la técnica anteriormente descrita35, que se convierte p- nitrofenil fosfato de p- nitrofenol; p- nitrofenil fosfato es un sustrato de la fosfatasa que se vuelve amarillo cuando defosforilaciones por ALP, determinado en una longitud de onda de 405 nm. Normalizar el total de p- nitrofenol formado en base a la proteína total según lo determinado por el ensayo de Bradford.
  2. Comparar las actividades de la fosfatasa alcalina del control (α-MEM, 5% SBF), vitamina C (α-MEM, 5% FBS, glicerofosfato-β de 10 mM, 10−7 M dexametasona + 100 uM vitamina C), 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato de 10 mM y 10−7 M dexametasona + 10−8 M 1,25-(OH)2D3) y vitamina C + 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, glicerofosfato-β de 10 mM, 10−7 M dexametasona + 100 uM +1,25-(OH) de vitamina C2D3) grupos después de 1, 2, 3 y 4 semana de la cultura.
  3. Realizar un procedimiento de extracción de la proteína en el hielo:
    1. Raspar las células de las placas de 6 pozos y añadir 50 μl de tampón de lisis. Posteriormente, coloque las células en el hielo durante 30 minutos destruir las células y liberar la proteína.
    2. Después de 30 min, centrifugar a 13000 rpm a 4 ° C durante 15 minutos. Después de la centrifugación, extraer el sobrenadante para el almacenamiento y uso.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Para los ensayos cuantitativos, los datos se presentan como media ± desviación estándar (SD). Todos los análisis estadísticos se realizaron mediante de Student t-test. En total, se obtuvieron 34 muestras con una edad media de participantes de 48,1 ± 12,3 y once de estas muestras se obtuvieron de pacientes masculinos y 23 pacientes femeninos. Se obtuvieron muestras de veinte y ocho de las regiones molares y de seis de las regiones anteriores; 26 se obtuvieron de la maxila y 8 de la mandíbula. La duración promedio entre el procedimiento dental y la cultura fue 0,5 ± 0,1 h. De las 34 muestras investigadas, 20 rindió con éxito las colonias MSC, con una tasa de éxito del aislamiento de 58,8%. No hubo diferencias significativas se observaron en ninguno de los parámetros entre el con éxito y el PDC sin éxito aislado (edad media: 48,8 ± 13.0 vs 47.1 ± 11.5 y, sexo: 7 hombres [35%] frente a 4 hombres [28.6%], ubicación: 15 de las regiones molares [75%] versus 13 [92,9%] y 15 de el maxilar [75%] vs 11 [78.6%], respectivamente).

Aislamiento y la morfología de la célula: condrogénica osteogénico, y la diferenciación de adipogenic

Días 1-9, PDC formaron colonias y grupos esféricos. Mayoría de las células exhibieron un aspecto de huso y fueron homogénea bajo un microscopio de contraste de fase (figura 2). Después de 14 d de la cultura, la morfología de la célula apareció en forma de huso como se observa en el microscopio de contraste de fase. Tras las celdas de primera generación, las células ya no crecieron en racimos pero exhibieron la proliferación generalizada y uniforme.

El MSCs eran spindle-shaped con procesos irregulares y firmemente conexión a la placa de cultivo después de 1-3 d de cultivo primario (Figura 2a). La cultura inicial exhibió pequeña, alrededor de las células y de células spindle-shaped debajo de un microscopio óptico. Las células cultivadas exhibieron una forma homogénea, fibroblasto-como huso del primer paso (Figura 2a). El estudio de la diferenciación reveló que el PDC puede ser subpassaged y diferenciado en vitro en osteoblastos (figura 2b), condrocitos (figura 2C) y adipocitos (Figura 2d).

Al final de la diferenciación osteogénica, von Kossa coloración indicaron la presencia de depósitos de calcio y Diferenciación osteogénica (figura 2b). Estos resultados indican fuertemente que entre poblaciones perióstico de la célula, las células progenitoras poseen el potencial de diferenciarse en células osteogénicos.

Para evaluar la producción de proteoglicanos, mancha azul de Alcian fue utilizada como un indicador para determinar la presencia de la diferenciación de condrocitos (figura 2C). Las células diferenciadas con éxito en condrocitos. Estos resultados sugieren que, entre poblaciones de perióstico de la célula, las células progenitoras poseen el potencial de diferenciarse en células condrogénica.

Las células fueron cultivadas en los medios específicos mencionados para desencadenar adipogenic diferenciación. Después de 8 semanas, aceite rojo que o fue utilizado para detectar la existencia de lípidos intracelulares. Siguiente tinción intracelular de grasa microscópica gotas se observaron en cinco muestras diferenciadas (Figura 2d).

Análisis de expresión de marcador superficial cytometric del flujo para PDC

Se realizó un análisis de citometría de flujo para confirmar la expresión de la mesénquima superficial del marcador en la superficie de las células. MSC marcadores CD73, CD90, STRO-1 y CD44 eran fuertemente positivos en el PDC, mientras que los marcadores de linaje hematopoyético, HLA-DR, CD19, CD34 y CD45 eran negativos.

Efectos de la vitamina D varios 3 concentraciones en osteogénesis

Aunque los resultados confirman los efectos positivos del 1,25-(OH)2D3 (calcitriol) en actividad osteogénica, se observaron diferencias estadísticamente significativas sólo entre algunos de los cambios de doblez en las expresiones de mRNA de la osteogénica enzimas. Este análisis podría sido sesgado por los altos valores de SD, que pueden ser atribuidos a las desviaciones individuales entre los hosts.

