हम periosteum-व्युत्पन्न कोशिकाओं (पीडीसी) विटामिन सी (विटामिन सी) और 1, 25-dihydroxy विटामिन डी [1, 25-(OH)2डी3] से प्रेरित की mRNA अभिव्यक्ति के लिए एक प्रोटोकॉल की जांच करने के लिए मौजूद है । इसके अलावा, हम osteocytes, chondrocytes, और adipocytes में अंतर करने के लिए पीडीसी की क्षमता का मूल्यांकन ।
Mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) ऊतकों की एक किस्म में मौजूद है और osteoblasts सहित कई कोशिका प्रकार में विभेदित किया जा सकता है । MSCs के दंत सूत्रों के अलावा, periosteum एक आसानी से सुलभ ऊतक है, जो केंबियम परत में MSCs को नियंत्रित करने के लिए पहचान की गई है । हालांकि, इस स्रोत का अभी तक व्यापक अध्ययन नहीं किया गया है ।
विटामिन डी3 और 1, 25-(ओह)2डी3 osteoblasts में MSCs के विट्रो भेदभाव में उत्तेजित करने के लिए प्रदर्शन किया गया है । इसके अलावा, विटामिन सी कोलेजन गठन और हड्डी सेल विकास की सुविधा । हालांकि, अभी तक किसी अध्ययन ने MSCs पर विटामिन डी3 और विटामिन सी के प्रभाव की जांच नहीं की है ।
यहां, हम मानव वायुकोशीय periosteum से MSCs को अलग करने की एक विधि प्रस्तुत करते है और परिकल्पना की जांच करते है कि 1, 25-(OH)2डी3 इन कोशिकाओं पर एक osteoinductive प्रभाव डालती है । हम भी मानव वायुकोशीय periosteum में MSCs की उपस्थिति की जांच और स्टेम सेल आसंजन और प्रसार का आकलन । विटामिन सी की क्षमता का आकलन करने के लिए (एक नियंत्रण के रूप में) और 1 के विभिन्न सांद्रता, 25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8, और 10−7 मी) में कुंजी mRNA में परिवर्तन करने के लिए क्षारीय फॉस्फेट (ALP) की पृथक MSCs mRNA अभिव्यक्ति, अस्थि sialoprotein (बीएसपी), कोर बाइंडिंग फैक्टर अल्फा-1 (CBFA1), कोलेजन-1, और osteocalcin (OCN) वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर) का उपयोग कर मापा जाता है ।
हालांकि कई प्रासंगिक तकनीक हाल के वर्षों में विकसित किया गया है, अस्थि पुनर्निर्माण कई बाधाओं से सीमित रहता है, और आवश्यक पुनर्निर्माण की सीमा का आकलन अक्सर असंभव है । कठिन ऊतक वृद्धि के लिए एक अनुकूल दीर्घकालिक सफलता दर के अलावा दोनों esthetic और कार्यात्मक लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । आमतौर पर इस तरह की प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया तरीकों autogenous और allogenic हड्डी भ्रष्टाचार, xenografting, और alloplastic हड्डी भ्रष्टाचार में शामिल हैं । अस्थि भ्रष्टाचार के विभिन्न प्रकार के बीच, autogenous हड्डी भ्रष्टाचार सबसे प्रभावी माना जाता है । हालांकि, दाता साइट रुग्णता, समझौता संवहनी, और सीमित ऊतक उपलब्धता1 autogenous हड्डी भ्रष्टाचार के लिए प्रमुख कमियां किया गया है । इसके अलावा, allogenic अस्थि भ्रष्टाचार और xenografts रोग संचरण के साथ संबद्ध किया गया है । वर्तमान में, सिंथेटिक अस्थि भ्रष्टाचार व्यापक रूप से इन समस्याओं को हल करने के लिए उपयोग किया जाता है । हालांकि, osteogenic क्षमता की कमी के साथ, नैदानिक परिणाम व्यापक रूप से अलग है । फाइबर जैसे सामग्री मात्रा अस्थिरता, संक्रमण, और शक्ति की कमी के साथ जुड़े रहे हैं ।
हड्डी वृद्धि ऊतक इंजीनियरिंग का उपयोग काफी रुचि पैदा की है । इस तकनीक में, mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (MSCs) शुरू में osteoblast भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, जो तो हड्डी की मरंमत की प्राप्त करने के लिए अस्थि नुकसान की साइट पर प्रत्यारोपित कर रहे हैं । इस प्रक्रिया को वर्तमान में सेल थेरेपी में लागू किया जाता है । ऊतक की एक सीमित मात्रा में निकालने के द्वारा अस्थि पुनर्निर्माण को प्राप्त करने के अन्य तरीकों के साथ तुलना में सरल और कम इनवेसिव है.
सेल आधारित चिकित्सा के लिए एक उपकरण के रूप में MSCs की संभावित भूमिका दंत पुनर्जनन के उद्देश्य से विभिंन अनुसंधान समूहों के बीच एक उभरती हुई रुचि है । अध्ययनों से पुष्टि की है कि MSCs ऊतक के निंनलिखित प्रकार से विभेदित किया जा सकता है: अस्थि मज्जा, वसा, श्लेष झिल्ली, pericyte, trabecular हड्डी, मानव गर्भनाल, और दंत ऊतक2,3। MSCs के सामांय स्रोतों अस्थि मज्जा, वसा ऊतक, और दंत ऊतक शामिल हैं । वसा ऊतक और अस्थि मज्जा से व्युत्पंन MSCs के साथ तुलना में, दंत स्टेम कोशिकाओं के लाभ आसान पहुंच और फसल कटाई के बाद कम रुग्णता हैं । भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के साथ तुलना में, MSCs दंत ऊतक से व्युत्पन्न nonimmunogenic दिखाई देते हैं और जटिल नैतिक चिंताओं के साथ संबद्ध नहीं हैं3.
२००६ में, सेलुलर थेरेपी के लिए अंतरराष्ट्रीय समाज MSCs की पहचान करने के लिए निम्नलिखित मानकों का उपयोग करने की सिफारिश की: पहला, MSCs प्लास्टिक के लिए संलग्न करने में सक्षम होना चाहिए. दूसरा, MSCs के लिए सकारात्मक होना चाहिए सतह एंटीजन CD105, CD73, और CD90 और monocytes के लिए मार्करों के लिए नकारात्मक, मैक्रोफेज, और बी कोशिकाओं के अलावा टेम एंटीजन CD45 और CD344. एक अंतिम कसौटी के रूप में, MSCs की मानक शर्तों के तहत कोशिकाओं के निंनलिखित तीन प्रकार में अंतर करने में सक्षम होना चाहिए इन विट्रो भेदभाव: osteoblasts, adipocytes, और chondrocytes4। तारीख करने के लिए, मानव दंत स्टेम सेल के छह प्रकार अलग किया गया है और विशेषता । पहले प्रकार मानव लुगदी ऊतक और जन्मोत्तर चिकित्सकीय लुगदी स्टेम कोशिकाओं को5से अलग किया गया था । इसके बाद, दंत MSCs के तीन अतिरिक्त प्रकार अलग किया गया है और विशेषता:6, periodontal बंधन7, और शिखर papilla8, छूटना पर्णपाती दांत से स्टेम कोशिकाओं । अभी हाल ही में, दंत कूप-व्युत्पंन9, मसूड़ों ऊतक-व्युत्पंन10, दंत कली स्टेम सेल (DBSCs)11, और periapical पुटी MSCs (hPCy-MSCs)12 भी पहचान की गई है ।
Friedenstein पहले MSCs13को परिभाषित किया गया था । MSCs एक उच्च प्रसार क्षमता प्रदर्शन और पहले अंतर करने के लिए किया जा सकता है प्रत्यारोपित, जो पता चलता है कि वे reअपक्षय प्रक्रियाओं के लिए आदर्श उंमीदवार है10।
हालांकि अधिकांश अध्ययनों से स्टेम सेल के एक स्रोत के रूप में अस्थि मज्जा का इस्तेमाल किया है, periosteum-व्युत्पन्न कोशिकाओं (पीडीसी) भी हाल ही में इस्तेमाल किया गया है14. periosteum अधिक आसानी से सुलभ है से अस्थि मज्जा है । इसलिए, इस तकनीक में, हम सर्जरी के दौरान अतिरिक्त चीरा की जरूरत को खत्म करने और रोगियों में postsurgical रुग्णता को कम करने के लिए वायुकोशीय periosteum का उपयोग करते हैं । periosteum संयोजी ऊतक है कि लंबी हड्डियों के बाहरी अस्तर रूपों और दो अलग परतों शामिल है: बाहरी रेशेदार परत fibroblasts, कोलेजन, और लोचदार फाइबर से बना15, और भीतरी कोशिका-सीधे संपर्क में अमीर केंबियम परत हड्डी की सतह के साथ । केंबियम परत एक मिश्रित सेल जनसंख्या शामिल हैं, मुख्य रूप से fibroblasts16, osteoblasts17, pericytes18, और एक महत्वपूर्ण उपजनसंख्या MSCs19,20,21के रूप में पहचाना । अधिकांश अध्ययनों ने बताया है कि पीडीसी तुलना कर रहे हैं, तो बेहतर नहीं है, अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न स्टेम सेल (bMSCs) में अस्थि चिकित्सा और पुनर्जनन22,23,24. periosteum आसानी से सुलभ है और उत्कृष्ट पुनर्अपक्षय प्रभावशीलता दर्शाती है । हालांकि, कुछ अध्ययनों से periosteum25,26,27पर ध्यान केंद्रित किया है ।
हड्डी की मरंमत के बारे में, वर्तमान नैदानिक अभ्यास periosteal जनक सहायक पाड़ के भीतर परिलक्षित कोशिकाओं के प्रत्यारोपण शामिल है । हाल के अध्ययनों से दोषपूर्ण क्षेत्रों में स्टेम सेल प्राप्त करने और ऊतक पुनर्जनन20के लिए जनक कोशिकाओं को रोजगार पर ध्यान केंद्रित किया है । दंत चिकित्सक भी periodontal उपचार और दंत प्रत्यारोपण में periodontal अस्थि पुनर्जनन के भविष्य के आवेदन की आशा । दाता साइट के बारे में, periosteum आसानी से जनरल डेंटल सर्जन द्वारा काटा जा सकता है । यह मज्जा stromal कोशिकाओं के खिलाफ अनुकूल तुलना करता है, के रूप में periosteum नियमित मौखिक सर्जरी के दौरान पहुंचा जा सकता है । इस प्रकार, इस अध्ययन का उद्देश्य कटाई पीडीसी के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करना और मानव periosteum स्टेम कोशिकाओं के आकृति विज्ञान, लगाव, व्यवहार्यता, और प्रसार का आकलन करना है ।
विटामिन डी चयापचयों vivo अस्थि-खनिज गतिशील संतुलन में प्रभावित करते हैं । एक अध्ययन ने बताया कि 24R, 25-(OH)2डी3 सक्रिय रूप विटामिन डी के मानव MSCs (hMSCs)28के osteoblastic भेदभाव के लिए आवश्यक है । अस्थि homeostasis और मरंमत विटामिन डी3 चयापचयों, जो की 1, 25-(OH)2डी3 (calcitriol) के एक नेटवर्क के द्वारा विनियमित है सबसे अधिक जैविक रूप से सक्रिय और अस्थि स्वास्थ्य के विनियमन में प्रासंगिक है । विटामिन डी3 पत्थराना29के लिए आवश्यक है । 2-d-पुराने कुनमिंग सफेद चूहों का उपयोग कर एक अध्ययन में, चूहों में embryoid निकायों ने संकेत दिया कि विटामिन सी और विटामिन डी की खुराक प्रभावी ढंग से ESC के भेदभाव को बढ़ावा दिया-प्राप्त osteoblasts30. इसके अंय जैविक गतिविधियों में, 1, 25-(OH)2डी3 को उत्तेजित करता है इन विट्रो hMSCs के भेदभाव osteoblasts को, जो alkaline फॉस्फेट (ALP) एंजाइम गतिविधि या OCN जीन में वृद्धि के आधार पर निगरानी की जा सकती है अभिव्यक्ति.
कुछ अध्ययनों से पता चला है एक खुराक-विटामिन सी और 1, 25 के साथ संयुक्त उपचार की प्रतिक्रिया संबंध-(ओह)2डी3 मानव पीडीसी में हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग पर एक विशेष ध्यान देने के साथ । इसलिए, इस अध्ययन में, हम एक या 1 के संयुक्त उपचार के लिए इष्टतम सांद्रता की जांच, 25-(OH)2डी3 और विटामिन सी मानव पीडीसी के osteogenic भेदभाव उत्प्रेरण के लिए । इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य निर्धारित करने के लिए है कि क्या एक कोशिका दंत वायुकोशीय periosteum से अलग आबादी एक एमएससी phenotype के साथ कोशिकाओं में शामिल है और क्या इन कोशिकाओं संस्कृति में विस्तार किया जा सकता है (इनविट्रो में) और वांछित ऊतक फार्म के लिए विभेदित . इसके अलावा, हम osteocytes, chondrocytes, और adipocytes में अंतर करने के लिए पीडीसी की क्षमता का मूल्यांकन । अध्ययन का दूसरा भाग विटामिन सी और 10−10के प्रभावों का मूल्यांकन करता है, 10−9, 10−8, और 10−7 एम 1, 25-(OH)2डी3 पर पीडीसी की osteogenic गतिविधि । इस अध्ययन का प्राथमिक उद्देश्य विटामिन सी और 1 के कार्यों का आकलन करना है, 25-(OH)2डी3 ALP गतिविधि द्वारा पीडीसी के osteoblastic भेदभाव के दौरान, और समर्थक osteogenic जीन, जैसे ALP, कोलेजन-1, OCN, बसपा, और CBFA1 के रूप में । इसके अलावा, यह अध्ययन इन निष्कर्षों के आधार पर मानव पीडीसी के लिए इष्टतम osteoinductive शर्तों का निर्धारण करता है ।
एक हाल ही में विकसित चिकित्सीय मोडल, अर्थात् ऊतक इंजीनियरिंग जरूरत MSCs, कई फायदे हैं । MSCs, जो कई ऊतक प्रकार में मौजूद हैं, multipotent कोशिकाओं है कि कार्यात्मक mesodermal ऊतक कोशिकाओं की एक किस्म में अंतर कर सकते हैं<sup class…
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन प्रोटोकॉल को चांग गुंग मेमोरियल अस्पताल (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, 102-1619C, 101-4728B, और 103-4223C) के नैदानिक अनुसंधान के लिए संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था । इस अध्ययन चांग गुंग मेमोरियल अस्पताल (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142, और NMRPG3C0151) द्वारा समर्थित किया गया था । इस पांडुलिपि वालेस अकादमिक संपादन द्वारा संपादित किया गया था ।
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt | Sigma | 49752 | |
35-mm culture dishes | Corning | 430165 | |
3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
6 well plate | Corning | 3516 | |
Alkaline phosphatase | ABI | Hs01029144_m1 | |
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit | BioVision | K412-500 | |
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase | Roche | 10109118001 | |
CD146 | BD | 561013 | |
CD19 | BD | 560994 | |
CD34 | BD | 560942 | |
CD44 | BD | 561858 | |
CD45 | BD | 561088 | |
CD73 | BD | 561014 | |
CD90 | BD | 561974 | |
Cell banker1 | ZEAOAQ | 11888 | |
core binding factor alpha-1 | ABI | Hs00231692_m1 | |
dexamethasone | Sigma | D4902 | |
DPBS | Gibco | 14190250 | |
FBS | Gibco | 26140-079 | |
GAPDH | ABI | Hs99999905_m1 | |
HLA-DR | BD | 562008 | |
indomethacin | Sigma | I7378 | |
insulin | sigma | 91077C | |
insulin–transferrin–selenium-A | Sigma | I1884 | |
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) | Life | 4346907 | |
MicroAmp optical adhesive film | Life | 4311971 | |
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification | HyClone | SH30265.02 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333-56 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
STRO-1 | BioLegend | 340103 | |
SYBER Green PCR Master Mix | AppliedBiosystems | 4309155 | |
TaqMan Master Mix | Life | 4304437 | |
transforming growth factor-β | Sigma | T7039 | |
Trizol reagent (for RNA isolation) | Life | 15596018 | |
β-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
collagen-1 | Invitrogen | forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3 | |
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3' | |||
OCN | Invitrogen | forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3' | |
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3' | |||
BSP | Invitrogen | forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3' | |
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3' | |||
Commercial ALP primers | |||
Commercial CBFA1 primers |