Summary
In dit protocol beschrijven we het gebruik van [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emissie tomografie en computertomografie (18F-FDG PET/CT) denkbaar voor het meten van de tumor metabole respons op de gerichte therapie MLN0128 in een Kras/Lkb1 mutant muis model van longkanker en gekoppelde imaging met hoge resolutie ex vivo autoradiografie en kwantitatieve histologie.
Abstract
Een kenmerk van geavanceerde tumoren is een schakeloptie waarmee aërobe glycolyse die gemakkelijk wordt gemeten door [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emissie tomografie (18F-FDG-PET) imaging. Co mutaties in het KRAS -oncogen en het LKB1 tumor suppressor gen zijn frequente gebeurtenissen in longkanker die hypermetabolic, glycolytic tumorgroei te rijden. Een kritische traject regulering van de groei en het metabolisme van deze tumoren is de mechanistische doelstelling van het traject rapamycin (mTOR), die effectief kan worden uitgevoerd met behulp van selectieve katalytische mTOR kinase remmers. De mTOR-remmer MLN0128 onderdrukt glycolyse in muizen die tumoren met Kras en Lkb1 co mutaties, hierna aangeduid als KL muizen. De reactie van de therapie in KL muizen wordt eerst gemeten door 18F-FDG-PET en berekend tomografie (CT) imaging vóór en na de levering van MLN0128. Door gebruik te maken van 18F-FDG PET/CT, zijn onderzoekers kundig voor meten van dynamische veranderingen in het glucose metabolisme in genetisch gemodificeerde Muismodellen (GEMMs) aan longkanker na een therapeutische interventie met gerichte therapieën. Dit wordt gevolgd door ex vivo autoradiografie en een analyse van de kwantitatieve immunohistochemische (qIHC) met behulp van de Morfometrische software. Het gebruik van qIHC kan de detectie en kwantificering van verschillende wijzigingen in de profielen van de biomerker na behandeling, alsmede de karakterisering van verschillende tumor pathologieën. De koppeling voor PET imaging aan kwantitatieve histologie is een effectieve strategie om te identificeren metabole en therapeutische reacties in vivo in muismodellen van de ziekte.
Introduction
Ons onderzoek heeft zich gericht op het onderzoeken en gericht op kanker met mutaties in de lever kinase B1 (LKB1, ook wel STK11 genoemd) mutant kanker1. LKB1 is een meester tumor suppressor dat mTOR complexe 1 (mTORC1 onderdrukt) door middel van de activering van de AMP kinase (AMPK) leidt tot de regulering van de groei en het metabolisme. Daarom is het verlies van LKB1 leidt tot een ongebreidelde mTORC1 activering, de activering van de resulterende HIF1-alpha in een glycolytic metabole fenotype meestal aangeduid als het Warburg Effect2,3,4. LKB1 inactiveren mutaties leiden direct tot de ontwikkeling van een zeldzame erfelijke vorm van kanker pre vervreemding syndroom bekend als Peutz-Jeghers syndroom (PJS) die wordt gekenmerkt door de ontwikkeling van goedaardige gastro-intestinale poliepen genoemd hamartomas-5 , 6 , 7. Bovendien LKB1 vaak mede muteert met oncogene KRAS resulterend in hypermetabolic en agressieve menselijke longen tumoren8,9.
Lkb1-gerelateerde ziekten zijn gemakkelijk gemodelleerd in muizen. De heterozygoot inactivering van Lkb1 in muizen leidt tot de ontwikkeling van de hamartomas nauwkeurig modelleren van PJS10,11,12,13. Bovendien recapituleren Lkb1 mutaties die gemakkelijk zijn gemodelleerd in muizen nauwkeurig kanker fenotypes van de longen, huid, alvleesklier en borst14. De co mutatie van Kras/Lkb1 in het longweefsel van transgene muizen, met behulp van een Cre recombinase-gemedieerde activering van de oncogene KrasG12D allel en biallelic verwijdering van Lkb1, resulteert in de vorming van agressief en uitgezaaide longkanker tumoren15 ,16. De karakterisering van KrasG12D; Lkb1- / - (KL) Long tumoren geïsoleerd van muizen blijkt deze tumoren hebben een hoge mTORC1-activering en zijn zeer glycolytic, met behulp van beide metingen van de directe metaboliet van glucose en lactaat of meten van het verbruik van [18F] -2- Fluoro-2-deoxy-D-glucose (18F-FDG) door positron emissie tomografie (PET) met computertomografie (CT), 17. De mTORC1 hyper-activering in LKB1 mutant tumoren biedt een duidelijke reden voor het testen van beide allosteric en katalytische kinase-remmers van mTOR voor de behandeling van deze kankers.
In een eerdere studie, we laten zien dat de allosteric mTORC1-remmer rapamycin (RAPA) geremd met succes de groei van en de glycolyse in de gastro-intestinale tumoren van de (GI) met behulp van een Lkb1+/- transgeen muismodel van PJS3. RAPA is momenteel goedgekeurd als een enkele agent therapie voor de behandeling van niercelcarcinoom maar beperkte werkzaamheid toonde in NKCLK18,19,20. RAPA is een allosteric mTORC1-remmer en kan worden verbeterd door de ontwikkeling van de volgende generatie mTOR katalytische kinase-remmers die een meer bijna volledige remming van de mTOR complexen 1 en 2 leveren (mTORC1 en mTORC2, respectievelijk)21. Drugs zoals MLN0128 worden nu geëvalueerd in preklinische studies en vroege fase klinische proeven22,23. Een recente studie van onze laboratorium aangetoond dat MLN0128 een krachtige mTOR-remmer in menselijke longen tumor cellijnen en in vivo in KL GEMMs long kanker15,16 is. MLN0128 onderdrukt het longkanker tumor groei en glucose metabolisme in deze muizen24.
In deze studie profiteren we van de goed gekarakteriseerd adenovirale Cre-geïnduceerde Muismodellen van longkanker geïnitieerd door een voorwaardelijk geactiveerde Lox-Stop-Lox-KRASG12D oncogen15,25. Deze KrasG12D muizen werden gekruist met muizen die floxed allelen van Lkb1 (Lkb1L/L) voor het genereren van KrasG12D; Lkb1L/L (KL) muizen16. Na de intranasale levering van adeno- of lentivirus Cre recombinase uitdrukken, ontwikkelen de KL muizen vroege laesies per 4 weken na tumor-inductie. Door 6 weken, de tumoren in de overgang van de KL-muizen van adenomateuze tumoren naar een meer kwaadaardige, agressieve tumor fenotype typische van carcinomen van de longen, en 8-10 weken ontwikkelen de muizen openhartige carcinomen met een 100% doordringendheid16,26.
Beide PET/CT beeldvorming en kwantitatieve immunohistochemistry kan worden gebruikt om te bepalen van de moleculaire en metabole reacties evenals de therapeutische respons in tumoren volgend op de levering van gerichte therapieën zoals MLN012817, 26,27. Hier beschreven is een experimenteel protocol dat gebruikmaakt van 18F-FDG-PET imaging voor het meten van de metabole respons op een MLN0128-gerichte therapie. PET beeldbewerking met kwantitatieve histologie koppeling maakt het meten van de moleculaire reactie op remming van de mTOR en de kwantificering van de lasten van de tumor en histologie van de tumor.
Protocol
Alle procedures die zijn beschreven in het protocol zijn goedgekeurd door de institutionele dierenverzorgers en gebruik van de Commissie (IACUC) aan de Universiteit van Californië, Los Angeles.
1. 18F-FDG-PET- en CT beeldvorming in muizen
Let op: Gebruik beschermingsmiddelen bij het verwerken van radioactiviteit. Volg alle toepasselijke wettelijke procedures bij het verwerken van radioactiviteit.
- Plaats de kooi met de muizen aan het image worden gemaakt op een warm bed bij 37 ° C 1 uur vóór de 18F-FDG injectie te verminderen de bruin vet-consumptie van 18F-FDG.
Opmerking: De muizen voor 4-16 h vasten kan helpen verminderen de myocardiale consumptie van 18F-FDG. - Weeg de muis en haar gewicht.
- Anesthetize van de muis met 2-3% Isofluraan in zuurstof op 0,5 - 2 L/min gedurende 2-3 minuten met behulp van een kamer van de verdoving bewaard bij 37 ° C. Zorgen dat muis heeft zijn verdoofd door knijpen de teen; geen reactie zullen worden waargenomen als de muis heeft zijn verdoofd. Ophthalmic zalf toepassen op de ogen om te voorkomen dat een droogte tijdens de narcose.
- 18F-FDG (109 min radioactieve half-life) verdund in een steriele zoutoplossing bij een injectie van aangepaste verval-gecorrigeerde concentratie van 70-75 µCi/100 µL.
Opmerking: Volg de PET-scannerfabrikant aanbevolen 18F dosering voor optimale scanner imaging. - Tekenen van 70-75 µCi met een insuline-injectiespuit met een naald 28 G, de dosis van de radioactiviteit met behulp van een dosis kalibrator meten en opnemen van de meting en de tijd. Plaats de spuit in een voorsprong spuit houder.
Nota: Het bedrag van 18F-FDG radioactiviteit in elke dosis wordt gemeten met een dosis kalibrator, die tegen een standaard referentiemateriaal, zoals cesium-137, is gekalibreerd volgens de protocollen van de fabrikant. De lezing wordt bovendien ingeschreven om te bepalen van de verval-correctie. - Prik het distale einde van de staart van de muis en het meten van de bloedglucose van de muis met een glucometer.
- Warm de staart voor 1-2 min met een gaas geweekt in warm water. Veeg de staart met 70% isopropanol verwijden de ader van de staart net vóór de inspuiting. 100 µL van 18F-FDG (het hele volume in de spuit) beheren met een bolus injectie via de laterale staart ader en registreren de tijd van de injectie. Meten van de resterende dosis in de spuit met behulp van de kalibrator van de dosis en de meting en de tijd vastleggen.
Opmerking: Er zullen enkele bedrag van sonde links in de spuit. Het gebruik van insuline spuiten heeft de voorkeur boven spuiten verbonden met naalden via Luer sloten te wijten aan de verminderde hoeveelheid de dosis gevangen in de injectiespuit/naald na de injectie is toegediend. - Plaats de ingespoten muis in de zaal van de verdoving bleef onder 1.5-2% Isofluraan bij 37 ° C om de sonde te worden gedistribueerd via de muis de systemische circulatie gedurende 1 uur vóór de PET-scan.
Opmerking: Het kan zinvol zijn om de blaas vóór het scannen als u wilt toestaan voor een gemakkelijker 18F-FDG-PET visualisatie van de tumoren geïmplanteerd in de lagere flanken van de muis ongeldig. - Na 1 h, plaatst u de muisaanwijzer in een imaging zaal onder nose-cone Isofluraan verdoving en bij 37 ° C en beveiligen van haar ledematen in plaats met medische tape in een liggende positie.
- Plaats de imaging zaal in de PET/CT-scanner.
- Verwerven de PET- en CT-scans, zoals beschreven in de handleiding voor PET/CT scanner28.
Opmerking: De PET beelden zijn verworven voor 600 s met een energie-venster van 150-650 keV, gereconstrueerd met behulp van maximaal-waarschijnlijkheid verwachting maximalisatie met correcties voor foton demping, detector normalisatie en isotoop verval (een scatter correctie was niet toegepast). De CT-beelden zijn verworven in een continue mode voor 50 s met behulp van een 50 kVp, 200 µA X-ray bron en een flat-panelbeeldscherm detector, en ze zijn gereconstrueerd met behulp van de Feldkamp-algoritme. - Nadat de PET/CT is voltooid, verwijder de muis uit de imaging kamer en laat ze te herstellen in zijn kooi. Controleren de muis totdat het volledig bewustzijn heeft herwonnen en sternale ligcomfort kan handhaven.
- De gereconstrueerde PET/CT-beelden in AMIDE software importeren door te klikken op bestanden vervolgens Openen het juiste bestand te kiezen.
- De PET-gegevens naar de eenheid van procent-ingespoten dosis per gram (%ID/g) door het invoeren van de dosis op het moment van injectie na boekhouding voor eventuele resterende dosis in de spuit liet of naar de eenheid van gestandaardiseerde opname waarde (SUV) Bovendien door de certificaathouder converteren gewicht. Om dit te doen, klik met de rechtermuisknop op de PET-gegevensset en zoek het %ID/g-veld op de tab Basisinfo Enter de %ID/g eerder opgenomen.
- Het opstellen van de regio's-of-interest (ROIs) betreffende tumoren en normale weefsels (lever, spieren, longen, hart, hersenen en onderhuids vet). Om dit te doen, klik op bewerken, kies Toevoegen ROI, ROI shape te selecteren en een naam geven aan de ROI. ROIs trekken over tumoren en weefsels en aanpassen van hun afmetingen ter dekking van weefsel van belang in alle 3 assen.
Opmerking: Om verschillen in PET sonde ook dieren te verklaren, tumor ROI waarden kunnen worden verdere genormaliseerd naar ROI waarden van de lever, een goed perfused orgel met minimale glycolytic activiteit vertegenwoordigen 18F-FDG in omloop. ROI analyses van de tumor en normale weefsels worden uitgevoerd op de dezelfde muis. Long tumor laesies worden over het algemeen aangeduid met 18F-FDG-PET aangezien de 18F-FDG handhaving in een normale Long relatief laag is. CT is ook gebruikt ter identificatie van de letsels, met name de laesies die 18F-FDG niet-avid zijn. Een ex vivo analyse van geïsoleerde longen helpt ook om het lokaliseren van de tumor laesies.
2. 18F-FDG autoradiografie
- De muis voorbereiden beeldbewerking met 18F-FDG door stap 1.1-1.12, behalve nu, verdunde 18F-FDG in steriele zoutoplossing bij een concentratie van de gecorrigeerde verval-gecorrigeerde injectie van 1.000 µCi/200 µL.
Opmerking: Hogere doseringen van 18F-FDG worden gebruikt voor autoradiografie ter verantwoording voor extra monster verwerking tijd en een optimale detectie door fosfor platen. - Euthanaseren de muis via een dodelijke inademing van Isofluraan op 5% of door CO2 (een IACUC-goedgekeurde procedure).
Opmerking: Cervicale dislocatie niet mag dienen als dit schade aan het longweefsel veroorzaken kan. - PIN de muisknop ingedrukt met het ventrale oppervlak blootgesteld en spuiten met 70% ethanol aan mat neer zijn haren voordat de incisie.
- Open de borstholte door toepassen van een middellijn incisie, knippen weg het middenrif en verwijderen van de muren van de borst. Bloot in de luchtpijp door het zorgvuldig verwijderen van de speekselklier. Plaats de bulldog-klem op de luchtpijp als dicht bij de kaak mogelijk, zorgen voor een strakke pasvorm op de luchtpijp. Plaats een 23 G naald gekoppeld aan een 3 mL injectiespuit in de luchtpijp onder de bulldog klem en injecteren ~ 2 mL van een OCT:PBS (1:1) (optimale snijden temperatuur: fosfaat gebufferde zoutoplossing) oplossing.
Opmerking: OCT is zeer viskeuze en is vermengd met PBS met het oog op een gemakkelijker injectie in de longen. - Verwijder de naald uit de luchtpijp en pincet met klem op het punt van de injectie om te voorkomen dat eventuele lekken van de OCT:PBS oplossing.
- Zorgvuldig verwijderen van de longen van de borstholte en de linker kwab scheiden van de rest van de longen. Plaats de linker kwab in gelabelde cryomold gevuld met een paar druppels van LGO. Zodra de Long kwab binnen de schimmel is, vullen de cryomold naar de top met LGO.
- Herhaal dezelfde procedure met de rechterhelft van de longen.
Opmerking: Als het signaal van de 18F-FDG in het hart verwachte zit voor zitten hoog of als de Long tumoren zich dicht bij het hart bevinden, het misschien wel gunstig voor het hart om te voorkomen dat lekkages van de controlepijlen verwijderen. U kunt ook kunnen hele longen worden ingebed in een enkele cryomold. Het is belangrijk om te voorkomen dat de luchtbellen, bij het werken met LGO. - Plaats de voorbereide cryomold met lange pincet in een container van de gesloten cellen geëxtrudeerde polystyreen met een mengsel van droogijs en tolueen.
Opmerking: Dit mengsel moet bij ongeveer-70 ° C alvorens de cryomold in het voor bevriezing. Na het harden wordt de OCT compound wit. Als meerdere monsters tegelijk worden verwerkt, kunnen de bevroren monsters in OCT cryomolds tijdelijk worden opgeslagen op droog ijs. - Verwijder van het diepgevroren blok uit de cryomold en mount het op een cryostaat voor segmenteren. Het gedeelte van het blok bij een dikte van 4 µm met behulp van microtoom messen (34°/80 mm, hoog profiel). De weefselsecties overbrengen in een glasplaatje dat is opgeslagen op kamertemperatuur.
- Plaats het specimen dia's op een fosfor imaging plaat. Plaats de plaat in de cassette en zachtjes sluiten om te voorkomen dat dia's verschuiven. Opslaan van de cassette in een vriezer van-20 ° C voor de blootstelling van de plaat, meestal 's nachts.
Opmerking: De platen en cassettes moeten vooraf worden gekoeld tot-20 ° C vóór gebruik. Plaatsen van de monsters bij-80 ° C is eveneens aanvaardbaar. - Na de blootstelling, de dia's te verwijderen van de plaat en de plaat op de afbeelding-reader gelezen.
- De dia's kunnen worden verpakt in plasticfolie en opgeslagen bij-80 ° C, of ze kunnen worden voorbereid voor de haematoxyline en eosine-kleuring of immunohistochemistry.
3. het oogsten van longweefsel voor histologie
- Stappen 2.2-2.4, behalve nu, in plaats van met behulp van de OCT:PBS oplossing, 2-3 mL 10% normale gebufferde formaline vast van de longen te injecteren.
- Verwijder de naald uit de luchtpijp en pincet met klem op het punt van de injectie om te voorkomen dat eventuele lekken van de formaline. Zorgvuldig verwijderen van de longen van de borstholte en plaats hen in een conische tube van 50 mL, met ~ 20 mL 10% normale gebufferde formaline voor 16-24 uur om ervoor te zorgen een volledige vastlegging.
Opmerking: Vaststelling van de longen zorgt voor het behoud van de optimale anatomische eigenschappen. - De volgende dag, de vaste longen uit de formaline overbrengen in 70% ethanol en voorbereiden van de longen te worden geplaatst in de cassette van een weefsel.
- Histologie de longen voorbereiden door zorgvuldig ontleden met behulp van schaar te knippen op vertakkingspunten tussen 5 lobben, genummerd van 1-5 zoals weergegeven in Figuur 1D, lobben en plaats ze in een niet-overlappende oriëntatie in het weefsel cassette. Plaats een schuim pad zachtjes op het longweefsel de oriëntatie om intact te houden.
- Bewaren de lobben ontleed longkanker in 70% ethanol tot de paraffine inbedding.
- Paraffine-insluiten van het weefsel in cassettes en snijd 4 µm dik secties voor de kleuring, met behulp van standaardprocedures.
4. de weefsels segmentatie en kwantificering met behulp van commerciële Software
- Afbeelding haematoxyline en eosine (H & E) gekleurd Long secties bij een 1.25 X vergroting met behulp van een commerciële multispectrale imaging systeem.
- De beelden omzetten in digitaal beeld kubussen en laden (Klik op bestanden vervolgens op Laden spectrale bibliotheek) pre-en-klare spectrale bibliotheken voor H & E.
Opmerking: De spectrale bibliotheken zijn tevoren ontwikkeld door spectrale afbeeldingen ophalen van afzonderlijk gebeitst Long secties, één sectie gekleurd alleen met eosine en de andere alleen gekleurd met haematoxyline, die zijn opgeslagen in een open-source merkgebonden spectrale bibliotheek bestand (.csl). De imaging systeem heeft besturingssoftware dat een afbeelding bij elke golflengte die nodig is verwerft (zoals gedefinieerd door het protocol van de overname). Die beelden (de "afbeelding-kubus") worden opgeslagen in een open-source merkgebonden multispectrale-bestandsindeling (.im3). Spectra worden opgehaald uit de kubus van de afbeelding met behulp van de software van de Morfometrische en opgeslagen in aparte spectrale bibliotheekbestanden. - Spectraal unmix de pseudo-gekleurde H & E beelden van de hele longen door te klikken op de knop Unmix .
Opmerking: Randverwijdering duurt minder dan 1 s. Het aantal pixels in elk weefseltype werden gekwantificeerd aan de hand van de software van de analyse van de afbeelding van Morfometrische. - Elke afbeelding kubus visualiseren door de multispectrale gegevens converteren naar de equivalente 3-kleur (rood, groen en blauw) beeld met behulp van de eye's golflengte-afhankelijke kleur reactie convolved met de intensiteit van elke afbeelding.
Opmerking: De resulterende 3 afbeeldingen worden weergegeven als een afbeelding standaard 24-bits kleur. - Pseudo-kleur elke ongemengde afbeelding door schaling van dat beeld in een gebruiker gekozen kleur (bijvoorbeeldrood, groen, paars, enz) en toevoegen dat samen met de andere pseudo-gekleurde ongemengde beelden in één standaard 24-bits kleurenbeeld.
- Gebruik de standaardinstellingen voor alle analyses.
Opmerking: In het algemeen, aangezien dit soort segmentatie is gebaseerd op een visuele beoordeling van de resultaten (dat wil zeggen, een evaluatie van hoe goed de segmentatie van de beelden buiten de opleiding werkt set), is het belangrijk om goed verdelen de beelden in opleiding, test en validatie sets. - Begin met 2-3 beelden als een opleiding ingesteld (10-15 voor menselijke biopsie monsters), trein op die tot de resultaten er goed uitzien, en vervolgens dat algoritme op een ander 2-3 beelden toepassen. Vervolgens de resulterende algoritme om de volledige validatie set passen.
Opmerking: Waarschijnlijk sommige omscholing nodig zullen zijn. - Het gebied van de tumor in de hele Long secties analyseren door het berekenen van het aantal totale pixels voor de rode pseudo-gekleurde tumoren in lobben 1-5 van elke muis.
Opmerking: Het normale weefsel was pseudo-gekleurde groen en bloed/bloedcellen schepen werden pseudo-gekleurde roze zoals afgebeeld in Figuur 3. De gemiddelde tumor lasten voor alle behandelde groepen werd berekend door het meten van de totale pixel tellen voor elke muis in de behandelde groep.
Representative Results
18 F-FDG-PET beeldvorming werd uitgevoerd op KL muizen en toonden aan dat de tumoren in deze muizen zeer glycolytic waren zoals blijkt uit een verhoogde 18F-FDG verbruik (Figuur 1A), akkoord met eerder gepubliceerde studies26, 29. Een resectie van hele longen bleek de aanwezigheid van verschillende tumoren (Figuur 1B). Muis longen kunnen worden onderverdeeld in 5 aparte lobben vertegenwoordigd in cijfers 1 c en 1 D. 1-5 lobben waren gelabeld op verdeelde longen die werden gekleurd met H & E of glucose transporter 1 (Glut1) (Figuur 1D). Glut1 is een primaire vervoerder van glucose en 18F-FDG zowel qua uitdrukkingswijze en localization voor het plasma-membraan van tumorcellen direct correleren met 18F-FDG SUV29. Een hogere resolutie analyse van Glut1 kleuring (40 X) in 18F-FDG-avid Long tumoren toont een verhoogde expressie en de localisatie van de vervoerder op het plasma-membraan (Figuur 1D).
Als gevolg van de beperkte resolutie van PET imaging, zowel PET/CT en weefsel autoradiografie werden uitgevoerd. De hogere resolutie van autoradiografie mogelijk kleinere tumoren en/of heterogeniteit van de tumor 18F-FDG distributie te herkennen. Na de tumor-inductie, werd 18F-FDG PET/CT beeldvorming uitgevoerd op KL muizen(Figuur 2)gevolgd met behulp van autoradiografie op longen geïsoleerd van deze muizen (cijfers 2B en 2 C). Zoals gezien in cijfers 2B en 2 C, de autoradiografie geïdentificeerd twee extra kleinere tumoren die waren positief voor 18F-FDG maar waren niet waarneembaar door PET. Na autoradiografie, de dia's met weefsel kunnen ook worden gebruikt voor de immunohistochemische (IHC) kleuring van biomarker(s). Bevestigde de aanwezigheid van tumoren in de linker kwab (Figuur 2D) H & E kleuring voor de tumoren.
Vervolgens werd 18F-FDG-PET imaging uitgevoerd op MLN0128-behandeld KrasG12D; Lkb1- / - muizen om gebruik te maken van 18F-FDG als een functionele biomarker van glucose metabolisme in Long tumoren (Figuur 3). Wij vastgesteld dat een behandeling met MLN0128 geremd krachtig de mTORC1 signalering en glycolyse zoals door een verminderde 18F-FDG-verbruik (figuren 3A en 3B). Deze resultaten overeen met preklinische studies MLN0128 in KL muizen als eerder gepubliceerd door onze laboratorium17,27te beoordelen. Tot slot, IHC kleuring werd uitgevoerd op de tumoren (Figuur 3C). Tumoren waren bevlekt H & E of met antilichamen tegen phospho-S6, dat is een geconserveerde substraat van mTORC1 en wordt gebruikt om aan te geven van de activering van een mTORC1 (P-S6) vs. inactivering (S6). Figuur 3 C toont een robuuste remming van P-S6 door MLN0128 in KL tumoren in vergelijking met die behandeld met een voertuig, die met eerder gepubliceerde werk17 instemt. Naast KRAS ondersteunen oncogene stuurprogramma's zoals de epidermale groeifactor receptor (EGFR) het glycolytic metabolisme in Long tumoren ook. Dus we getest of de remming van constitutively actieve mutant EGFR met erlotinib het metabolisme van de 18F-FDG in muis xenografts onderdrukt. Cijfers 3D en 3E tonen aan dat de menselijke longen tumor lijn HCC827, die havens een EGFR del19 mutatie, bleek een aanzienlijk lagere 18F-FDG verbruik na vijf dagen van erlotinib behandeling.
Tot slot, Morfometrische weefsel analyse werd uitgevoerd op verdeelde longen en tumoren van de Long te kwantificeren van de totale tumor lasten alsmede over differentiëren tumor pathologieën die weefsel subtype, necrose, bloedvaten van normaal longweefsel, en het luchtruim opgenomen. De KL-GEMMs ontwikkelde een complexe en pathologisch heterogene ziekte die zich gepresenteerd met longkanker tumoren van verschillende histopathologies. Deze omvatten adenocarcinomas (ADC) en squamous cel carcinomen (SCC)-Deze heterogeniteit maakt de behandeling van deze vorm van kanker een formidabele uitdaging. Figuur 4 A toont een enkele H & E gekleurd Long kwab met twee grote tumoren aanwezig. De vergroting beelden met een hogere afgebeeld in Figuur 4B identificeren een normale Long, schepen, en luchtruim en tumor necrose evenals adenocarcinoom, gekenmerkt door een goed gedefinieerde papillaire structuur en een plaveiselcelcarcinoom. Figuur 4 C staat voor de pseudo-kleuring van de Long kwab en tumor Inform Morfometrische softwarematig. Figuur 4 D toont de percentages van de normale Long, schepen en individuele aandoeningen zoals tumor necrose en subtypes van de tumor die gesegmenteerd goed gedifferentieerd adenocarcinoom van plaveiselcelcarcinoom.
Figuur 1 : Metabolisch actief KrasG12D; Lkb1- / - (KL) mutant Long tumoren zijn 18F-FDG positieve en uitdrukkelijke hoge niveaus van de glucose transporter 1 (Glut1). Panelen A en B Toon een projectie van de maximale intensiteit [ook wel aangeduid als een 3-dimensionale (3D) beeld] van de 18F-FDG-PET- en CT-analyse op sommige muizen van FDG-avid KL herbergen squamous Long tumoren. Weergegeven zijn (A) een 3D reconstructie en (B) dwarse, Sagittaal en coronale uitzicht op Long tumor(s) (T). (C) dit paneel toont een hele Long histologie van de muis van de KL beeld in panelen A en B, hetzij gekleurd voor H & E (bovenzijde) of met een antilichaam specifiek voor Glut1 (onderkant). De lobben van de Long worden genummerd. De schaal balk = 2 mm. (D) dit diagram vertegenwoordigt de richting en het aantal kwabben in de muizen (bovenzijde) en hogere resolutie 40 X beelden van de H & E of Glut1-gebeitste tumoren van de dia's weergegeven in het deelvenster C voor H & E (middelste deelvenster) of gekleurd met een antilichaam specifiek voor Glut1 (onderkant). De schaal bar = 25 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: 18 F-FDG autoradiografie kan kleine tumoren die metabolisch actief zijn identificeren. (A) dit 18F-FDG PET/CT beeld toont 18F-FDG-avid tumoren in een KL-muis als een projectie van maximale intensiteit-afbeelding weergegeven. T1 en T2 = tumoren, H = het hart, B = de blaas, K = van de nieren. (B) dit paneel toont de autoradiografie ex vivo op seriële secties van de rechter en linker long kwab van de muis. De longen in de panelen links en rechts zijn identiek. De longen in de linker panelen zijn pseudo oranje gekleurd. De longen in de juiste panelen zijn gekleurd in zwart-wit. De tumoren (T1, T2 en T3) worden aangegeven met pijlen. (C) Dit is een vergrote weergave van de autoradiografie pseudocolored oranje (bovenzijde) en zwart / wit (onderkant). (D) dit paneel toont de H & E kleuring van het bovenste segment van de linker kwab in deelvenster Bweergegeven. De schaal bar = 200 µm Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : De mTOR-remmer MLN0128 onderdrukt glucose consumptie in Long tumoren van KL muizen opgespoord door 18F-FDG PET (A) dit paneel toont representatieve 18F-FDG PET/CT-beelden van KL muizen behandeld met een voertuig (18F-FDG avid, links) of MLN0128 (18F-FDG niet-avid, rechts). De dwarse (bovenzijde), coronale (middelste deelvenster) en Sagittaal (lagere paneel) weergaven worden weergegeven. De tumoren worden beschreven met rode lijnen; H = het hart, L = van de lever. (B) dit paneel toont een kwantificering van SUVmax (%ID/g) tussen de voertuig - en MLN0128-testgroep tumoren. (C) dit paneel toont de H & E en P-S6 kleuring van hele Long secties van KL muizen behandeld met voertuig of MLN0128. De schaal bar = 25 µm. (D) dit paneel toont representatieve 18F-FDG-PET- en CT-beelden van HCC827 EGFR (del19) xenografts pre en post-erlotinib behandeling. De tumor (T) wordt aangegeven met een pijl, K = de nier, B = van de hersenen. (E) dit paneel toont een kwantificering van de SUVmax (%ID/g) voor HCC827 xenografts vóór en na de behandeling erlotinib. n = 10 tumoren/groep. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Tumor lasten en histologie van de tumor worden gekwantificeerd aan de hand van de Morfometrische software.
(A) dit paneel toont de H & E kleuring van een enkele muis Long kwab met een tumor verzameld van een KL-muis. (B) deze resolutiebeelden met een hogere weergeven het plaveiselcelcarcinoom (linksboven), de normale Long, de schepen, en de luchtkamer (rechts boven), en de goed gedifferentieerde papillaire adenocarcinoom (linksonder) en necrose (rechtsonder). (C) dit paneel toont de pseudocoloring van de H & E gebeitste Long kwab met behulp van de Morfometrische software. (D) dit paneel toont de percentages voor de individuele Long kwab en tumor pathologieën gemeten door Inform. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
In dit artikel beschreven een imaging gebaseerde experimentele aanpak die 18F-FDG PET/CT beeldvorming met qIHC om te meten de metabole en moleculaire reacties in tumoren van de Long volgend op de levering van de mTOR-remmer MLN0128 gebruikt. MLN0128 verminderd effectief de 18F-FDG consumptie, met vermelding van een significante metabole reactie in de tumoren. Door PET/CT beeldvorming te koppelen aan immunohistochemistry, konden we ruimtelijk verdeelde tumoren aan de 3D PET/CT-beelden te registreren en een gedetailleerd onderzoek van hele tumoren op een cellulair en moleculair niveau. Dit maakte het mogelijk om te bevestigen dat de MLN0128 de mTOR signalering, dus de bevestiging van een reactie op de doelsoort moleculaire op de drug in de tumoren geremd. Ten slotte, door te profiteren van kwantitatieve histologie, konden we kaart en afzonderlijke verschillende tumor pathologieën, zoals totale tumor massa van tumor necrose, adenocarcinoom van squamous cel carcinomen definiëren, en aanvulling van microPET imaging.
MicroPET is momenteel beperkt door een ruimtelijke resolutie van ongeveer 1 mm. Bovendien, kan 18F-FDG retentie in bepaalde weefsels worden beïnvloed door verschillende factoren, waaronder de niveaus van de glucose van de plasma, het type en de duur van blootstelling van de verdoving, de omgevingstemperatuur en de algemene gezondheid van het dier, dat mogelijk van invloed op 18 F-FDG farmacokinetiek30. Deze parameters zijn geoptimaliseerd voor dit protocol maar moeten worden geoptimaliseerd voor elke diermodel. Reproduceerbaarheid studies van 18F-FDG beeldvorming van subcutane tumoren in muizen tonen een variatiecoëfficiënt voor de gemiddelde %ID/g van ongeveer 15%, wat suggereert dat de tumor therapeutische respons van een individuele muis beoordeeld door 18 F-FDG-PET moeten groter zijn dan deze drempel beschouwd als betrouwbare en belangrijke31.
De cellulaire en zelfs subcellular verdeling van PET traceurs kan worden beoordeeld met behulp van autoradiografie weefsel met de secties vervolgens gekleurd en co geregistreerd bij qIHC. Medefinanciering registratie PET met CT staat een afbeelding van de PET worden in context te plaatsen een anatomische; Dit is uiterst waardevol, zelfs met lage weke contrast. Het ontbreken van weke delen contrast door CT kan worden overwonnen met magnetische resonantie beeldvorming (MRI). Bovendien, biomarkers voor fluorescentie beeldvorming kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de glycolyse in vivo, maar foton absorptie en spreiding in de holte van de longkanker van invloed kan zijn op de nauwkeurige kwantificatie of detectie gevoeligheid32. Kortom biedt gebruik makend van hele dieren PET/CT beeldvorming met kwantitatieve histologie een nauwkeurige en real-time kaart van biologie van de tumor na therapeutische interventie.
Multispectrale imaging (MSI) is van toepassing in elke situatie waar een afbeelding in kleur kan worden gebruikt. Op zijn minst, kan MSI biedt dezelfde informatie als een afbeelding in kleur, en voor sommige toepassingen, MSI dat meer gedetailleerde informatie over de spectrale eigenschappen van een monster dan een eenvoudige breedband drie kleuren (RGB) afbeelding. In het algemeen, zijn de beperkingen van MSI die van kleur imaging, behalve dat MSI langzamer is en meer tijd kost om beelden te verwerven. De software van de Morfometrische werd gebruikt om reproduceerbare, nauwkeurige segmentatie resultaten voor de beelden te verkrijgen en is beschreven in de Tabel van materialen. Er zijn extra verkrijgbare producten die kunnen worden gebruikt voor segmentatie van het weefsel en de kwantificering van histologie.
De complexiteit van kanker metabolisme verder reikt dan het Warburg Effect en het glucose metabolisme33,34. Het is zeer waarschijnlijk dat de tumoren gemakkelijk zal aanpassen aan enkele agent behandelingen die een remmende werking glycolyse. De afhankelijkheid van het metabolisme van het aminozuur is goed gedocumenteerd in kanker, en de verwachting is dat de tumoren op allerlei amino acids zoals glutamine en glycine, serine, evenals andere metabolieten zoals vrije vetzuren35,36, vertrouwen 37. Naast 18F-FDG, zijn sondes zoals 18F - 11C-label glutamine, choline en acetaat, 1-(2'-Deoxy-2'-fluoroarabinofuranosyl), cytosine (FAC) en fluorothymidine (FLT) met succes gebruikt om beeld aminozuur, nucleotide, en lipide metabolisme in diermodellen voor kanker38,39,40,41. Automatisering en microscale tracer radiochemie technologieën in combinatie met hogere resolutie, hogere gevoeligheid PET-scanners zal het verbeteren van de toegankelijkheid van PET voor het meten van diverse biologische procedures42,43. Als het begrip van de verhoging van de stofwisseling is het logisch dat het repertoire van PET radiotracers toenemen zal, waardoor onderzoekers en artsen aan noninvasively profiel tumor metabolisme.
Het gebruik van PET/CT beeldvorming en kwantitatieve histologie behandelt een klinische behoefte, die is te snel vertalen Bank ontdekkingen in klinische gebruik. Om dit te bereiken, moeten onderzoekers kunnen zowel de therapeutische respons als de verworven resistentie tegen geneesmiddelen, welke PET/CT beeldvorming kunt nauwkeurig te meten. Bovendien, de PET/CT en immunohistochemische analyse van tumoren van de Long worden gebruikt als standaard van zorg voor patiënten, en zijn dus direct worden omgezet in de klinische praktijk. Nog belangrijker is, identificeert PET/CT beeldvorming gemakkelijk therapie-resistente tumoren, welke onderzoekers kunnen isoleren en ondervragen op een moleculair niveau om de mechanismen van de ziekte beter te begrijpen. Dit is een iteratief proces dat het mogelijk gemaakt heeft om beter te begrijpen van de mechanismen van resistentie en ontwerpen van meer effectieve therapeutische strategieën voor de klinische vertaling.
Disclosures
Kevin P. Francis is een medewerker van Perkin Elmer. James Mansfield is een publieke aandeelhouder van PerkinElmer, Inc (PKI) aandelen op NASDAQ. De auteurs hebben niets anders te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de University of California Los Angeles' Crump Preclinical Imaging Technology Center voor hun hulp met de PET/CT beeldvorming van de muizen, het translationeel pathologie Core laboratorium en de kern van de statistieken op de Universiteit van Californië-Los Angeles David Geffen School of Medicine voor hun hulp bij de bereiding van de monsters van de tumor en analyse. Voor financiering, David B. Shackelford werd gesteund door de CTSI en KL2 translationeel Science Award verlenen nummers KL2TR000122 en UL1TR000124 op de David Geffen School of Medicine aan de UCLA en door het departement van defensie long kanker onderzoek programma translationeel Onderzoek partnerschap W81XWH-13-1-0459 en ACS RSG-16-234-01-TBG. Sean T. Bailey werd gesteund door een NIH T32 opleiding grant HL072752 via de David Geffen School of Medicine aan de UCLA. Anthony Jones wordt ondersteund door de UCLA Tumor cel biologie BKO (USHHS Ruth L. Kirschstein institutionele nationale Research Service Award # T32 CA009056). Gihad Abdelhady wordt ondersteund door een NIH/NCI diversiteit Supplement R01CA208642.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| G8 PET/CT | Perkin Elmer | CLS139564 | Used for 18F-FDG PET and CT imaging of mice |
| Axio Imager.M2 | Zeiss | 490020-0003-000 | Acquiring images of FFPE lung tumor sections |
| Inform software | Perkin Elmer | CLS135781 | Morphometric used for image analysis of tumor pathologies |
| Glut1 antibody | Alpha Diagnostics | GT12-A | IHC staining of FFPE lung tumor sections |
| Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP™ Rabbit mAb | Cell Signaling Technologies | 4858 | IHC staining of FFPE lung tumor sections |
| MX35 Premier microtome blades | Thermo Fisher Scientific | 3051835 | Microtome blades for sectioning tissue for autoradiography |
References
- Shackelford, D. B., Shaw, R. J. The LKB1-AMPK pathway: metabolism and growth control in tumour suppression. Nature Reviews Cancer. 9 (8), 563-575 (2009).
- Shaw, R. J., et al. The LKB1 tumor suppressor negatively regulates mTOR signaling. Cancer Cell. 6 (1), 91-99 (2004).
- Shackelford, D. B., et al. mTOR and HIF-1alpha-mediated tumor metabolism in an LKB1 mouse model of Peutz-Jeghers syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11137-11142 (2009).
- Faubert, B., et al. Loss of the tumor suppressor LKB1 promotes metabolic reprogramming of cancer cells via HIF-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2554-2559 (2014).
- Hemminki, A. The molecular basis and clinical aspects of Peutz-Jeghers syndrome. Cellular and Molecular Life Sciences. 55, 735-750 (1999).
- Hemminki, A., et al. A serine/threonine kinase gene defective in Peutz-Jeghers syndrome. Nature. 391 (6663), 184-187 (1998).
- Sanchez-Cespedes, M. A role for LKB1 gene in human cancer beyond the Peutz-Jeghers syndrome. Oncogene. 26 (57), 7825-7832 (2007).
- Sanchez-Cespedes, M., et al. Inactivation of LKB1/STK11 is a common event in adenocarcinomas of the lung. Cancer Research. 62 (13), 3659-3662 (2002).
- Ding, L., et al. Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma. Nature. 455 (7216), 1069-1075 (2008).
- Ylikorkala, A., et al. Vascular abnormalities and deregulation of VEGF in Lkb1-deficient mice. Science. 293 (5533), 1323-1326 (2001).
- Bardeesy, N., et al. Loss of the Lkb1 tumour suppressor provokes intestinal polyposis but resistance to transformation. Nature. 419 (6903), 162-167 (2002).
- Miyoshi, H., et al. Gastrointestinal hamartomatous polyposis in Lkb1 heterozygous knockout mice. Cancer Research. 62 (8), 2261-2266 (2002).
- Jishage, K., et al. Role of Lkb1, the causative gene of Peutz-Jegher's syndrome, in embryogenesis and polyposis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (13), 8903-8908 (2002).
- Shackelford, D. B. Unravelling the connection between metabolism and tumorigenesis through studies of the liver kinase B1 tumour suppressor. Journal of Carcinogenesis. 12, 16 (2013).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes & Development. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Ji, H., et al. LKB1 modulates lung cancer differentiation and metastasis. Nature. 448 (7155), 807-810 (2007).
- Momcilovic, M., et al. Heightening energetic stress selectively targets LKB1-deficient non-small cell lung cancers. Cancer Research. 75 (22), 4910-4922 (2015).
- Wislez, M., et al. Inhibition of mammalian target of rapamycin reverses alveolar epithelial neoplasia induced by oncogenic K-ras. Cancer Research. 65 (8), 3226-3235 (2005).
- Liang, M. C., et al. TSC1 loss synergizes with KRAS activation in lung cancer development in the mouse and confers rapamycin sensitivity. Oncogene. 29 (11), 1588-1597 (2010).
- Hudes, G., et al. Temsirolimus, interferon alfa, or both for advanced renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 356 (22), 2271-2281 (2007).
- Wander, S. A., Hennessy, B. T., Slingerland, J. M. Next-generation mTOR inhibitors in clinical oncology: how pathway complexity informs therapeutic strategy. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1231-1241 (2011).
- Pourdehnad, M., et al. Myc and mTOR converge on a common node in protein synthesis control that confers synthetic lethality in Myc-driven cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11988-11993 (2013).
- Hsieh, A. C., et al. The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis. Nature. 485 (7396), 55-61 (2012).
- Momcilovic, M., et al. Heightening energetic stress selectively targets LKB1-deficient non-small cell lung cancers. Cancer Research. 75 (22), 4910-4922 (2015).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
- Shackelford, D. B., et al. LKB1 inactivation dictates therapeutic response of non-small cell lung cancer to the metabolism drug phenformin. Cancer Cell. 23 (2), 143-158 (2013).
- Momcilovic, M., et al. Targeted Inhibition of EGFR and Glutaminase Induces Metabolic Crisis in EGFR Mutant Lung Cancer. Cell Reports. 18 (3), 601-610 (2017).
- Preclinical PET Imaging Systems | GA PET/X-ray & G8 PET/CT. Perkin Elmer. , Available from: http://www.perkinelmer.com/preclinical-pet-imaging/index.html (2018).
- Goodwin, J., et al. The distinct metabolic phenotype of lung squamous cell carcinoma defines selective vulnerability to glycolytic inhibition. Nature Communications. 8, 15503 (2017).
- Fueger, B. J., et al. Impact of animal handling on the results of 18F-FDG PET studies in mice. Journal of Nuclear Medicine. 47 (6), 999-1006 (2006).
- Dandekar, M., Tseng, J. R., Gambhir, S. S. Reproducibility of 18F-FDG microPET studies in mouse tumor xenografts. Journal of Nuclear Medicine. 48 (4), 602-607 (2007).
- Luker, G. D., Luker, K. E. Optical imaging: current applications and future directions. Journal of Nuclear Medicine. 49 (1), 1-4 (2008).
- Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324 (5930), 1029-1033 (2009).
- Vander Heiden, M. G., DeBerardinis, R. J. Understanding the intersections between metabolism and cancer biology. Cell. 168 (4), 657-669 (2017).
- Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
- Possemato, R., et al. Functional genomics reveal that the serine synthesis pathway is essential in breast cancer. Nature. 476, 346-350 (2011).
- Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (7360), 552-563 (2015).
- Hassanein, M., et al. Preclinical evaluation of 4-[(18)F]fluoroglutamine PET to assess ASCT2 expression in lung cancer. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 18-23 (2016).
- Qu, W., et al. Preparation and characterization of L-[5-11C]-glutamine for metabolic imaging of tumors. Journal of Nuclear Medicine. 53 (1), 98-105 (2012).
- Venneti, S., et al. Glutamine-based PET imaging facilitates enhanced metabolic evaluation of gliomas in vivo. Science Translational Medicine. 7 (274), 217 (2015).
- Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
- Keng, P. Y., et al. Micro-chemical synthesis of molecular probes on an electronic microfluidic device. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (3), 690-695 (2012).
- Lazari, M., et al. ELIXYS - a fully automated, three-reactor high-pressure radiosynthesizer for development and routine production of diverse PET tracers. EJNMMI Research. 3 (1), 52 (2013).
