Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

18F-FDG PET/CT Imaging og kvantitative Histology måle dynamiske endringer i glukose metabolisme i musen modeller av lungekreft

Published: July 21, 2018 doi: 10.3791/57167
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 1, 4, 5, 1
1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, University of California Los Angeles David Geffen School of Medicine, 2University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Molecular and Medical Pharmacology, University of California Los Angeles, 4Andor Technology, 5Division of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles David Geffen School of Medicine

Summary

I denne protokollen beskriver vi hvordan å utnytte [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose fantes et positron utslipp tomografi og beregnede tomografi (18F-FDG PET/CT) imaging for å måle svulst metabolsk respons på målrettet terapi MLN0128 ved en Kras/Lkb1 mutant mus modell av lungekreft og kombinert bildebehandling med høy oppløsning ex vivo autoradiography og kvantitative histology.

Abstract

Et kjennetegn på Avansert tumorer er bytte til aerobic Glykolysen som måles lett av [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose fantes et positron utslipp tomografi (18F-FDG PET) tenkelig. Co mutasjoner i KRAS proto-oncogene og LKB1 tumor suppressor genet er hyppig hendelser i lungekreft som driver hypermetabolic, glycolytic tumor vekst. En kritisk sti regulerer vekst og metabolisme av disse svulstene er mekanistisk målet på rapamycin (mTOR) veien, som kan målrettes effektivt bruker selektiv katalytisk mTOR kinase inhibitors. Den mTOR inhibitor MLN0128 undertrykker Glykolysen i mus med svulster Kras og Lkb1 co mutasjoner, kalles KL mus. Terapi responsen i KL mus måles første 18F-FDG PET og tomografi (CT) imaging før og etter levering av MLN0128. Ved å benytte 18F-FDG PET/CT, kan forskere måle dynamiske endringer i glukose metabolisme genmodifiserte musen modeller (GEMMs) av lungekreft etter en terapeutisk intervensjon med målrettet terapi. Dette etterfølges av ex vivo autoradiography og en kvantitativ immunohistochemical (qIHC) analyse med morphometric programvare. Bruk av qIHC kan oppdage og kvantifisering av forskjellige endringer i biomarkør profiler etter behandling samt karakterisering av klar svulst patologi. Koplingen av PET imaging å kvantitative histology er en effektiv strategi å identifisere metabolske og terapeutiske svar i vivo i musen modeller av sykdom.

Introduction

Vår forskning har fokusert på å undersøke og målretting kreft mutasjoner i leveren kinase B1 (LKB1, også kalt STK11) mutant kreft1. LKB1 er en master tumor suppressor som represses mTOR komplekse 1 (mTORC1) gjennom aktivering av AMP kinase (AMPK) fører til regulering av vekst og metabolisme. Derfor fører tap av LKB1 til en uhemmet mTORC1 aktivisering, aktivering av HIF1-alfa resulterende i en glycolytic metabolske fenotypen ofte referert til som Warburg effekt2,3,4. LKB1 inaktivere mutasjoner fører direkte til utvikling av en sjelden familiær kreft pre fjerning syndrom kjent som Peutz-Jeghers syndrom (PJS) som er preget av utviklingen av godartet gastrointestinal polypper kalles hamartomas5 , 6 , 7. videre LKB1 ofte co mutates med kreftfremkallende KRAS hypermetabolic og aggressiv menneske lunge svulst8,9.

Lkb1-relaterte sykdommer er lett modellert i mus. Den heterozygote inaktivering av Lkb1 i mus fører til utvikling av hamartomas nøyaktig modellering PJS10,11,12,13. I tillegg recapitulate Lkb1 mutasjoner som er lett presist i mus kreft fenotyper i lungene, hud, bukspyttkjertel, og bryst14. Co mutasjon av Kras/Lkb1 i lungevev av transgene mus, med en grobunn recombinase-mediert aktivering av kreftfremkallende KrasG12D allelet og biallelic sletting av Lkb1, resulterer i dannelsen av aggressiv og metastatisk lungekreft svulster15 ,16. Karakterisering av KrasG12D; Lkb1- / - (KL) lunge svulst isolert fra mus viser disse svulstene har en høy mTORC1 aktivisering og er svært glycolytic, bruke både direkte metabolitten målinger av glukose og laktat eller måle forbruket av [18F] -2- fluoro-2-deoxy-D-glukose (18F-FDG) av fantes et positron utslipp tomografi (PET) med beregnede tomografi (CT) 17. MTORC1 hyper-aktivering i LKB1 mutant svulster gir en klar begrunnelse for testing av både allosteric og katalytiske kinase hemmere av mTOR å behandle disse kreft.

I en tidligere studie viste vi at allosteric mTORC1 hemmer rapamycin (RAPA) ble hemmet vekst og Glykolysen i gastrointestinal (GI) svulster med en Lkb1+/- transgene musemodell av PJS3. RAPA er foreløpig godkjent som en enkelt agent terapi for behandling av Nyrecellekarsinom men viste begrenset effekt i NSCLC18,19,20. RAPA er en allosteric mTORC1 inhibitor og kan forbedres ved utvikling av neste generasjons mTOR katalytisk kinase hemmere som leverer en mer nesten komplett hemming av mTOR komplekser 1 og 2 (mTORC1 og mTORC2, henholdsvis)21. Stoffer som MLN0128 evalueres nå i preklinisk studier og tidlige fasen kliniske studier22,23. En fersk studie fra vårt laboratorium vist at MLN0128 er en potent mTOR hemmer menneskelige lunge svulst celle linjer og i vivo KL GEMMs lunge kreft15,16. MLN0128 undertrykt lunge svulst vekst og glukose stoffskiftet i disse mus24.

I denne studien tar vi nytte av godt karakterisert adenoviral grobunn-indusert musen modeller av lungekreft initiert av en betinget aktivert Lox-stopp-Lox-KRASG12D oncogene15,25. Disse KrasG12D mus var korslagt med mus har floxed alleler av Lkb1 (Lkb1L/L) til å generere KrasG12D; Lkb1L/L (KL) mus16. Etter intranasal levering av adeno- eller lentivirus uttrykke grobunn recombinase, utvikle KL musene tidlig lesjoner av 4 uker etter svulst induksjon. 6 uker, tumorer i KL mus endre fra adenomatøse svulster en mer ondartet, aggressiv svulst fenotypen typisk for lunge kreftsvulster, og 8-10 uker utvikle musene frank kreftsvulster med en 100% penetrance16,26.

Begge PET/CT tenkelig og kvantitativ immunohistochemistry kan benyttes for å avgjøre de molekylære og metabolske svarene samt de terapeutiske tiltak i tumorer etter levering av målrettet behandling som MLN012817, 26,27. Beskrevet her er en eksperimentell protokoll som benytter 18F-FDG PET imaging for å måle metabolsk respons på en MLN0128-målrettet terapi. Kopling PET bildebehandling med kvantitative histology kan måling av molekylære svaret mTOR hemming og kvantifisering av svulst byrden og svulst histology.

Protocol

Alle prosedyrene som er beskrevet i protokollen er godkjent av institusjonelle dyr omsorg og bruke committee (IACUC) ved University of California, Los Angeles.

1. 18F-FDG PET og CT Imaging i mus

Advarsel: Bruk verneutstyr ved håndtering av radioaktivitet. Følg alle gjeldende forskriftene ved håndtering av radioaktivitet.

  1. Plass i buret med mus til å avbildes på en varm seng på 37 ° C 1 time før 18F-FDG injeksjon for å redusere brown fett inntak av 18F-FDG.
    Merk: Faste mus for 4-16 h kan redusere myocardial forbruket av 18F-FDG.
  2. Veie musen og spille inn sin vekt.
  3. Bedøve musen bruker 2-3% isoflurane i oksygen på 0,5 - 2 L/min i 2-3 min bruker en bedøvelse kammer holdt på 37 ° C. Sikre at musen har vært anesthetized ved pinching tå; Ingen reaksjon vil være observert Hvis musen har vært anesthetized. Ophthalmica salve gjelde øynene for å hindre eventuelle tørrhet i løpet av bedøvelsen.
  4. Fortynne 18F-FDG (109 min radioaktivt half-life) i sterilt saltvann på en justert forfall-korrigert injeksjon konsentrasjon av 70-75 µCi/100 µL.
    Merk: Følg PET produsenten anbefalte 18F dose for optimal skanner bildebehandling.
  5. Tegne 70-75 µCi med en insulinsprøyte med en 28 G nål, måle radioaktivitet dose med en dose kalibrator og registrere måling og tid. Plass sprøyten i ledelsen sprøyte innehaver.
    Merk: Mengden av 18F-FDG radioaktivitet i hver dose er målt med en dose kalibrator, som er kalibrert mot en standard referansemateriale som cesium-137, ifølge produsentens protokoller. Av lesing er også spilt inn for å fastslå forfall korreksjon.
  6. Stikk distale musen halen og måle musen er blodsukker med en glucosemåler.
  7. Varm halen i 1-2 min med en kompress dynket i varmt vann. Tørk halen med 70% isopropanol å dilate hale venen like før injeksjon. Administrere 100 µL 18F-FDG (hele volumet i sprøyten) med en bolus injeksjon via lateral halen vene og registrere tidspunktet for injeksjon. Måle gjenværende dosen i sprøyten bruker dose kalibrator og registrere måling og tid.
    Merk: Det vil være noen mengden av sonden igjen i sprøyten. Bruk av insulin sprøyter er foretrukket over sprøyter koblet til nåler via Luer låser på grunn av redusert mengden dosen fanget i sprøyten/nålen etter injeksjon har blitt administrert.
  8. Plassere injisert musen i anestesi kammeret holdt under 1,5-2% isoflurane på 37 ° C at sonden å bli distribuert via musen er systemisk sirkulasjon 1t før PET skanningen.
    Merk: Det kan være fordelaktig å annullere blæren før skanningen for å gi en enklere 18F-FDG PET visualisering av tumorer implantert i det lavere flanken av musen.
  9. Etter 1 h, Plasser musen i en tenkelig kammer under nesen-membran isoflurane anestesi og 37 ° C, og sikre dens lemmer på plass med medisinsk bånd i supine posisjon.
  10. Plass tenkelig kammeret i det PET/CT skanneren.
  11. Erverve PET og CT skanner som beskrevet i de PET/CT skanner manuelle28.
    Merk: PET bildene er ervervet for 600 s med en energi vindu av 150-650 keV, rekonstruert med maksimal sannsynlighet forventning maksimering rettelser for Foton demping, detektor normalisering og radioisotop forfall (en XY korreksjon var ikke brukt). CT-bildene er kjøpt i en sammenhengende modus for 50 s bruker en 50 kVp, 200 µA X-ray kilde og en flatskjerm-detektor, og de er rekonstruert ved hjelp av Feldkamp-algoritmen.
  12. Når PET/CT er fullført, Fjern musen fra tenkelig kammeret og la det komme i buret sitt. Dataskjerm musen før den har fullt gjenvunnet bevissthet og kan opprettholde sternal recumbency.
  13. Importere rekonstruert PET/CT-bildene til AMID programvare ved å klikke fil, og Åpneog velge riktig fil.
  14. Konvertere datatypen PET av prosent-injisert dose pr. gram (%ID/g) ved å angi dosen ved injeksjon etter regnskap for eventuelle gjenværende dose igjen i sprøyten eller enheten av standardiserte opptak verdi (SUV) ved i tillegg å angi emnet vekt. For å gjøre dette, høyreklikk på datasettet PET og finne angir feltet %ID/g i kategorien Grunnleggende Info %ID/g registrert tidligere.
  15. Tegn på regioner-of-interessepunkter (ROIs) på svulster og normalt vev (leveren, muskler, lunge, hjerte, hjerne og subkutant fett). Gjør klikk på Rediger, velge Legge til avkastning, velg avkastning figur og navngi Avkastningen. Tegne ROIs over svulster og vev og justere sine dimensjoner for å dekke vev av interesse i alle 3 akser.
    Merk: Kontoen for forskjeller i PET sonde biodistribution mellom dyr, svulst ROI verdier kan videre normaliseres ROI verdiene i leveren, en godt perfused organ med minimal glycolytic aktivitet som representerer 18F-FDG i sirkulasjon. ROI analyser av svulsten og normalt vev utføres på samme musen. Lunge svulst lesjoner identifiseres vanligvis ved 18F-FDG PET siden 18F-FDG oppbevaring i en normal lunge er relativt lav. CT brukes også til å identifisere lesjoner, spesielt lesjoner som 18F-FDG ikke-ivrig. En ex vivo analyse av isolerte lungene bidrar også til å lokalisere svulst lesjoner.

2. 18F-FDG Autoradiography

  1. Forberede musen bildebehandling med 18F-FDG ved å følge trinn 1.1-1.12, bortsett fra nå, fortynnet 18F-FDG i sterilt saltvann i en justert forfall-korrigert injeksjon konsentrasjon av 1000 µCi/200 µL.
    Merk: Høyere doser 18F-FDG brukes for autoradiography å ta hensyn til flere eksempler tid og en optimal oppdagelse av fosfor platene.
  2. Avlive den mus via en dødelig innånding av isoflurane på 5% eller CO2 (en IACUC-godkjent prosedyre).
    Merk: Cervical forvridning bør ikke brukes som dette kan skade lungevev.
  3. PIN mus med ventrale overflaten utsatt og spray den med 70% etanol sammenfiltret håret før innsnitt.
  4. Åpne bryst hulrom ved søknad en midtlinjen snitt, skjære vekk membranen og fjerne brystet veggene. Utsett luftrøret ved å nøye fjerne det salivary kjortelen. Plass bulldog klemmen på luftrøret som nær kjeven som mulig, sikre trangt på luftrøret. Sted en 23 G nål festet til en 3 mL sprøyte i luftrøret under bulldog klemmen og injisere ~ 2 mL av en OCT:PBS (1:1) (Optimal kutte temperatur: fosfat bufret) saltvann.
    Merk: OCT er svært tyktflytende og blandes med PBS å tillate en enklere injeksjon i lungene.
  5. Fjerne nålen fra luftrøret og bruke tang for å klemme på injeksjon poeng å hindre alle lekkasje av OCT:PBS løsningen.
  6. Nøye fjerne lungene fra bryst hulrom og skille den venstre lobe fra resten av lungene. Sett det venstre flik i merket cryomold fylt med et par dråper OCT. Når lunge lobe er inne mold, fyll cryomold til toppen med OCT.
  7. Gjenta samme med den høyre halvdelen av lungene.
    Merk: Hvis 18F-FDG signalet i hjertet forventes å bli høy eller lunge svulstene ligger i nærheten, kan det være gunstig å fjerne hjertet for å hindre eventuell tracer lekkasje. Hele lungene kan også bygges inn i en enkelt cryomold. Det er viktig å unngå luftbobler når du arbeider med OCT.
  8. Bruker lang tang, plasseres de forberedt cryomold i lukket ekstruderte polystyren skum beholder som inneholder en blanding av tørris og isopentane.
    Merk: Denne blandingen skal være på ca-70 ° C før du legger til cryomold i det for frysing. Etter herding blir OCT sammensatte hvite. Hvis flere eksempler blir behandlet på samme tid, kan de frosne prøvene i OCT cryomolds lagres midlertidig på tørris.
  9. Fjern den frosne blokken fra cryomold og montere den på en kryostaten snitting. Delen blokken i 4 µm tykkelse ved hjelp av mikrotomen blader (34°/80 mm, høy profil). Overføre delene vev til et glass lysbilde som er lagret i romtemperatur.
  10. Plass prøven lysbildene på en fosfor imaging plate. Plasser platen i kassetten og forsiktig Lukk slik at lysbildene fra skiftende. Lagre kassetten i 20 ° C fryser for plate eksponering, vanligvis over natten.
    NOTE Plater og kassetter nød å bli pre kjølt til-20 ° C før bruk. Plassere eksemplene på-80 ° C er akseptabel også.
  11. Etter eksponering, fjerne lysbildene fra platen og lese plate bilde leseren.
  12. Lysbildene kan innpakket i plastfolie og lagret på-80 ° C, eller de kan være forberedt på hematoxylin & eosin flekker eller immunohistochemistry.

3. høsting lungevev for Histology

  1. Fremgangsmåten 2.2-2.4, bortsett fra nå, istedet for benytter det OCT:PBS løsningen, injisere 2-3 mL 10% normal bufrede formalin fikse lungene.
  2. Fjerne nålen fra luftrøret og bruke tang for å klemme på injeksjon poeng å hindre alle lekkasje av formalin. Nøye fjerne lungene fra bryst hulrom og plassere dem i en 50 mL konisk rør som inneholder ~ 20 mL 10% normal bufrede formalin 16-24 h å sikre en komplett fiksering.
    Merk: Fikse lungene tillater bevaring av optimal anatomiske funksjonene.
  3. Neste dag, overføre fast lungene fra formalin til 70% etanol og forberede lungene å bli plassert i en vev kassett.
  4. Forberede lungene histology ved nøye dissekere lobes med saks til å kutte på grenen points mellom 5 fliker, nummerert 1-5 som vist i figur 1D, og plassere dem i en ikke-overlappende orientering i vev kassetten. Plass en skum pute forsiktig på lungevev å holde retningen intakt.
  5. Lagre dissekert lunge lobes i 70% etanol før parafinen innebygging.
  6. Parafin-bygge vevet i kassetter og skjær 4 µm tykke snitt for farging, bruker standard prosedyrer.

4. vev segmentering og kvantifisering bruker kommersiell programvare

  1. Bilde hematoxylin og eosin (H & E) farget lunge deler en 1,25 X forstørrelse med en kommersiell multispectral tenkelig system.
  2. Konvertere bilder til digitalt bilde kuber og laste (Klikk på fil, og deretter laste Spectralbiblioteket) forhåndslagde spectral biblioteker for t & E.
    Merk: Spectral bibliotekene utviklet på forhånd ved å kjøpe spectral bilder fra enkeltvis farget lunge deler, én inndeling bare med eosin og andre bare farget med hematoxylin, som er lagret i en åpen kildekode proprietær spectral bibliotek filen (.csl). Tenkelig systemet har operativsystemprogramvare som kjøper et bilde på hver bølgelengde som kreves (som definert av oppkjøpet protokollen). Bildene ("bilde-kube") er lagret i et åpen kildekode proprietær multispectral-filformat (.im3). Spectra er utdraget fra bildet kuben ved hjelp av morphometric programvare og lagret i eget spectral bibliotekfiler.
  3. Spectrally unmix pseudo farget H & E bilder av hele lungene ved å klikke på knappen Unmix .
    Merk: Unmixing tar mindre enn 1 s. Antall piksler i hver vev type kvantifisert ved hjelp av morphometric analyseprogramvare.
  4. Visualisere hver bilde kube ved å konvertere multispectral dataene inn i tilsvarende 3 farger (rød, grønn og blå) bildet ved hjelp av øyets bølgelengde-avhengige farge svar convolved med intensiteten av hvert bilde.
    Merk: 3 bildene vises som standard 24-biters farge.
  5. Pseudo farge hver ublandet bilde av skalere bildet i en bruker-valgt farge (f.eksrød, grønn, lilla, etc.) og legge det sammen med andre pseudo farget ublandet bildene til en standard 24-biters fargebilde.
  6. Bruk standardinnstillingene for alle analyser.
    Merk: Generelt, siden denne typen segmentering er avhengig av en visuell vurdering av resultatene (dvs., en vurdering av hvor godt segmentering på bildene utenfor trening sette works), er det viktig å riktig dele bildene i opplæring, test, og validering sett.
  7. Starte med 2-3 bilder som en opplæring (10-15 for menneskelig biopsi prøver), tog på dem før resultatene ser bra ut, og bruk deretter at algoritmen til en 2-3 bilder. Bruk deretter den resulterende algoritmen til full validering sett.
    Merk: Sannsynligvis noen omskolering vil være nødvendig.
  8. Analysere svulst området i hele lunge inndelinger ved å beregne det totale antallet bildepunkter for rød pseudo farget tumorer i fliker 1-5 for hver mus.
    Merk: Normalt vev var pseudo farget grønn og blood/blod fartøy var pseudo farget rosa som vist i Figur 3. Mener svulst byrden for hver behandling ble beregnet ved å måle det totale antallet bildepunkter for hver musen i behandling gruppen.

Representative Results

18 F-FDG PET bildebehandling ble utført på KL mus og viste at tumorer i disse musene var svært glycolytic som vist av en forhøyet 18F-FDG forbruk (figur 1A), enige med tidligere publiserte undersøkelser26, 29. En fjerning av hele lungene avsløre tilstedeværelsen av flere svulster (figur 1B). Musen lungene kan deles opp i 5 separat lobes tallene 1 c og 1 D. Lobes 1-5 var merket på appa lungene som var farget med H & E eller glukose transporter 1 (Glut1) (figur 1D). Glut1 er en primær transporter både glukose og 18F-FDG og uttrykket lokaliseringen å plasma membranen av kreftceller korrelerer direkte med 18F-FDG SUV29. En høyere oppløsning analyse av Glut1 flekker (40 X) i 18F-FDG-avid lunge svulst viser en forhøyet uttrykk og lokalisering av transporter på plasma membranen (figur 1D).

På grunn av begrenset oppløsning av PET imaging, både PET/CT og vev autoradiography ble utført. Høyere oppløsning av autoradiography kan identifisere mindre svulster og/eller heterogenitet svulst 18F-FDG distribusjon. Etter den svulst induksjon, ble 18F-FDG PET/CT imaging utført på KL mus (figur 2A) etterfulgt av autoradiography på lungene isolert fra disse musene (tall 2B og 2 C). Som sett i tallene 2B og 2 C, identifisert autoradiography to flere mindre svulster som var positive 18F-FDG ennå ikke var synlig av polyetylen. Etter autoradiography, lysbildene med vev kan også brukes til immunohistochemical (IHC) farging av biomarker(s). H & E flekker for svulstene bekreftet tilstedeværelse av svulster i venstre flik (figur 2D).

Neste, 18F-FDG PET imaging ble utført på MLN0128-behandlet KrasG12D; Lkb1- / - mus for å utnytte 18F-FDG som en funksjonell biomarkør av glukose metabolisme i lunge svulster (Figur 3). Vi identifisert som en behandling med MLN0128 robust hemmet av mTORC1 signalering og Glykolysen som vist av et redusert 18F-FDG forbruk (tall 3A og 3B). Disse resultatene er enig med prekliniske studier vurdere MLN0128 i KL mus som tidligere utgitt av vårt laboratorium17,27. Til slutt, IHC flekker ble utført på tumorer (Figur 3C). Svulster var farget enten H & E eller antistoffer mot phospho-S6, som er en bevart substrat av mTORC1 og brukes til å angi en mTORC1 aktivering (P-S6) vs inaktivering (S6). Figur 3 En robust hemming av P-S6 av MLN0128 viser i KL svulster sammenlignet med de behandlet med et kjøretøy, som er enig med tidligere publiserte arbeider17. I tillegg til KRAS støtter kreftfremkallende drivere som epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) glycolytic stoffskiftet i lunge svulst også. Derfor testet vi om hemming av constitutively aktive mutant EGFR med erlotinib undertrykt 18F-FDG stoffskiftet i musen xenografts. Tallene 3D og 3E viser at menneskelige lunge svulst linjen HCC827, som en EGFR del19 mutasjon, viste et betydelig redusert 18F-FDG forbruk etter fem dager med erlotinib behandling.

Endelig var morphometric vev analyse utført på inndelte lungene og lunge svulst å kvantifisere totale svulst byrden også for å skille svulst patologi som inkludert vev undertypen, nekrose, blodkar fra normal lungevev og luftrommet. KL GEMMs utviklet en kompleks og patologisk heterogene sykdom som ble presentert med lunge svulst av varierende histopathologies. Disse inkluderer adenocarcinomas (ADC) og squamous celle kreftsvulster (SCC)-denne heterogene gjør behandling av denne kreft en formidabel utfordring. Figur 4 En viser en enkelt H & E farget lunge flik med to store svulster stede. Høyere forstørrelse bilder vist i Figur 4B identifisere en normal lunge, fartøyer, og luftrom og tumor nekrose samt adenocarcinoma, preget av en veldefinert papillary struktur og en squamous celle carcinoma. Figur 4 C representerer pseudo farging av lunge lobe og tumor bruker informere morphometric programvare. Figur 4 D viser prosentandelene av normal lunge, fartøy og individuell patologi som tumor nekrose og svulst undertypene som segmentert Reproduksjonsvinduet adenocarcinoma fra squamous celle carcinoma.

Figure 1
Figur 1 : Metabolically aktiv KrasG12D; Lkb1- / - (KL) mutant lunge svulst er 18F-FDG positiv og uttrykke høye nivåer av glukose transporter 1 (Glut1). Paneler A og B viser en maksimal intensitet projeksjon [også referert til som en 3-dimensjonale (3D) bilde] 18F-FDG-PET og CT analyse på noen FDG-avid KL mus skjuler squamous lunge svulst. Vist er (A) en 3D rekonstruksjon og (B) tverrgående, sagittal og koronale utsikt over lunge tumor(s) (T). (C) dette panelet viser en hel lunge histology KL museklikk avbildet i paneler A og B, enten farget for H & E (toppanelet) eller med et antistoff bestemt for Glut1 (nedre panelet). Lunge lobes er nummerert. Baren skala = 2 mm. (D) dette diagrammet representerer retning og antall lobes i mus (topp panel) og høyere oppløsning 40 X bilder av H & E - eller Glut1-farget tumorer fra lysbildene vises i panelet C H & E (midten panel) eller beiset med et antistoff bestemt for Glut1 (nedre panelet). Baren skala = 25 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: 18 F-FDG autoradiography kan identifisere små svulster som metabolically aktiv. (A) denne 18F-FDG PET/CT bildet viser 18F-FDG-avid svulster i KL musen vises som maksimalt intensitet projeksjon. T1 og T2 = svulster, H = hjertet, B = blæren, K = nyrene. (B) dette panelet viser ex vivo autoradiography føljetong deler av høyre og venstre lunge lobes av musen. Lungene i venstre og høyre panelene er identiske. Lungene i venstre panelene er pseudo farget orange. Lungene i høyre panelene er farget i svart-hvitt. Tumorer (T1, T2 og T3) angis med piler. (C) er en forstørret visning av autoradiography pseudocolored oransje (topp panel) og svart-hvitt (nedre panelet). (D) dette panelet viser den H & E flekker av den øverste del av den venstre lobe vises i panelet B. Baren skala = 200 µm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 3
Figur 3 : Den mTOR inhibitor MLN0128 undertrykker glukose forbruk i lunge svulst KL mus som oppdages av 18F-FDG kjæledyr (A) dette panelet viser representant 18F-FDG PET/CT-bilder av KL mus behandlet med et kjøretøy (18F-FDG ivrig, venstre) eller MLN0128 (18F-FDG ikke-ivrig, høyre). Tverrgående (topp panel), Koronal (midten panel) og sagittal (nedre panel) visninger vises. Svulstene markeres med røde linjer; H = hjertet, L = leveren. (B) dette panelet viser en kvantifisering av SUVmax (%ID/g) mellom kjøretøy og MLN0128-behandlet tumorer. (C) dette panelet viser den H & E og P-S6 flekker av hele lunge deler fra KL mus behandlet med kjøretøy eller MLN0128. Baren skala = 25 µm. (D) dette panelet viser representant 18F-FDG-PET og CT-bilder av HCC827 EGFR (del19) xenografts pre og post-erlotinib behandling. Svulsten (T) er angitt med en pil, K = nyrene B = hjernen. (E) dette panelet viser en kvantifisering av SUVmax (%ID/g) for HCC827 xenografts før og etter erlotinib behandling. n = 10 svulster/gruppe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Svulst byrden og svulst histology er kvantifisert morphometric programmvre.
(A) dette panelet viser den H & E flekker av en enkelt musen lunge flik med en svulst samlet fra KL mus. (B) disse høyere oppløsning viser squamous celle carcinoma (øverst til venstre), normale lungene, fartøyene, og luften plassen (øverst til høyre), og godt differensiert papillary adenocarcinoma (nederst til venstre) og nekrose (nederst til høyre). (C) dette panelet viser pseudocoloring av H & E-farget lunge flik med morphometric programvare. (D) dette panelet vises prosentverdiene for individuelle lungene lobe og tumor patologi målt ved informere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne artikkelen beskrives et imaging eksperimentelle tilnærming som utnyttet 18F-FDG PET/CT bildebehandling med qIHC for å måle både på metabolske og molekylære svarene i lunge svulst etter levering av mTOR hemmer MLN0128. MLN0128 redusert effektivt de 18F-FDG forbruk, som indikerer en betydelig metabolic respons i tumorer. Ved å koble PET/CT imaging til immunohistochemistry, kunne vi romlig registrere inndelte svulster på 3D PET/CT-bildene og utføre en detaljert undersøkelse av hele svulster på mobilnettet og molekylære nivå. Dette gjorde det mulig å bekrefte at MLN0128 hemmet mTOR signalnettverk, som dermed bekrefter en på målet molekylær svar på stoffet i tumorer. Endelig, ved hjelp av kvantitative histology, kunne vi kart og separat klar svulst patologi, som samlet svulst masse fra tumor nekrose, definere adenocarcinoma fra squamous celle kreftsvulster og utfylle microPET bildebehandling.

MicroPET er for tiden begrenset av en romlig oppløsning på ca 1 mm. I tillegg kan 18F-FDG oppbevaring i visse vev påvirkes av flere faktorer, inkludert plasma glukose nivåer, type og varighet av bedøvende eksponering, miljømessige temperaturen og den generelle helsen til dyr, som kan påvirke 18 F-FDG farmakokinetikken30. Disse parameterne er optimalisert for denne protokollen, men skal være optimalisert for hver dyremodell. Reproduserbarhet studier av 18F-FDG bildebehandling av subkutan svulster i mus demonstrere en variasjonskoeffisienten for det betyr %ID/g om lag 15%, antyder at svulsten terapeutiske responsen på en enkelt mus vurdert av 18 F-FDG PET bør være større enn denne terskelen vurderes pålitelig og betydelig31.

Cellulære og selv subcellular distribusjon av PET tracers kan vurderes av vev autoradiography med delene senere farget og co registrert med qIHC. Co registrering PET med CT kan en PET bildet settes i anatomiske sammenheng; Dette er svært verdifull, selv med lav bløtvev kontrast. Mangel på bløtvev kontrast ved CT kan overvinnes med magnetisk resonans imaging (MRI). I tillegg biomarkers for fluorescens bildebehandling kan brukes til å vurdere Glykolysen i vivo, men Foton absorpsjon og scatter i lunge hulrom kan påvirke den nøyaktige kvantifisering eller deteksjon følsomhet32. I sammendraget gir utnytte hele dyr PET/CT-bildebehandling med kvantitative histology en nøyaktig og sanntids kart over svulst biologi etter terapeutisk intervensjon.

Multispectral imaging (MSI) er gjeldende i en situasjon hvor et fargebilde kan brukes. I det minste, MSI gir samme informasjon som et fargebilde, og for enkelte programmer, MSI kan gi mer detaljert informasjon om spektrale egenskapene til et utvalg enn en enkel bredbånd tre farger (RGB) bilde. Begrensningene for MSI er generelt de farge Imaging, bortsett fra at MSI er tregere og tar mer tid å hente bilder. Morphometric programvaren ble brukt til å få reproduserbare, nøyaktig segmentering resultater for bilder og er beskrevet i Tabellen for materiale. Det er flere kommersielt tilgjengelige produkter som kan brukes til vev segmentering og kvantifisering av histology.

Kompleksiteten i kreft metabolisme strekker seg utover Warburg effekt og glukose metabolisme33,34. Det er svært sannsynlig at svulster vil lett tilpasse seg enkelt agent behandlinger som hemmer Glykolysen. Avhengigheten av aminosyre metabolisme har vært godt dokumentert i kreft, og det forventes at svulster stole på en rekke amino acids som glutamin, glysin, og serine, samt andre metabolitter som frie fettsyrer35,36, 37. I tillegg til 18F-FDG har sonder som 18F - og 11C-merket glutamin, kolin, acetate, 1-(2-Deoxy-2-fluoroarabinofuranosyl) cytosine (FAC) og fluorothymidine (FLT) blitt brukt til bildet aminosyre, nukleotid og lipid stoffskiftet i dyr modeller av kreft38,39,40,41. Automation og Mikroskala tracer radiochemistry teknologi kombinert med høyere oppløsning, høyere følsomhet PET skannere vil forbedre tilgjengeligheten av PET for å måle ulike biologiske prosedyrer42,43. Forståelsen av stoffskiftet øker er det logisk at repertoaret av PET radiotracers vil øke også, slik at forskere og leger til noninvasively profil svulst metabolisme.

Utnyttelsen av PET/CT tenkelig og kvantitativ histology løser et klinisk behov, som er å raskt oversette benk funn i klinisk bruk. Dette må forskere kunne måle terapeutiske svaret samt ervervet motstanden mot narkotika, som PET/CT imaging gjør. Dessuten, PET/CT og immunohistochemical analyse av lunge svulst brukes som standarden på omsorg for pasienter, og dermed er direkte oversettbare i klinisk praksis. Viktigere, identifiserer PET/CT imaging lett terapi-resistente svulster, der forskere kan isolere og avhøre på molekylært nivå for å bedre forstå mekanismene av sykdom. Dette er en iterativ prosess som har gjort det mulig å forstå mekanismene motstand og utforme mer effektive strategier for klinisk oversettelsen.

Disclosures

Kevin P. Francis er ansatt i Perkin Elmer. James Mansfield er offentlig aksjonær i PerkinElmer, Inc (PKI) aksjer på NASDAQ. Forfatterne ikke har noe annet å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker University of California Los Angeles' Crump Preclinical Imaging teknologi Center for deres hjelp med PET/CT avbilding av musene, translasjonsforskning patologi Core laboratorie- og statistikk kjernen ved University of California Los Angeles' David Geffen School of Medicine for deres hjelp med svulst eksempel forberedelse og analyse. For finansiering, David B. Shackelford ble støttet av CTSI og KL2 translasjonsforskning Science Award gi nummer KL2TR000122 og UL1TR000124 på David Geffen medisinavdelingen ved UCLA og av den avdeling av forsvarer lunge kreft forskning Program translasjonsforskning Forskning samarbeid W81XWH-13-1-0459 og ACS RSG-16-234-01-TBG. Sean T. Bailey ble støttet av en NIH T32 trening stipend HL072752 gjennom David Geffen medisinavdelingen ved UCLA. Anthony Jones støttes av UCLA svulst celle biologi treningsprogrammet (USHHS Ruth L. Kirschstein institusjonelle National Research Service Award # T32 CA009056). Gihad Abdelhady støttes av en NIH/NCI mangfold Supplement R01CA208642.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
G8 PET/CT Perkin Elmer CLS139564 Used for 18F-FDG PET and CT imaging of mice
Axio Imager.M2 Zeiss 490020-0003-000 Acquiring images of FFPE lung tumor sections
Inform software Perkin Elmer CLS135781 Morphometric used for image analysis of tumor pathologies
Glut1 antibody Alpha Diagnostics GT12-A IHC staining of FFPE lung tumor sections
Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP™ Rabbit mAb Cell Signaling Technologies 4858 IHC staining of FFPE lung tumor sections
MX35 Premier microtome blades  Thermo Fisher Scientific 3051835 Microtome blades for sectioning tissue for autoradiography

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shackelford, D. B., Shaw, R. J. The LKB1-AMPK pathway: metabolism and growth control in tumour suppression. Nature Reviews Cancer. 9 (8), 563-575 (2009).
  2. Shaw, R. J., et al. The LKB1 tumor suppressor negatively regulates mTOR signaling. Cancer Cell. 6 (1), 91-99 (2004).
  3. Shackelford, D. B., et al. mTOR and HIF-1alpha-mediated tumor metabolism in an LKB1 mouse model of Peutz-Jeghers syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11137-11142 (2009).
  4. Faubert, B., et al. Loss of the tumor suppressor LKB1 promotes metabolic reprogramming of cancer cells via HIF-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2554-2559 (2014).
  5. Hemminki, A. The molecular basis and clinical aspects of Peutz-Jeghers syndrome. Cellular and Molecular Life Sciences. 55, 735-750 (1999).
  6. Hemminki, A., et al. A serine/threonine kinase gene defective in Peutz-Jeghers syndrome. Nature. 391 (6663), 184-187 (1998).
  7. Sanchez-Cespedes, M. A role for LKB1 gene in human cancer beyond the Peutz-Jeghers syndrome. Oncogene. 26 (57), 7825-7832 (2007).
  8. Sanchez-Cespedes, M., et al. Inactivation of LKB1/STK11 is a common event in adenocarcinomas of the lung. Cancer Research. 62 (13), 3659-3662 (2002).
  9. Ding, L., et al. Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma. Nature. 455 (7216), 1069-1075 (2008).
  10. Ylikorkala, A., et al. Vascular abnormalities and deregulation of VEGF in Lkb1-deficient mice. Science. 293 (5533), 1323-1326 (2001).
  11. Bardeesy, N., et al. Loss of the Lkb1 tumour suppressor provokes intestinal polyposis but resistance to transformation. Nature. 419 (6903), 162-167 (2002).
  12. Miyoshi, H., et al. Gastrointestinal hamartomatous polyposis in Lkb1 heterozygous knockout mice. Cancer Research. 62 (8), 2261-2266 (2002).
  13. Jishage, K., et al. Role of Lkb1, the causative gene of Peutz-Jegher's syndrome, in embryogenesis and polyposis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (13), 8903-8908 (2002).
  14. Shackelford, D. B. Unravelling the connection between metabolism and tumorigenesis through studies of the liver kinase B1 tumour suppressor. Journal of Carcinogenesis. 12, 16 (2013).
  15. Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes & Development. 15 (24), 3243-3248 (2001).
  16. Ji, H., et al. LKB1 modulates lung cancer differentiation and metastasis. Nature. 448 (7155), 807-810 (2007).
  17. Momcilovic, M., et al. Heightening energetic stress selectively targets LKB1-deficient non-small cell lung cancers. Cancer Research. 75 (22), 4910-4922 (2015).
  18. Wislez, M., et al. Inhibition of mammalian target of rapamycin reverses alveolar epithelial neoplasia induced by oncogenic K-ras. Cancer Research. 65 (8), 3226-3235 (2005).
  19. Liang, M. C., et al. TSC1 loss synergizes with KRAS activation in lung cancer development in the mouse and confers rapamycin sensitivity. Oncogene. 29 (11), 1588-1597 (2010).
  20. Hudes, G., et al. Temsirolimus, interferon alfa, or both for advanced renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 356 (22), 2271-2281 (2007).
  21. Wander, S. A., Hennessy, B. T., Slingerland, J. M. Next-generation mTOR inhibitors in clinical oncology: how pathway complexity informs therapeutic strategy. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1231-1241 (2011).
  22. Pourdehnad, M., et al. Myc and mTOR converge on a common node in protein synthesis control that confers synthetic lethality in Myc-driven cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11988-11993 (2013).
  23. Hsieh, A. C., et al. The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis. Nature. 485 (7396), 55-61 (2012).
  24. Momcilovic, M., et al. Heightening energetic stress selectively targets LKB1-deficient non-small cell lung cancers. Cancer Research. 75 (22), 4910-4922 (2015).
  25. Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
  26. Shackelford, D. B., et al. LKB1 inactivation dictates therapeutic response of non-small cell lung cancer to the metabolism drug phenformin. Cancer Cell. 23 (2), 143-158 (2013).
  27. Momcilovic, M., et al. Targeted Inhibition of EGFR and Glutaminase Induces Metabolic Crisis in EGFR Mutant Lung Cancer. Cell Reports. 18 (3), 601-610 (2017).
  28. Preclinical PET Imaging Systems | GA PET/X-ray & G8 PET/CT. Perkin Elmer. , Available from: http://www.perkinelmer.com/preclinical-pet-imaging/index.html (2018).
  29. Goodwin, J., et al. The distinct metabolic phenotype of lung squamous cell carcinoma defines selective vulnerability to glycolytic inhibition. Nature Communications. 8, 15503 (2017).
  30. Fueger, B. J., et al. Impact of animal handling on the results of 18F-FDG PET studies in mice. Journal of Nuclear Medicine. 47 (6), 999-1006 (2006).
  31. Dandekar, M., Tseng, J. R., Gambhir, S. S. Reproducibility of 18F-FDG microPET studies in mouse tumor xenografts. Journal of Nuclear Medicine. 48 (4), 602-607 (2007).
  32. Luker, G. D., Luker, K. E. Optical imaging: current applications and future directions. Journal of Nuclear Medicine. 49 (1), 1-4 (2008).
  33. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324 (5930), 1029-1033 (2009).
  34. Vander Heiden, M. G., DeBerardinis, R. J. Understanding the intersections between metabolism and cancer biology. Cell. 168 (4), 657-669 (2017).
  35. Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
  36. Possemato, R., et al. Functional genomics reveal that the serine synthesis pathway is essential in breast cancer. Nature. 476, 346-350 (2011).
  37. Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (7360), 552-563 (2015).
  38. Hassanein, M., et al. Preclinical evaluation of 4-[(18)F]fluoroglutamine PET to assess ASCT2 expression in lung cancer. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 18-23 (2016).
  39. Qu, W., et al. Preparation and characterization of L-[5-11C]-glutamine for metabolic imaging of tumors. Journal of Nuclear Medicine. 53 (1), 98-105 (2012).
  40. Venneti, S., et al. Glutamine-based PET imaging facilitates enhanced metabolic evaluation of gliomas in vivo. Science Translational Medicine. 7 (274), 217 (2015).
  41. Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
  42. Keng, P. Y., et al. Micro-chemical synthesis of molecular probes on an electronic microfluidic device. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (3), 690-695 (2012).
  43. Lazari, M., et al. ELIXYS - a fully automated, three-reactor high-pressure radiosynthesizer for development and routine production of diverse PET tracers. EJNMMI Research. 3 (1), 52 (2013).

Tags

Kreftforskning problemet 137 18F-FDG PET bildebehandling lungekreft Glykolysen LKB1 KRAS mTOR
<sup>18</sup>F-FDG PET/CT Imaging og kvantitative Histology måle dynamiske endringer i glukose metabolisme i musen modeller av lungekreft
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Momcilovic, M., Bailey, S. T., Lee,… More

Momcilovic, M., Bailey, S. T., Lee, J. T., Zamilpa, C., Jones, A., Abdelhady, G., Mansfield, J., Francis, K. P., Shackelford, D. B. Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer. J. Vis. Exp. (137), e57167, doi:10.3791/57167 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter