אנו מציגים פרוטוקול לחקור את סמנים ביולוגיים של mRNA ביטוי של קרום העצם, נגזר תאים (שיתפקדו) הנגרמת על ידי ויטמין C (ויטמין C), 1,25-dihydroxy ויטמין D [1,25-(OH)2D3]. בנוסף, נוכל להעריך את היכולת של בקר קבוצת מחשבים ראשי להבדיל לתוך osteocytes, chondrocytes ו- adipocytes.
גזע mesenchymal (MSCs) קיימים במגוון של רקמות, יכול להיות מובחן סוגי תאים רבים, לרבות תאי העצם. בין מקורות שיניים MSCs, קרום העצם היא רקמה נגיש בקלות, אשר זוהה להכיל MSCs בשכבה cambium. עם זאת, מקור זה לא כבר נרחב נחקרה.
ויטמין D3 ו- 1,25-(OH)2D3 הוכחו לעורר במבחנה הבידול של MSCs לתוך תאי העצם. בנוסף, ויטמין C מסייע צמיחת תאים היווצרות ועצם קולגן. עם זאת, אף מחקר עדיין חקרה את ההשפעות של ויטמין D3 וויטמין C על MSCs.
כאן, אנו מציגים שיטה אנליטית MSCs מן האדם קרום העצם מכתשיים לבחון את ההשערה כי 1,25-(OH)2D3 לנצל השפעה osteoinductive על תאים אלה. אנו גם לחקור את הנוכחות של MSCs ב קרום העצם מכתשיים אנושי, להעריך אדהזיה לתאי גזע והתפשטות. כדי להעריך את היכולת של ויטמין C (כמו פקד), ריכוזים שונים של 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8ו 10−7 מ’) לשנות מפתח סמנים mRNA הביטוי מבודד MSCs mRNA של phosphatase אלקליין (ALP), עצם sialoprotein (BSP), ליבה מחייבת גורם אלפא-1 (CBFA1), קולגן-1 ואוסטאוקלצין (OCN) נמדדים באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת (RT-PCR).
למרות אינספור טכניקות הרלוונטיים פותחו בשנים האחרונות, עצם שחזור נותר מוגבל על-ידי אילוצים מרובים ולאחר הערכת שמידת השחזור נחוץ לעתים קרובות בלתי אפשרי. רקמה קשה הגדלת נדרשת כדי להשיג את המטרות אסתטי ופונקציונלי בנוסף שיעור הצלחה לטווח ארוך חיובית. שיטות משמש בדרך כלל הליכים כאלה כוללים בעזרת השתלת עצם autogenous, allogenic, האורתופדיה אלופלסטי בעזרת השתלת עצם. בין סוגים שונים של עצם, שתלי עצם autogenous נחשבים היעיל ביותר. עם זאת, תחלואה האתר התורם vascularity פרוץ, רקמות מוגבל זמינות1 כבר החסרונות העיקריים עבור בעזרת השתלת עצם autogenous. בנוסף, שתלי עצם allogenic ו- xenografts קושרו עם העברת מחלות. כיום, שתלי עצם סינתטי נמצאים בשימוש נרחב כדי לפתור בעיות אלה. עם זאת, עם פוטנציאל osteogenic חוסר שלהם, התוצאות הקליניות יש מגוונות. חומרים כגון תאית משויכות תנודות נפח זיהום, חוסר כוח.
בניית עצם באמצעות הנדסת רקמות יצר עניין רב. בטכניקה זו, גזע mesenchymal (MSCs) בתחילה משמשים כדי לקדם אוסטאובלסט בידול, אשר מושתלים ואז לאתר של איבוד העצם כדי להשיג את עצם תיקון. הליך זה מוחל כרגע בטיפול תא. השגת שיקום העצם על-ידי חילוץ כמות מוגבלת של רקמות היא פשוט פחות פולשני לעומת שיטות אחרות.
התפקיד הפוטנציאלי של MSCs ככלי מבוססת תא טיפולים מכוון התחדשות שיניים הוא עניין המתעוררים בקרב קבוצות מחקר שונות. מחקרים אישרו כי ניתן להבחין MSCs מן הסוגים הבאים של רקמות: מח עצם, אדיפוז, synovial ממברנה, pericyte, עצם trabecular, הטבור אנושי ו-2,רקמות שיניים3. מקורות נפוצים של MSCs כוללים מח עצם, רקמת שומן ברקמות שיניים. לעומת MSCs נגזר רקמת שומן, מח עצם, היתרונות של תאי גזע שיניים הם נגישות קלה ותחלואה פחות קטיפתו. לעומת תאי גזע עובריים, MSCs נגזר רקמות שיניים מופיעים nonimmunogenic, אינם משויכים דאגות אתיות מורכבות3.
בשנת 2006, האגודה הבינלאומית נייד טיפול מומלץ שימוש בתקנים הבאים כדי לזהות MSCs: ראשית, MSCs חייב להיות מסוגל הצמדת פלסטיק. שנית, MSCs חייבת להיות חיובית עבור אנטיגנים משטח CD105, CD73 ו- CD90 ושלילית עבור הסמנים ומונוציטים, מקרופאגים, תאי B בנוסף אנטיגנים hematopoietic CD45 CD344. כקריטריון הסופי, MSCs דרושה היכולת להתמיין שלושת הסוגים הבאים של תאים בתנאים סטנדרטיים של בידול במבחנה : תאי העצם, adipocytes ו- chondrocytes4. עד היום, שישה סוגים של תאי הגזע האנושי שיניים יש כבר מבודד ו מאופיין. הסוג הראשון שבודד רקמה אנושית זולה, כינה זולה שיניים כמחנכת תאי גזע5. לאחר מכן, שלושה סוגים נוספים של MSCs שיניים יש מבודד, המאופיינת: תאי גזע של השיניים נשירים exfoliated6, חניכיים רצועה7ו- papilla הפסגה8. לאחרונה, שיניים נגזר זקיק9, נגזר רקמת חניכיים10, ניצן שיניים גזע cells(DBSCs)11וציסטה periapical MSCs (hPCy-MSCs)12 גם זוהו.
Friedenstein היה הראשון להגדיר MSCs13. MSCs התערוכה פוטנציאל גבוה בתי־ספר, אפשר לגרום להם להבדיל לפני להיות מושתלים, מה שמרמז כי הם מועמדים אידיאליים עבור תהליכי הרגנרציה10.
למרות רוב המחקרים יש להשתמש במח העצם כמקור של תאי גזע, תאי נגזר קרום העצם (שיתפקדו) היו גם בשימוש לאחרונה14. קרום העצם נגיש בקלות רבה יותר מאשר הוא במח העצם. לכן, בטכניקה זו, אנו משתמשים קרום העצם מכתשיים כדי לבטל את הצורך חתכים נוספים במהלך הניתוח וכדי להקטין תחלואה postsurgical בחולים. קרום העצם היא רקמת החיבור טפסים הציפוי החיצוני של עצמות ארוכות, ומורכב משתי שכבות נפרדות: סיבי השכבה החיצונית המורכבת fibroblasts, קולגן וסיבים אלסטיים15, השכבה הפנימית עשיר תא cambium במגע ישיר עם משטח העצם. השכבה cambium מכיל אוכלוסיה לתא מעורב, בעיקר fibroblasts16, תאי העצם17, pericytes18ו subpopulation קריטי מזוהה MSCs19,20,21. רוב המחקרים דיווחו כי שיתפקדו דומים, אם לא עדיפה, על הנגזרות מח העצם בתאי גזע (bMSCs) עצם ריפוי והתחדשות22,23,24. קרום העצם נגיש בקלות ותערוכות האפקטיביות משובי מעולה. עם זאת, מחקרים מעטים התמקדו26,25,27קרום העצם.
לגבי עצם תיקון, ונוהגין קליניים כרוך את השתלת של חידוש ובתאים מוגבר בתוך פיגומים תומכת. המחקרים האחרונים התמקדו רכישת תאי גזע באזורים הפגומים ונקיטה ובתאים התחדשות רקמות20. רופאי שיניים צופים גם יישומים עתידיים של התחדשות העצם חניכיים, טיפולי חניכיים, שתלים דנטליים. לגבי האתר התורם, קרום העצם ניתן בקלות לקצור על ידי מנתחים שיניים כללית. זה משווה לטובה נגד מח סטרומה תאים, כמו קרום העצם ניתן לגשת במהלך ניתוח אוראלי שגרתית. לפיכך, מטרת מחקר זה היא להקים עבור קציר שיתפקדו פרוטוקול להעריך את המורפולוגיה, קובץ מצורף, הכדאיות ואת התפשטות תאי גזע אנושי קרום העצם.
ויטמין D מטבוליטים להשפיע על ויוו עצם-מינרליים שיווי משקל דינמי. מחקר אחד דיווח 24R,25-(OH)2D3 הטופס הפעיל של ויטמין D אינו חיוני הבידול osteoblastic של MSCs (hMSCs) אנושי28. עצם הומאוסטזיס ותיקון מוסדרים על ידי רשת של מטבוליטים3 ויטמין D, של איזה 1,25-(OH)2D3 (קלציטריול) הוא פעיל ביותר מבחינה ביולוגית, הרלוונטי בוויסות בריאות העצם. ויטמין D3 חיונית הסתיידות29. במחקר אחד שימוש בעכברים קונמינג לבן בן d-2, הגופים embryoid בעכברים ציינו כי תוספי ויטמין C, ויטמין D באופן יעיל קידם את הבידול של תאי העצם ESC-derived30. בין שלה פעילויות ביולוגיות נוספות, 1,25-(OH)2D3 מעוררת את הבידול במבחנה של hMSCs על תאי העצם, אשר ניתן לנטר מבוסס על הגדלת פעילות האנזים אלקליין פוספטאז (ALP) או OCN ג’ין ביטוי.
מחקרים מעטים גילו קשר מנה-תגובה של טיפולים בשילוב עם ויטמין C ו 1,25-(OH)2D3 ב שיתפקדו האנושי עם דגש מיוחד על הנדסת רקמות העצם. לפיכך, במחקר זה, אנו בוחנים את ריכוז אופטימלי לטיפול יחיד או בשילוב של 1,25-(OH)2D3 , ויטמין C להשראת הבידול osteogenic של האדם שיתפקדו. המטרה של פרוטוקול זה היא כדי לקבוע אם אוכלוסיה תא מבודד קרום העצם מכתשיים שיניים מכיל תאים בעלי פנוטיפ של MSC, תאים אלה יכול להיות מורחבת בתרבות (במבחנה) ואם הבדיל כדי ליצור את הרקמה הרצויה . בנוסף, נוכל להעריך את היכולת של בקר קבוצת מחשבים ראשי להבדיל לתוך osteocytes, chondrocytes ו- adipocytes. החלק השני של המחקר בוחן את ההשפעות של ויטמין C ו 10−1010−9, 10−8, 10−7 מ’ 1,25-(OH)2D3 על הפעילות osteogenic של בקר קבוצת מחשבים ראשי. המטרה העיקרית של מחקר זה הוא להעריך את הפונקציות של ויטמין C ו- 1,25-(OH)2D3 במהלך הבידול osteoblastic של שיתפקדו על ידי פעילות ALP, גנים פרו-osteogenic, כגון ALP, קולגן-1, OCN, BSP ו- CBFA1. בנוסף, מחקר זה קובע את התנאים osteoinductive האופטימלי עבור שיתפקדו אנושי על בסיס ממצאים אלה.
מודאליות טיפוליות שפותחו לאחרונה, כלומר רקמות הנדסה פרוגרמה MSCs, יש יתרונות רבים. MSCs, אשר נמצאים בכמה סוגי רקמות, תאים multipotent יכולים להתמיין מגוון תאי רקמה תפקודית mesodermal37 הינם תאים אחרים כגון תאי העצם.
קרום העצם משמש משרה עבור ובתאים והוא בתור אספקת עשיר להערכת ע?…
The authors have nothing to disclose.
פרוטוקול המחקר אושרה על ידי ועדת הבדיקה מוסדי עבור קליני מחקר של צ’נג קונג לבית חולים (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, 102-1619C, 101-4728B ו- 103-4223C). מחקר זה נתמך על ידי בית החולים ממוריאל קונג צ’אנג (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 ו NMRPG3C0151). כתב יד זה נערך על-ידי עריכה אקדמית וואלאס.
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt | Sigma | 49752 | |
35-mm culture dishes | Corning | 430165 | |
3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
6 well plate | Corning | 3516 | |
Alkaline phosphatase | ABI | Hs01029144_m1 | |
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit | BioVision | K412-500 | |
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase | Roche | 10109118001 | |
CD146 | BD | 561013 | |
CD19 | BD | 560994 | |
CD34 | BD | 560942 | |
CD44 | BD | 561858 | |
CD45 | BD | 561088 | |
CD73 | BD | 561014 | |
CD90 | BD | 561974 | |
Cell banker1 | ZEAOAQ | 11888 | |
core binding factor alpha-1 | ABI | Hs00231692_m1 | |
dexamethasone | Sigma | D4902 | |
DPBS | Gibco | 14190250 | |
FBS | Gibco | 26140-079 | |
GAPDH | ABI | Hs99999905_m1 | |
HLA-DR | BD | 562008 | |
indomethacin | Sigma | I7378 | |
insulin | sigma | 91077C | |
insulin–transferrin–selenium-A | Sigma | I1884 | |
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) | Life | 4346907 | |
MicroAmp optical adhesive film | Life | 4311971 | |
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification | HyClone | SH30265.02 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333-56 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
STRO-1 | BioLegend | 340103 | |
SYBER Green PCR Master Mix | AppliedBiosystems | 4309155 | |
TaqMan Master Mix | Life | 4304437 | |
transforming growth factor-β | Sigma | T7039 | |
Trizol reagent (for RNA isolation) | Life | 15596018 | |
β-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
collagen-1 | Invitrogen | forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3 | |
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3' | |||
OCN | Invitrogen | forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3' | |
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3' | |||
BSP | Invitrogen | forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3' | |
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3' | |||
Commercial ALP primers | |||
Commercial CBFA1 primers |