Expresión del ARN mensajero de la fosfatasa alcalina

Los cambios de doblez en la expresión del mRNA de la fosfatasa alcalina después de 1 semana de cultura fue 7.43 (SD = 3.96) en el grupo de vitamina C y 7.15 (SD = 4.88), 9.30 (SD = 5,63), 12,92 (SD = 7.95) y 6.60 (SD = 6.33) en la 10−10−10910−8 y 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupos, respectivamente (figura 4a). Los niveles de expresión de mRNA de ALP en la vitamina C, 10−8 M 1,25-(OH)2D3y 10−9 M 1,25-(OH)2D3 grupos fueron significativamente mayores (p < 0.05) que los de los otros grupos, lo que indica la mayor expresión del mRNA ALP en estos grupos. El control se establece en el valor 1. En este estudio se observaron los siguientes aumentos de doblez en las expresiones de mRNA ALP: 7.43-fold en el grupo de vitamina C; 9.30-fold en 10−9 M 1,25-(OH)2D3 grupo; y 12.92-fold en el grupo de 10−8 M 1,25-(OH)2D3 .

Aunque se observó un mayor cambio de doblez en las expresiones de mRNA ALP en el grupo de 10−8 M 1,25-(OH)2D3 , diferencias estadísticamente significativas no fueron observadas con respecto a estos niveles de expresión entre este grupo y la negativo y los grupos de vitamina C (p = 0.20 y p = 0,52, respectivamente).

ALP es un fuerte indicador para determinar la temprana Diferenciación osteogénica de las células. ALP también sirve como un ectoenzyme para la degradación del pirofosfato inorgánico y libera fosfato durante la mineralización36. El PDC tratados con vitamina C y 10−8 y 10−9 M 1,25-(OH)2D3 exhibieron diferencias significativas cuando se compararon con los de los otros grupos (figura 4a).

Expresión del ARN mensajero del sialoprotein del hueso

Los cambios de doblez en las expresiones de mRNA de BSP después de 1 semana de la cultura fueron 3.21 (SD = 1,20) y 4.18 (SD = 2,55), 10.34 (SD = 10.31), 24.91 (SD = 23.44) y 5.24 (SD = 3.54) en la vitamina C y los 10−1010−910−8 y 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupos, respectivamente (Figura 4b). Las expresiones de BSP mRNA fueron mayores en el grupo de3 10−8 M 1,25-(OH)2D, pero con ninguna significación estadística en comparación con las expresiones correspondientes en los otros grupos.

Las expresiones de mRNA BSP en la vitamina C y 10−10 M 1,25-(OH)2D3 grupos fueron significativamente mayores (p < 0.05) que en los otros grupos, lo que indica que la vitamina C y 10−10 M 1,25-(OH) 2 D3 promueve la expresión de BSP. El control se establece en un valor de 1. La vitamina C y los 10−10 M 1,25-(OH)2D3 grupos exhibieron un incremento de 3,21 y 4.18 veces en las expresiones de mRNA BSP, respectivamente. 10−9 M y 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupos exhibieron mayores expresiones de mRNA BSP que hicieron los otros grupos. 10−9 y 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupos exhibieron un aumento en las expresiones de mRNA BSP, a veces 10.34 y 24.91 respectivamente, pero este aumento no fue estadísticamente significativa (p) > 0.05). Una posible explicación es que las células no fueron todos obtenidos del mismo participante. Así, las diferencias de potencial podrían haber aumentado la SD y afectaron, en consecuencia, los resultados estadísticos.

Expresión del ARN mensajero de CBFA1

Los cambios de doblez en las expresiones de CBFA1 mRNA después de 1 semana de la cultura fueron 0,96 (SD = 0.10) y 0,90 (SD = 0,26), 1.01 (SD = 0,25), 1.31 (SD = 0.32) y 1.12 (SD = 0.35) en la vitamina C y los 10−1010−9, 10−8 y 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupos, respectivamente (figura 4 c). El 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupo exhibió mayores expresiones de mRNA de CBFA1. No marcados se observaron cambios en las expresiones de gene CBFA1 mRNA en los grupos de tratamiento o en el grupo control. Además, no se observó ningún aumento significativo en la expresión de los marcadores de mRNA después de la adición de vitamina C o 1,25-(OH)2D3. Por otra parte, no hubo diferencias significativas intergrupos fueron observados.

Expresión del ARN mensajero de colágeno-1

Los cambios de doblez en la expresión del mRNA de colágeno-1 después de 1 semana de la cultura fueron 0,98 (SD = 0.17) y 0,85 (SD = 0.16), 1.05 (SD = 0.16), 1.52 (SD = 0,36) y 1.01 (SD = 0.33) en la vitamina C y los 10−1010−910−8 y 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupos, respectivamente (figura 4 d). Las expresiones de colágeno-1 mRNA fueron mayores en el grupo de 10−8 M 1,25-(OH)2D3 pero sin diferencias estadísticamente significativas en comparación con las expresiones correspondientes en los otros grupos.

Los 10−8 M 1,25-(OH)2D3 y control grupos exhiben diferencias estadísticamente significativas en sus resultados (p < 0.05). El control se establece en un valor de 1. Se observó un 1.52-fold aumento en las expresiones de colágeno-1 mRNA. 10−10 M 1,25-(OH)2D3 y los 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupos mostraron diferencias significativas en sus resultados (p < 0.05).

Expresión del ARN mensajero de osteocalcina

Los cambios de doblez en las expresiones OCN mRNA después de 1 semana de la cultura fueron 0.60 (SD = 0.1) y 0,78 (SD = 0.18), 1,13 (SD = 0,55), 2.59 (SD = 1.59) y 1.61 (SD = 0.73) en la vitamina C y los 10−1010−9, 10−8 y 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupos, respectivamente (Figura 4e). Las expresiones OCN mRNA fueron mayores en el grupo de 10−8 M 1,25-(OH)2D3 pero sin diferencias estadísticamente significativas en comparación con las expresiones correspondientes en los otros grupos.

Ningún aumento significativo se observó en las expresiones de los marcadores OCN mRNA después de la adición de vitamina C o 1,25-(OH)2D3. Sin embargo, las expresiones de mRNA OCN disminuyeron después del tratamiento de vitamina C. El control se establece en el valor 1. Las expresiones OCN basals exhibieron una disminución significativa (p < 0.05) de la 0.6-fold durante la diferenciación osteoblástica. El mRNA OCN expresiones fueron significativamente mayores (p < 0,001) en las células cultivadas en 10−8 M 1,25-(OH)2D3 que en las expresiones correspondientes de los otros grupos, que exhibió un pliegue medio aumento de 2.59. sin embargo, estos resultados no fueron estadísticamente significativos (p > 0.05). Una posible explicación es que las células no fueron todos obtenidos del misma participante; así, las diferencias de potencial podrían haber aumentado la SD y afectaron, en consecuencia, los resultados estadísticos.

Ensayo de actividad de fosfatasa alcalina

Un estudio anterior demostró que 1,25-(OH)2D3 es más eficaz en una concentración de 10−8 M; por lo tanto, 10−8 M fue utilizado en el grupo de prueba para comparar la capacidad osteogénica de 1,25-(OH)2D3 con el de la negativa, vitamina C y vitamina C + 1,25-(OH)2D3 grupos. La capacidad osteogénica se expresó por la actividad de la ALP. Después de 1 semana de la cultura (figura 5a), los cambios de doblez en la actividad de la fosfatasa alcalina eran 1.00 (SD = 0.00), 1.92 (SD = 0,89), 3,77 (SD = 1.66) y 1.46 (SD = 0.49) en negativo, C, D y C + D, respectivamente. Entre todos los grupos, sólo se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos D y negativa (p = 0,03; Figura 5a). Después de 2 semanas de la cultura, los cambios de doblez en la actividad de la fosfatasa alcalina (figura 5b) eran 1.00 (SD = 0.00), 2.32 (SD = 1.68), 4.98 (SD = 3.02) y 4,86 (SD = 2.73) en negativo, C, D y C + D, respectivamente. No hubo diferencias estadísticamente significativas se observaron en ninguno de los grupos. Después de 3 semanas de la cultura, los cambios de doblez en la actividad de la fosfatasa alcalina (figura 5 c) eran 1.00 (SD = 0.00), 2,93 (SD = 2.15), 5.76 (SD = 3.60) y 5.61 (SD = 3.88) en negativo, C, D y C + D, respectivamente. Otra vez, no hubo diferencias estadísticamente significativas se observaron en ninguno de los grupos (figura 5C). Después de 4 semanas de la cultura, los cambios de doblez en la actividad de la fosfatasa alcalina (Figura 5D) eran 1.00 (SD = 0.00), 2,83 (SD = 1,97), 3.79 (SD = 0.77) y 4.24 (SD = 2.87) en negativo, C, D y C + D, respectivamente. Aquí, los grupos D y negativo mostraron diferencias estadísticamente significativas (p = 0.00; Figura 5 d).

En la semana 1, sólo el 10−8 M 1,25-(OH) D23 grupo exhibió diferencias significativas en comparación con el grupo control (p = 0,03). En la semana 2, los 10−8 M 1,25-(OH)2D3 y vitamina C grupos exhiben diferencias significativas en comparación con el grupo control (p = 0.0498). En la semana 3, ninguno de los grupos exhiben diferencias significativas en comparación con el grupo de control. En la semana 4, la 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupo exhibió diferencias significativas en comparación con el grupo de control. Esto indica que 10−8 M 1,25-(OH)2D3 promueve la actividad de fosfatasa alcalina.

En breve, el 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupo exhiben aumento de ALP y colágeno-1 la expresión del mRNA; el grupo de la vitamina C exhibe ALP significativamente mejorada y la expresión del mRNA BSP; y el grupo de3 10−9 M 1,25-(OH)2D mejorado significativamente la expresión del mRNA de la ALP. En 1 semana, se observó mayor actividad de la ALP en las vitamina C y 1,25-(OH)2D3 grupos pero sin diferencias estadísticamente significativas en comparación con los correspondientes niveles de expresión en los otros grupos. De 2 semanas a 4, vitamina C y 1,25-(OH)2D3 grupos exhibieron resultados similares. Por lo tanto, estos resultados no podían dilucidar claramente los efectos sinérgicos de vitamina C y 1,25-(OH)2D3 en la diferenciación osteogénica de las células (actividad de la fosfatasa alcalina).

Figure 1
Figura 1: periostio alveolar humano. Los tejidos periósticos se cosecharon durante la cirugía dental. El asterisco indica la ubicación del periostio alveolar.

Figure 2
Figura 2: estudio de la diferenciación. El MSCs eran spindle-shaped con procesos irregulares y firmemente conectado a la placa de cultivo después de 1-3 d de cultivo primario (A; el asterisco indica la ubicación de las células madre mesenquimales). Bajo condiciones de cultivo en vitro , las MSCs se subpassaged y diferenciar en osteoblastos (B, el asterisco negro indica la zona manchada por von Kossa), condrocitos (C, el asterisco azul indica el área manchado por Azul de Alcian) y adipocitos (D, el asterisco rosa indica el área manchado por aceite O rojo). Figura 2 se reutiliza de internacional de investigación biomédica, volumen 2016, 3529561 de ID de artículo25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
3 figura: citometría de flujo. Marcadores de superficie expresados por MSCs fueron CD73 (65,2%), CD90 (75.6%), STRO-1 (65,2%) y CD44 (88.1%) pero no CD45 (1.34%), CD34 (1.61%), CD19 (2.18%), o de HLA-DR (2.20%). '%' en la figura denota una relación positiva. El grupo de control (α-MEM y el 5% FBS) está representado por la línea roja. El grupo experimental está representado por la línea azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: expresiones mRNA. Expresiones de mRNA de la diferenciación de osteoblastos para 1 semana. BSP de ALP (B) (A), (C) CBFA1, (D) COL-I y (E) OCN. p < 0.05 es *, p < 0.01 es **, p < 0.001 es ***. El cambio de doblez de mRNA es versus control (α-MEM y el 5% FBS). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: actividad de la fosfatasa alcalina. Actividad de la fosfatasa alcalina ensayo de diferenciación de osteoblastos para (A) (B) semana 2, semana 1, semana (C) 3 y (D) semana 4. p < 0.05 es *, p < 0,01 es **, p < 0.001 es ***. El cambio doble es versus control (α-MEM, 5% FBS). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Una modalidad terapéutica desarrollada recientemente, es decir, recreando el tejido del que implique MSCs, tiene numerosas ventajas. MSCs, que están presentes en varios tipos de tejidos, son células pluripotentes que pueden diferenciarse en una variedad de células de tejidos mesodérmicos funcionales37 y otras células como los osteoblastos.

El periostio sirve como un nicho para las células del progenitor y como una fuente de rica vasculatura para el hueso envuelve a38. En nuestro estudio, de las 34 muestras investigadas, 20 rindió con éxito las colonias MSC, con una tasa de éxito del aislamiento de 58,8%. MSCs derivadas del periostio fueron seleccionados en este estudio se basa en su proliferación y Diferenciación osteogénica habilidades. La tasa de proliferación de las células periósticas fue mucho mayor que el de células del estroma de médula22. Con respecto a la capacidad osteogénica del periostio, Ousual24 sostuvo que la capacidad osteogénica de células madre procedentes de periostio (EMSP) era inferior a la de BMSCs. Sin embargo, Yoshimura atestigua que la capacidad osteogénica de EMSP superó a la de BMSCs39. Hayashi et al. MSCs adultos periósticas demostradas como candidatos ideales de regeneración de tejido óseo24. Además, MSCs adultos periósticas se consideran útiles para acortar el período de la cultura de célula, reduciendo así el costo y el riesgo de contaminación22. Según se informa, el envejecimiento también afecta la actividad mitogénica de la osteoprogenitor células40. Un estudio informó 1,25-(OH)2D3 inducido por un mayor grado de estimulación de la diferenciación osteoblástica en vitro en hMSCs del más joven de los participantes (edad < 65 y)41. El presente estudio incluyeron el uso de las células periósticas obtenidas de adultos jóvenes (edad < 65 y). Se requieren estudios adicionales para comparar la capacidad de regeneración de hueso perióstico células entre los donantes viejos y jóvenes.

En este estudio, una población celular fue aislada basado en su propiedad de plástico adherente, según lo descrito por Friedenstein et al. 13. el PDC cosechó aquí adherido al plástico de la cultura de célula. Los marcadores de esenchymal (CD 73 90 CD, STRO-1 y CD 44) de los antígenos de la superficie de estas células de cultivo primario exhiben expresiones significativas. Además, los marcadores hematopoyéticos (CD 45, CD 34, CD 19 y HLA-DR) eran ausentes, indicando que las células cultivadas eran de origen mesenquimal. La diferenciación osteogénica condrogénica y adipogenic de la PDC se podía inducir utilizando medios específicos de diferenciación, como se describe en otros estudios que evalúan las muestras obtenidas de médula y tejido gingival42. Los resultados del presente estudio cumplen con los estándares mínimos para la definición fenotípica y funcional de MSCs humanos aceptados por la sociedad internacional de terapia celular4. En el presente estudio, MSCs de periostio humano eran aislados y ampliados, que reveló características similares a las descritas por lo general de BMSCs.

Los estudios han propuesto que la dexametasona, ascorbato y β-glicerofosfato causan BMSCs a Diferenciación osteogénica43. Otro estudio demostró eso 1α, 25-dihidroxivitamina D3 (1,25-(OH)2D3) en combinación con ácido ascórbico promovido la célula de vástago diferenciación44. Por lo tanto, dexametasona, ascorbato y β-glicerofosfato agregaron en este estudio para promover la diferenciación de células madre. Los patrones observados fueron similares en todas las muestras de tres pacientes de la célula. En este estudio, MSCs se identificaron con éxito del periostio alveolar con una tasa de aislamiento del 58,8%. No hubo diferencias estadísticamente significativas fueron observadas en la tasa de éxito con respecto a edad, sexo y localización.

El presente estudio experimental investigado dos sustancias, a saber, 1,25-(OH)2D3 y vitamina C, que pueden estimular la diferenciación osteogénica de células madre. Un estudio de 200845 indicó que 1,25-(OH)2D3 es crucial para el metabolismo óseo y la homeostasis de calcio y afecta el sistema cardiovascular a través de mecanismos aún por ser completamente entendido. En otro anterior estudio46, 1,25-(OH)2D3 estimula la diferenciación en vitro de MSCs humanos en osteoblastos. La capacidad de 1,25-(OH)2D3 para inducir BMSCs indiferenciadas que se diferencian en células osteoblásticas en vitro se ha demostrado en varios estudios explorando diferentes sistemas46. Algunos estudios también han demostrado que, cuando se añade a las culturas de células osteoblásticas, 1,25-(OH)2D3 inhibe la proliferación celular pero aumenta la expresión de los marcadores osteoblásticos como ALP, osteopontina, OCN y matriz Gla proteína47,48. Un estudio previo informó que 1,25-(OH)2D3 normalmente inhibe la proliferación celular e induce osteoblast diferenciación49. Una en vitro estudio llevado a cabo en células murinas indicó que 1,25-(OH)2D3 puede promover las primeras etapas de osteoblastogenesis9. Además, otro estudio en vitro sugirieron que, temprano y último MSCs,1,25-(OH)2D3 puede estimular marcadores de diferenciación osteogénica, incluyendo fosfatasa alcalina, osteopontina, BSP y OCN43.

Ambos OCN — considerado responsable del control de la síntesis de matriz — y colágeno 1A1, la proteína más abundante de la matriz — es crucial hueso ácido las proteínas de la matriz que desempeñan un papel vital en la síntesis de matriz. Además, son característicos osteoblastos maduros formando matriz. 50 un estudio previo informó que 1,25-(OH)2D3 tratamiento estimula la expresión de colágeno aumento 1A1 pero no CBFA1 o ALP gene expresión34. Evaluaciones de los genes implicados en la diferenciación osteoblástica han revelado que 1,25-(OH)2D3 tratamiento aumentó la expresión de OCN51,52,53. En nuestro estudio, los resultados mostraron que 1,25-(OH)2D3 ejerce efectos positivos sobre la actividad osteogénica. En comparación con los otros grupos, 10−8 M 1,25-(OH)2D3 demostró la mayor expresión del ARNm de ALP, BSP, CBFA1, OCN y Col1. Entre éstos, los resultados de ALP y Col1 alcanzaron significación estadística. Por lo tanto, las condiciones óptimas se obtuvieron al utilizar 10−8 M 1,25-(OH)2D3. expresión del ARNm de BSP en la 10−10 M 1,25-(OH)2D3 grupo incrementado significativamente (p < 0.05). Sin embargo, no hubo diferencias estadísticamente significativas fueron observadas en los cambios de doblez en las expresiones de mRNA de CBFA1 y OCN. Al revisar la expresión del ARNm del gen, los resultados del experimento indicaron en vitro la diferenciación osteogénica. Basado en estos resultados, la osteogénesis observada en la negativa, vitamina C y 10−10, 10−9, 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupos fue más débil que en los 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupo. Estos resultados llevaron a la especulación que 1,25-(OH)2D3 ceba PDC por regular las proteínas de la matriz necesarias para la mineralización (1A1 de colágeno).

Un estudio previo informó OCN como un objetivo prioritario de 1,25-(OH)2D3, que aumentó notablemente OCN expresión52. Deposición de la OCN puede verse como un marcador de la diferenciación osteogénica de PDC. Además, expresión de la OCN ha sido evaluado como marcadores osteogénicos finales54. OCN es un marcador confiable para hueso formación y osteogénesis55. Por lo tanto, expresión OCN se relaciona generalmente con la capacidad de mineralización de las células. OCN es un biomarcador sensible de los osteoblastos maduros. Una en vitro osteogénico comparación, marcado elevada expresión del mRNA de la OCN se observó en el 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupo.

Un estudio indica que actividad ALP fue inhibida por transformación de factor de crecimiento beta (0.1-10 ng/mL) y promovido con 1,25-(OH)2D3 (50 nM)46. Estos resultados implican que 10−8 M 1,25-(OH) D23 promueve el desarrollo de maduración y hueso de la célula de vástago. Actividad de fosfatasa alcalina en las concentraciones observadas óptima de 10−8 M 1,25-(OH)2D3 se comparó con la en las concentraciones correspondientes de vitamina C. El PDC expresa actividad de fosfatasa alcalina. Por otra parte, la adición de 1,25-(OH)2D3 aumentó la actividad ALP y había promovido la diferenciación osteoblástica en el PDC. En los tres ajustes, vitamina C, 10−8 M 1,25-(OH)2D3y vitamina C + 10−8 M 1,25-(OH)2D3 aumentó la actividad ALP en 1 semanas (figura 4a), 2 (Figura 4b), 3 ( Figura 4 c) y 4 (figura 4 d) varias veces en comparación con la del grupo control negativo. En las semanas 1 y 4, actividad ALP aumentó significativamente en el grupo 10−8 M 1,25-(OH)2D3 . En la semana 2, actividad ALP aumentó significativamente en la vitamina C y 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupos.

A través de un estudio comparativo de varios humanos MSCs en el paso 3, Sakaguchi et al. 56 encontró que BMSCs y EMSP posee similar capacidad osteogénica. Por lo tanto, es probable que puede acortarse el período de cultivo de células utilizando células periósticas, que a su vez reduciría el riesgo de contaminación y coste. El uso de hMSCs temprano paso evita los efectos senescentes de la expansión de la cultura. Ousual y Yoshimura utilizan MSCs en el paso 3 y subcultivada para 2 semanas bajo condiciones de diferenciación osteogénica35. Por lo tanto, el tiempo de paso se debe considerar cuando se comparan las actividades celulares de diferentes fuentes de células. En este estudio, se utilizaron PDC de tercera generación porque el potencial osteogénico de las células madre de las generaciones posteriores de PDC es menor que la de las células de vástago del PDC de tercera generación.

Cuando cultivadas en un medio de suero humano, periostio células puede no sólo mantener su forma, pero puede también fijar, mantener la actividad y lograr crecimiento de la célula. En Resumen, en base a estos resultados, PDC humano posee la capacidad de sobrevivir, proliferar y diferenciarse en el linaje osteogénico en vitro, que es crucial en la evaluación de eficacia en vivo. El periostio es rico en MSCs y es así conveniente para ingeniería de tejidos. El periostio de la encía presenta menos complicaciones. Por lo tanto, el hueso alveolar se considera un sitio donante ideal. Los resultados demostraron claramente la posibilidad de igualmente aislamiento MSCs del periostio y lograr su diferenciación en osteoblastos, condrocitos y adipocitos. En este estudio, los efectos de la vitamina C sobre el potencial osteogénico del PDC fueron comparados con los de 1,25-(OH)2D3 a diferentes concentraciones. La concentración más efectiva era 10−8 M 1,25-(OH)2D3. 10−8 M 1,25-(OH) D23 tratamiento durante todo el período de la cultura fue un método efectivo y económico de inducir la diferenciación osteogénica en PDC. En conclusión, la vitamina C y 1,25-(OH)2D3 promoción la diferenciación osteogénica de PDC. Sin embargo, estos exhibieron ningún efecto sinérgico significativo en los resultados de la actividad de fosfatasa alcalina. Teniendo en cuenta el pequeño tamaño de muestra, muestras adicionales se requieren para la evaluación adicional. Así, PDC cultivada bajo condiciones osteogénicos puede ser útil para ingeniería de tejidos óseos y ofrecen la ventaja de mayor proliferación celular.

Pasos críticos de este protocolo incluyen pasos 1.2 y 1.3 (iniciar el procedimiento de cultivo dentro de 24 horas de recolección y mantenimiento adecuados después de eso). Debe evitarse la contaminación del tejido y es obligatorio uso de técnica aséptica. Una limitación de este protocolo es que, en comparación con las células madre de médula ósea o tejido adiposo de abastecimiento, abastecimiento de células madre de tejido dental es limitado en cuanto a la cantidad baja de células que pueden obtenerse a través de esta técnica.

La identificación y caracterización de células madre periósticas pueden proporcionar información valiosa sobre las funciones y el potencial regenerativo de este tejido, así como su aplicabilidad en terapia regenerativa. Una condición óptima se obtuvo con 10−8 M 1,25-(OH)2D3. Por lo tanto, el tratamiento de la PDC con 10−8 M 1,25-(OH)2D3 promueve la diferenciación osteogénica. Los estudios futuros deben examinar la aplicación en vivo del 10−8 M 1,25-(OH)2D3 para ingeniería de tejidos óseos eficaz y económica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El protocolo de estudio fue aprobado por la Junta de revisión institucional para investigación de Chang Gung Memorial Hospital Clínico (IRB99-1828B, C 100-3019, 99-3814B, C 102-1619, 101-4728B y C 103-4223). Este estudio fue apoyado por Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 y NMRPG3C0151). Este manuscrito fue editado por Wallace de edición académica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt Sigma 49752
35-mm culture dishes Corning 430165
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
6  well plate Corning 3516
Alkaline phosphatase ABI Hs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit BioVision K412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase Roche 10109118001
CD146 BD 561013
CD19 BD 560994
CD34 BD 560942
CD44 BD 561858
CD45 BD 561088
CD73 BD 561014
CD90 BD 561974
Cell banker1 ZEAOAQ 11888
core binding factor alpha-1 ABI Hs00231692_m1
dexamethasone Sigma D4902
DPBS Gibco 14190250
FBS Gibco 26140-079
GAPDH ABI Hs99999905_m1
HLA-DR BD 562008
indomethacin Sigma I7378
insulin sigma 91077C
insulin–transferrin–selenium-A Sigma I1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) Life 4346907
MicroAmp optical adhesive film Life 4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification HyClone SH30265.02
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Permeabilization buffer eBioscience 00-8333-56
Sodium pyruvate Gibco 11360070
STRO-1 BioLegend 340103
SYBER Green PCR Master Mix AppliedBiosystems 4309155
TaqMan Master Mix Life 4304437
transforming growth factor-β Sigma T7039 
Trizol reagent (for RNA isolation) Life 15596018
β-glycerophosphate Sigma G9422
collagen-1 Invitrogen forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCN Invitrogen forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSP Invitrogen forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kao, R. T., Murakami, S., Beirne, O. R. The Use of Biologic Mediators and Tissue Engineering in Dentistry. Periodontol. 50, 127-153 (2000).
  2. Rosenbaum, A. J., Grande, D. A., Dines, J. S. The Use of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Engineering: A Global Assessment. Organogenesis. 4, 23-27 (2008).
  3. Yen, T. H., Wright, N. A., Poulsom, R. Bone Marrow Stem Cells: From Development to Therapy. Horizons in Medicine. Franklyn, J. 16, Royal College of Physicians of London. London, UK. 249-257 (2004).
  4. Dominici, M., et al. Minimal Criteria for Defining Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. The International Society for Cellular Therapy Position Statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  5. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal Human Dental Pulp Stem Cells (DPSCs). In Vitro and In Vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13625-13630 (2000).
  6. Miura, M., et al. Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5807-5812 (2003).
  7. Seo, B. M., et al. Investigation of Multipotent Postnatal Stem Cells from Human Periodontal Ligament. Lancet. 364, 149-155 (2004).
  8. Sonoyama, W., et al. Mesenchymal Stem Cell-Mediated Functional Tooth Regeneration in Swine. PLOS ONE. 1, e79 (2006).
  9. Morsczeck, C., et al. Isolation of Precursor Cells (PCs) from Human Dental Follicle of Wisdom Teeth. Matrix Biol. 24, 155-165 (2005).
  10. Mitrano, T. I., et al. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81, 917-925 (2010).
  11. Di Benedetto, A., Brunetti, G., Posa, F., Ballini, A., et al. Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Dental Bud: Role of Integrins and Cadherins. Stem Cell Res. 15, 618-628 (2015).
  12. Marrelli, M., Paduano, F., Tatullo, M. Cells Isolated from Human Periapical Cysts Express Mesenchymal Stem Cell-like Properties. Int J Biol Sci. 9 (10), Published online Nov 16 1070-1078 (2013).
  13. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in Transplants of Bone Marrow Cells. J Embryol Exp Morphol. 16, 381-390 (1966).
  14. Perka, C., Schultz, O., Spitzer, R. S., Lindenhayn, K., Burmester, G. R., Sittinger, M. Segmental Bone Repair by Tissue-Engineered Periosteal Cell Transplants with Bioresorbable Fleece and Fabrin Scaffolds in Rabbits. Biomaterials. 21, 1145-1153 (2000).
  15. Taylor, J. F. The Periosteum and Bone Growth. Hall, B. K. , CRC Press. Boca Raton. Bone Growth VI (1992).
  16. Squier, C., Ghoneim, S., Kremenak, C. Ultrastructure of the Periosteum from Membrane Bone. J Anat. 171, 233-239 (1990).
  17. Aubin, J., Triffitt, J. Mesenchymal Stem Cells and Osteoblast Differentiation. Principles of Bone Biology. Bilezikian, J., Raisz, L. G., Rodan, G. A. , Academic Press. San Diego. 59-81 (2002).
  18. Diaz-Flores, L., Gutierrez, R., Lopez-Alonso, A., Gonzalez, R., Varela, H. Pericytes as a Supplementary Source of Osteoblasts in Periosteal Osteogenesis. Clin Orthop Relat Res. 275, 280-286 (1992).
  19. Lim, S. M., Choi, Y. S., Shin, H. C., Lee, C. W., Kim, S. L., Kim, D. I. Isolation of Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Using Immunophenotypes for Chondrogenesis. Biotechnol Lett. 27, 607-611 (2005).
  20. Stich, S., et al. Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Express Distinct Chemokine Receptors and Migrate Upon Stimulation with CCL2, CCL25, CXCL8, CXCL12, and CXCL13. Eur J Cell Biol. 87, 365-376 (2008).
  21. Choi, Y. S., et al. Multipotency and Growth Characteristic of Periosteum-Derived Progenitor Cells for Chondrogenic, Osteogenic, And Adipogenic Differentiation. Biotechnol Lett. 30, 593-601 (2008).
  22. Agata, H., et al. Effective Bone Engineering with Periosteum-Derived Cells. J Dent Res. 86, 79-83 (2007).
  23. Ribeiro, F. V., et al. Periosteum-Derived Cells as an Alternative to Bone Marrow Cells for Bone Tissue Engineering Around Dental Implants. A Histomorphometric Study in Beagle Dogs. J Periodontol. 81, 907-916 (2010).
  24. Hayashi, O., et al. Comparison of Osteogenic Ability of Rat Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Periosteum and Adipose Tissue. Calcif Tissue Int. 82, 238-247 (2008).
  25. Hong, H. H., Hong, A., Yen, T. H., Wang, Y. L. Potential Osteoinductive Effects of Calcitriol onthe m-RNA of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Alveolar Periosteum. BioMed Res Int. , Article ID 3529561 (2016).
  26. Knothe, U. R., Dolejs, S., Miller, R. M., Knothe Tate, M. L. Effects of Mechanical Loading Patterns, Bone Graft, and Proximity to Periosteum on Bone Defect Healing. J Biomech. 43, 2728-2737 (2010).
  27. McBride, S. H., Dolejs, S., Brianza, S., Knothe, U. R., Knothe Tate, M. L. Net Change in Periosteal Strain During Stance Shift Loading After Surgery Correlates to Rapid de novo Bone Generation in Critically Sized Defects. Ann Biomed Eng. 39, 1570-1581 (2011).
  28. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28 (5), 644-658 (2014).
  29. Mostafa, N. Z., et al. Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells Cultured with Dexamethasone, Vitamin D3, Basic Fibroblast Growth Factor, and Bone Morphogenetic Protein-2. Connect Tissue Res. 53 (2), 117-131 (2012).
  30. Sun, Y., Yang, X., Li, F., Dou, Z. Study on Differentiation of Embryonic Stem Cells into Osteoblast in vitro Inducing by 1,25(OH)2VD3. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22 (9), 1117-1120 (2008).
  31. Ishii, M., Koike, C., Igarashi, A., et al. Molecular Markers Distinguish Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from Fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 332, 297-303 (2005).
  32. Maund, S. L., Barclay, W. W., Hover, L. D., et al. Interleukin-1α Mediates the Antiproliferative Effects of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Prostate Progenitor/Stem Cells. Cancer Res. 71, 5276-5286 (2011).
  33. Mitrano, T. I., Grob, M. S., Carrión, F., Nova-Lamperti, E., Luz, P. A., Fierro, F. S., Quintero, A., Chaparro, A., Sanz, A. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81 (6), 917-925 (2010).
  34. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28, 644-658 (2014).
  35. Ippolito, G., Schiller, P. C., Ricordi, C., Roos, B. A., Howard, G. A. Age Related Osteogenic Potential of Mesenchymal Stromal Stem Cells from Human Vertebral Bone Marrow. J Bone Miner Res. 14, 1115-1122 (1999).
  36. D'Stucki, U., et al. Temporal and Local Appearance of Alkaline Phosphatase Activity in Early Stages of Guided Bone Regeneration. A Descriptive Histochemical Study in Humans. Clin Oral Implants Res. 12, 121-127 (2001).
  37. Caplan, A. I., Bruder, S. P. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med. 7, 259-264 (2001).
  38. Knothe Tate, M. L., Falls, T., McBride, S. H., Atit, R., Knothe, U. R. Mechanical Modulation of Osteochondroprogenitor Cell Fate. Int J Biochem Cell Biol. 40, 2720-2738 (2008).
  39. Yoshimura, H., Muneta, T., Nimura, A., Yokoyama, A., Koga, H., Sekiya, I. Comparison of Rat Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow, Synovium, Periosteum, Adipose Tissue, and Muscle. Cell Tissue Res. 327, 449-462 (2007).
  40. Tanaka, H., Ogasa, H., Barnes, J., Liang, C. T. Actions of bFGF on Mitogenic Activity and Lineage Expression in Rat Osteoprogenitor Cells: Effect of Age. Mol Cell Endocrinol. 150, 1-10 (1999).
  41. Zhou, S., et al. Clinical characteristics influence in vitro action of 1,25-dihydroxyvitamin D(3) in human marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 27 (9), 1992-2000 (1992).
  42. Pittenger, M. F., et al. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  43. Jørgensen, N. R., Henriksen, Z., Sorensen, O. H., Civitelli, R. Dexamethasone, BMP-2, and 1,25-dihydroxyvitamin D enhance a more differentiated osteoblast phenotype: validation of an in vitro model for human bone marrow-derived primary osteoblasts. Steroids. 69, 219-226 (2004).
  44. Khanna-Jain, R., et al. Vitamin D(3) Metabolites Induce Osteogenic Differentiation in Human Dental Pulp and Human Dental Follicle Cells. J Steroid BiochemMol Biol. 122 (3), 133-141 (2010).
  45. Lee, J. H., O'Keefe, J. H., Bell, D., Hensrud, D. D., Holick, M. F. Vitamin D Deficiency an Important, Common, and Easily Treatable Cardiovascular Risk Factor? J Am Coll Cardiol. 52, 1949-1956 (2008).
  46. Liu, P., Oyajobi, B. O., Russell, R. G., Scutt, A. Regulation of osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells: interaction between transforming growth factor-beta and 1,25(OH)(2) vitamin D(3) In vitro. Calcif Tissue Int. 65 (2), 173-180 (1999).
  47. Beresford, J. N., Gallagher, J. A., Russell, R. G. G. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 and Human Bone-Derived Cells In Vitro: Effects on Alkaline Phosphatase, Type I Collagen and Proliferation. Endocrinology. 119, 1776-1785 (1986).
  48. Price, P. A., Baukol, S. A. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Increases Synthesis of the Vitamin K-Dependent Bone Protein by Osteosarcoma Cells. J Biol Chem. 255, 11660-11663 (1986).
  49. Kawase, T., Oguro, A. Granulocyte Colony-Stimulating Factor Synergistically Augments 1, 25-Dihydroxyvitamin D3-Induced Monocytic Differentiation in Murine Bone Marrow Cell Cultures. Horm Metab Res. 36, 445-452 (2004).
  50. Fujisawa, R., Tamura, M. Acidic Bone Matrix Proteins and Their Roles in Calcification. Front Biosci. (Landmark Ed). 17, 1891-1903 (2012).
  51. van Driel, M., et al. Evidence that Both 1α,25 Dihydroxyvitamin D3 and 24-Hydroxylated D3 Enhance HuMan Osteoblast Differentiation and Mineralization. J Cell Biochem. 99, 922-935 (2006).
  52. Atkins, G. J., et al. Metabolism of Vitamin D3 in Human Osteoblasts: Evidence for Autocrine and Paracrine Activities of 1 α ,25-Dihydroxyvitamin D3. Bone. 40, 1517-1528 (2007).
  53. Kerner, S. A., Scott, R. A., Pike, J. W. Sequence Elements in the Human Osteocalcin Gene Confer Basal Activation and Inducible Response to Hormonal Vitamin D3. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4455-4459 (1989).
  54. Viereck, V., et al. Differential Regulation of Cbfa1/Runx2 and Osteocalcin Gene Expression by Vitamin-D3, Dexamethasone, and Local Growth Factors in Primary Human Osteoblasts. J Cell Biochem. 86, 348-356 (2002).
  55. Shi, X., et al. In-vitro osteogenesis of synovium stem cells induced by controlled release of bisphosphate additives from microspherical mesoporous silica composite. Biomaterials. 30, 3996-4005 (2009).
  56. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of Human Stem Cells Derived from Various Mesenchymal Tissues: Superiority of Synovium as a Cell Source. Arthritis Rheum. 52, 2521-2529 (2005).

Tags

Bioingeniería número 135 periostio Alveolar células madre mesenquimales 1,25-(OH)2D3 vitamina D3 Calcitriol periostio
Aislamiento de células madre mesenquimatosas del periostio Alveolar humano y efectos de la vitamina D en la actividad osteogénica de células derivadas del periostio
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y. L., Hong, A., Yen, T. H.,… More

Wang, Y. L., Hong, A., Yen, T. H., Hong, H. H. Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells. J. Vis. Exp. (135), e57166, doi:10.3791/57166 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter