Summary
В этом протоколе мы опишем, как использовать [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose позитронно-эмиссионная томография и компьютерная томография (18F-ФДГ-ПЭТ/КТ) изображений для измерения опухоли метаболический ответ для целенаправленной терапии MLN0128 в Крас/Lkb1 мутант мыши модель рака легких и спаренных изображений с высоким разрешением ex vivo авторадиографии и количественных гистологии.
Abstract
Отличительной чертой современных опухолей является переход к аэробного гликолиза, который легко измеряется [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose позитронно-эмиссионная томография (18F-ФДГ-ПЭТ) изображений. Совместное мутации в LKB1 ген-супрессор опухолевого и КАРСТЕ протоонкоген являются частые события в рак легких, которые привод hypermetabolic, гликолитических опухолевого роста. Критический путь регулирования роста и метаболизма этих опухолей является механистический цель rapamycin (mTOR) путь, который можно эффективно пристрелть с помощью селективного каталитического mTOR ингибитора киназы. MTOR ингибитор MLN0128 подавляет гликолиза в мышей, принимая опухоли с Lkb1 и карсте совместно мутации, именуемые KL мышей. Терапии реакции в KL мышей сначала измеряется 18F-ФДГ-ПЭТ и компьютерная томография (КТ) изображений до и после родов MLN0128. Используя 18F-ФДГ-ПЭТ/КТ, исследователи имеют возможность измерять динамические изменения в метаболизме глюкозы в генетически модифицированные мыши модели (GEMMs) после терапевтического вмешательства с целевой терапии рака легких. Это сопровождается ex vivo авторадиографии и анализа количественных иммуногистохимический (qIHC), с помощью морфометрического программного обеспечения. Использование qIHC позволяет обнаружения и количественного определения различных изменений в профилях биомаркер после лечения, а также характеристика опухоли различных патологий. Муфта PET изображений для количественных гистология является эффективной стратегией для выявления метаболических и терапевтические реакции в естественных условиях в моделях мыши заболеваний.
Introduction
Наши исследования были направлены на расследование и ориентации рака с мутациями в печени киназы B1 (LKB1, также упоминается как STK11) мутант рака1. LKB1 является основной опухоли, подавляет mTOR комплекс 1 (mTORC1) через активацию киназа AMP (AMPK) приводит к регуляции роста и метаболизма. Таким образом потери LKB1 приводит к необузданный mTORC1, активация результирующей HIF1-альфа в гликолитических метаболического фенотипа, обычно называют Варбург эффект2,3,4. LKB1 инактивирующего мутации непосредственно приводят к развитию синдрома редкой формой рака семейная предрасположенность, известна как синдром Пейтца-Турена, поэтому (PJS), которая характеризуется развитием полипов доброкачественные желудочно-кишечного тракта, известный как гамартомы5 , 6 , 7. Кроме того, LKB1 часто совместно мутирует с онкогенных крас, что приводит к hypermetabolic и агрессивных легкое человека опухоли8,9.
Заболеваний, связанных с Lkb1 легко моделируются в мышах. Гетерозиготных инактивирование Lkb1 в мышах приводит к развитию гамартомы точно моделирования PJS10,11,12,13. Кроме того Lkb1 мутации, которые легко моделируются в мышей, точно охарактеризовать фенотипу рака легких, кожи, поджелудочной железы и груди14. Совместное мутация крас/Lkb1 в легочной ткани трансгенных мышей, используя Cre рекомбиназа опосредованной активации онкогенных красG12D аллели и biallelic исключить Lkb1, приводит к образованию опухолей легких агрессивным и метастатическим15 ,16. Характеристика красG12D; Lkb1- / - опухоли легких (KL), изолированных от мышей показывает, эти опухоли имеют высокий mTORC1 активации и высоко гликолитических, используя обе прямые метаболит измерения глюкозы и лактата или измерения потребления [18F] -2- Фтор-2-deoxy-D-глюкоза (18F-ФДГ), позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) с компьютерная томография (КТ) 17. MTORC1 гипер активации в LKB1 мутант опухоли обеспечивает четкое обоснование для тестирования как аллостерический и каталитического киназы ингибиторов mTOR для лечения этих видов рака.
В предыдущем исследовании мы продемонстрировали, что аллостерический mTORC1 ингибитор rapamycin (рапа) успешно препятствует росту и гликолиз опухоли желудочно-кишечного (GI), с использованием Lkb1+ / трансгенные мыши модели PJS3. Рапа в настоящее время утверждена в качестве единого агента терапии для лечения почечно-клеточной карциномы но показал ограниченной эффективности в НМРЛ18,19,20. Рапа является ингибитором аллостерический mTORC1 и могут быть улучшены путем развития ингибитора киназы каталитического mTOR следующего поколения, которые обеспечивают более почти полном торможении mTOR комплексов, 1 и 2 (mTORC1 и mTORC2, соответственно)21. Наркотики, такие как MLN0128 в настоящее время оцениваются в доклинических исследований и ранней стадии клинических испытаний22,23. Недавнее исследование от нашей лаборатории показали, что MLN0128 является мощным mTOR ингибитора в легкое человека опухоли клеточных линий и в естественных условиях в KL GEMMs легких Рак15,16. MLN0128 подавлены опухоли легких роста и глюкозы обменные процессы в этих мышей24.
В этом исследовании мы воспользоваться хорошо изученных аденовирусных Cre индуцированной мыши модели рака легких, инициированных условно активированные Lox-стоп-Lox-красG12D онкогена15,25. Эти красG12D мышей были скрещены с мышами, имея floxed аллели Lkb1 (Lkb1L/L) для создания красG12D; Lkb1L/L (KL) мышах16. После интраназального доставки адено - или человека, выражая рекомбиназа Cre KL мышей разработать ранних поражений по индукции опухоли после 4 недель. 6 недель, опухоли в KL мышей переход от аденоматозный опухоли более злокачественной, агрессивные опухоли фенотип типичной карциномы лёгких и 8-10 недель мышей развивать откровенный карциномы с 100% пенетрантностью16,26.
Обе ПЭТ/КТ изображений и количественные иммуногистохимия могут быть использованы для определения молекулярной и метаболических реакций, а также терапевтического ответы в опухоли после доставки целевых терапии, такие как, MLN012817 26,27. Описанные здесь экспериментальный протокол, который использует 18F-ФДГ-ПЭТ изображений для измерения метаболический ответ на MLN0128-целевой терапии. Муфта PET изображений с количественным гистология позволяет измерения молекулярной реакции на mTOR торможение, а также количественная оценка бремени опухоли и опухоли Гистологическая картина.
Protocol
Все процедуры, описанные в протоколе были одобрены институционального ухода за животными и использовать Комитет (IACUC) в университете Калифорнии, Лос-Анджелес.
1. 18F-ФДГ-ПЭТ и КТ визуализации в мышей
Предупреждение: Используйте защитное снаряжение при обработке радиоактивности. Выполните все применимые нормативные процедуры, при обработке радиоактивности.
- Место клетка с мышей, чтобы быть imaged на теплой постели при 37 ° C 1 h до 18F-ФДГ инъекции для снижения потребления бурого жира 18F-ФДГ.
Примечание: Пост мышей для 4-16 h может помочь уменьшить миокарда потребление 18F-ФДГ. - Весят мыши и записывать его вес.
- Анестезировать мыши, с помощью изофлюрановая 2-3% в кислороде на 0,5 - 2 Л/мин на 2-3 мин, с использованием анестезии палата хранится при температуре 37 ° C. Убедитесь, что мышь была наркоз, защемления ног; реакции не будет отмечено, если мышь была наркозом. Применить глазной мази в глаза, чтобы предотвратить любой сухости во время анестезии.
- Разбавьте 18F-FDG (109 мин радиоактивное полувыведение) в стерильного физиологического раствора на скорректированные распада исправлены инъекции концентрации 70-75 Μки/100 мкл.
Примечание: Последующие дозы рекомендуется 18F PET сканер производителя для оптимального сканер изображений. - Нарисуйте Μки 70-75 с инсулина шприц с иглой 28 G, измерения дозы радиоактивности, с помощью калибратора дозы и записывать измерения и время. Поместите шприц в держатель шприц свинца.
Примечание: Количество радиоактивности 18F-ФДГ в каждой дозы измеряется с дозы калибратор, который откалиброван против стандартным справочным материалом, например цезия-137, по словам производителя протоколы. Время чтения также записывается для определения кариеса коррекции. - Укол дистального конца хвост мыши и измерения уровня глюкозы в крови мыши с глюкометр.
- Теплый хвоста для 1-2 мин с марлей смоченной в теплой воде. Протрите хвост с 70% изопропиловый спирт для расширения вен хвост только до инъекции. Управлять 100 мкл 18F-FDG (весь объем в шприце) с болюсным инъекции через боковые хвост вен и записывать время инъекции. Измерить оставшиеся дозу в шприц с помощью калибратора дозы и записать измерения и время.
Примечание: Там будет некоторое количество зонд слева в шприц. Использование инсулиновые шприцы предпочтительнее шприцы, подключенных к иглы через Luer блокировки из-за снижение количества захваченных в иглу шприца после ведении инъекций доза. - Поместите курсор мыши введенный в зале анестезии, под изофлюрановая 1,5-2% при 37 ° C разрешить зонд быть распределенными через мышь кровообращения за 1 ч до ПЭТ-сканирование.
Примечание: Это может быть полезно аннулировать мочевого пузыря до начала сканирования позволяет легче 18F-ФДГ-ПЭТ визуализация опухолей, имплантированных в нижних склонах мыши. - Через 1 ч поместите указатель мыши в тепловизионной камере под нос конус изофлюрановая анестезии и при 37 ° C и обеспечить его конечностей, в месте с медицинской лентой в лежачем положении.
- Место тепловизионные камеры в ПЭТ/КТ-сканера.
- Приобрести ПЭТ и КТ сканирования, как описано в PET/CT сканер ручной28.
Примечание: PET изображений приобретаются для 600 s с окном энергии 150-650 кэВ, реконструирован с помощью максимизации ожидания максимального правдоподобия с исправлениями для ФОТОН затухания, детектор нормализации и радиоизотопной распада (точечной коррекции был не применяется). КТ изображения приобретаются в непрерывном режиме для 50 s с использованием 50 kVp, 200 МКА источник рентгеновского излучения и плоских детектор и они восстанавливаются с использованием алгоритма Feldkamp. - После завершения PET/CT, удалите мышь из тепловизионной камеры и позволить ему восстановить в своей клетке. Монитор мыши до тех пор, пока он полностью сознание и может поддерживать грудной recumbency.
- Импортируйте Восстановленный ПЭТ/КТ изображений в Амида программного обеспечения, нажав файл, затем Открытьи выберите соответствующий файл.
- Преобразовать данные Питомца к группе вводили % дозы за грамм (%ID/g), введя дозу во время инъекции, после учета любых остаточных дозу в шприц, или на единицу стоимости стандартизированных поглощения (Внедорожник), дополнительно указав субъекта вес. Чтобы сделать это, щелкните правой кнопкой мыши набор данных PET и найдите поле %ID/g на вкладке Основная информация введите %ID/g Записанная ранее.
- Нарисуйте регионы интерес (ROI) на опухоли и нормальных тканях (печень, мышцы, легких, сердца, мозга и подкожной жировой клетчатки). Чтобы сделать это, нажмите на редактировать, выберите Добавить ROI, выберите ROI форму и назовите ROI. Нарисуйте ROIs опухолей и тканей и корректировать свои размеры для покрытия ткани интерес всех трех осей.
Примечание: Для учета различий в накопление ПЭТ зонда между животными, опухоли ROI значения могут быть далее нормированы ROI значения печени, хорошо перфузии орган с минимальными гликолитических деятельности, представляющих 18F-ФДГ в обращении. Анализ ROI опухолевых и нормальных тканей выполняются на том же мыши. Легкого опухолевые поражения обычно определяются по 18F-ФДГ-ПЭТ с 18F-ФДГ удержания в обычных легких является относительно низким. CT используется также для выявления поражений, особенно поражений, которые являются 18F-ФДГ не жадный. Анализ ex vivo изолированных легких также помогает локализовать опухолевых поражений.
2. 18F-ФДГ авторадиографии
- Подготовьте мышь для изображений с 18F-ФДГ, выполните шаги 1.1-1.12, за исключением теперь, разбавляют 18F-ФДГ в стерильных физиологического раствора в концентрации скорректированные распада исправлены инъекции 1000 Μки/200 мкл.
Примечание: Более высокие дозы 18F-ФДГ используются для авторадиографии для учета дополнительной выборки, обработки время и оптимального обнаружения плитами фосфора. - Усыпить мыши через смертоносных ингаляции изофлюрановая на 5% или CO2 (процедура утверждения IACUC).
Примечание: Шейки матки вывих не должны использоваться как это может повредить легочной ткани. - Поймать мышь с вентральной поверхности и распылить его с 70% этанола для мат вниз свои волосы до разрез.
- Откройте грудной полости, применяя срединной линии разреза, убирания диафрагмы и удаления грудной стенки. Разоблачить трахеи, тщательно удалив слюнной железы. Место бульдог зажим на трахею как близко к челюсти как можно скорее, обеспечивая плотное прилегание на трахею. Место иглой 23 G придает шприц 3 мл внутри трахеи ниже бульдог зажим и придать ~ 2 мл OCT:PBS (1:1) (оптимальное резки температура: фосфат буферизации) физраствора.
Примечание: OCT очень вязкой и смешивается с PBS для легче инъекций в легкие. - Удалите иглу из трахеи и использовать щипцы для зажима на точке впрыска для предотвращения любой утечки OCT:PBS решения.
- Тщательно удалить легкие из грудной полости и отдельные левой доли от остальной части легких. Место левой доли в обозначенные cryomold заполнены с несколькими каплями OCT. После легких доли внутри формы, заполните cryomold на вершину с октября.
- Повторите ту же процедуру с правой половине легких.
Примечание: Если сигнал 18F-ФДГ в сердце, как ожидается, будет высокой или опухоли легких расположены близко к сердцу, она может быть полезной для удаления сердце для того, чтобы предотвратить утечку трассирующими. Кроме того весь легких может быть встроен в один cryomold. Важно избежать воздушных пузырей при работе с Окт. - Использование длинный пинцет, место подготовленные cryomold в контейнере закрытыми порами экструдированного пенополистирола, содержащие смесь сухого льда и изопентана.
Примечание: Эта смесь должна быть в приблизительно-70 ° C до размещения в нем cryomold для замораживания. После закалки, октября соединения станут белыми. Если несколько образцов обрабатываются в то же время, замороженных образцов в OCT cryomolds может временно хранится на сухой лед. - Удаление замороженных блоков из cryomold и смонтировать его на криостат для разрезания. Раздел блока при толщине 4 мкм с использованием микротомных лезвий (34°/80 мм, высокий профиль). Переноса разделов ткани на слайде стекла, который был сохранен при комнатной температуре.
- Поместите образец слайдов на люминофор изображений пластины. Установите пластину в кассету и аккуратно закройте его для предотвращения слайды от ветра. Храните кассеты в морозильной камере-20 ° C для экспозиции пластины, обычно на ночь.
Примечание: Пластинки и кассеты должны быть предварительно охлажденным до-20 ° C перед использованием. Размещение образцов-80 ° c также является приемлемым. - После экспозиции удалите слайды с плиты и читать пластину на изображение читателя.
- Слайды можно завернутый в полиэтиленовую пленку и хранятся при температуре-80 ° C, или они могут быть подготовлены для гематоксилином и эозином или иммуногистохимия.
3. заготовка легочной ткани для гистологии
- Выполните шаги 2.2-2.4, за исключением теперь, вместо того, чтобы с помощью решения OCT:PBS, придать мл 2-3 обычных буферизации формалина 10% исправить легких.
- Удалите иглу из трахеи и использовать щипцы для зажима на точке впрыска для предотвращения любой утечки формалин. Тщательно удалить легкие из грудной полости и поместите их в конической Тюбик 50 мл, содержащие ~ 20 мл 10% нормальной буферизации формалином для 16-24 ч для обеспечения полной фиксации.
Примечание: Крепление легких позволяет для сохранения оптимальной анатомических особенностей. - На следующий день, передача фиксированного легких от формалин на 70% этиловом спирте и подготовить в легкие, чтобы быть помещены в ткани кассету.
- Подготовьте легких для гистологии, тщательно рассекает лопастями, используя ножницы сократить в филиал точках между 5 лопастями, пронумерованы 1-5, как показано на рис. 1Dи поместите их в non перекроя ориентации в ткани кассету. Осторожно поместите пенопластовая прокладка на легочной ткани, чтобы сохранить ориентацию нетронутыми.
- Храните расчлененных легких лопастями в 70% этанол до встраивания парафина.
- Парафин внедрить ткани в кассетах и нарезать 4 µm толщиной секции для окрашивания, с использованием стандартных процедур.
4. ткань сегментации и количественная оценка с использованием коммерческого программного обеспечения
- Изображения гематоксилином и эозином (H & E) окрашенных легких секций на 1,25 кратном увеличении с помощью коммерческого многоспектральных изображений системы.
- Конвертировать изображения в кубики цифровых изображений и загружать готовые спектральной библиотеки (нажмите на файл, а затем загрузить спектральнойбиблиотеки) для H & E.
Примечание: Спектральной библиотеки были разработаны заранее путем приобретения спектральных изображений от поодиночке окрашенных легких секций, одна секция, окрашенных только с эозином и другой только окрашивали гематоксилином, которые были сохранены в несвободных спектральных библиотеке открытым исходным кодом файл (.csl). Система электронного фотографирования имеет операционной программного обеспечения, которое приобретает изображение на каждой длине волны, которая необходима (как определено в протоколе приобретения). Эти изображения («изображение куб») хранятся в формате открытым исходным кодом несвободных многоспектральных файла (.im3). Спектры извлекаются из изображения Куба с помощью морфометрического программного обеспечения и хранятся в файлах отдельных спектральной библиотеки. - Спектрально unmix псевдо-цветные H & E изображения всей легких, нажав на кнопку Unmix .
Примечание: Расслоение занимает менее 1 s. Количество точек в каждом типе ткани были количественно с помощью морфометрического анализа изображений программное обеспечение. - Визуализация каждого изображения Куба путем преобразования данные многоспектральных наблюдений в эквивалентный 3-цвета (красный, зеленый, синий) изображения используя ответ зависит от длины волны цвета глаз, convolved с интенсивностью каждого изображения.
Примечание: Результате 3 изображения отображаются в виде стандартных 24-битный цвет изображения. - Псевдо-цвет каждого несмешанных изображения путем масштабирования изображения в пользователь выбран цвет (например, красный, зеленый, фиолетовый, и т.д.) и добавить, что вместе с псевдо-цветные несмешанных изображений в один из стандартных 24-битный цвет изображения.
- Используйте параметры по умолчанию для всех анализов.
Примечание: В целом, поскольку этот вид сегментации опирается на визуальной оценки результатов (т.е., оценку как хорошо сегментации изображений вне обучения набора работ), важно правильно разделить образы на обучение, испытания и проверки наборы. - Начните с 2-3 изображения как обучающий набор (10-15 для человека биопсия), поезд на тех, кто до тех пор, пока результаты хорошо выглядеть и затем применить этот алгоритм в другой 2-3 изображения. Затем примените итоговый алгоритм для проверки полного набора.
Примечание: Скорее всего, некоторые переподготовки будут необходимы. - Анализировать области опухоли в секции всего легкого, подсчет общей пикселей для красных псевдо-цветные опухоли в долях 1-5 каждой мыши.
Примечание: Нормальные ткани был псевдо-цветной зеленый и крови/судов были псевдо-цветные розовый, как показано на рисунке 3. Средняя опухоли бремя для каждой группе лечения была рассчитана путем измерять количество всего пикселей для каждой мыши в группе лечения.
Representative Results
18 F-ФДГ-ПЭТ томография была выполнена на KL мышей и продемонстрировал, что опухоли в этих мышей были весьма гликолитических, как показано на повышенных 18F-ФДГ потребления (рис. 1А), соглашаясь с ранее опубликованных исследований26, 29. Резекция легких целом показали наличие нескольких опухолей (рис. 1Б). Легкие мыши может быть разделен на 5 отдельных лепестков, представленные цифры 1 c и 1 D. Лепестки 1-5 были помечены на секционного легких, которые были окрашены с H & E или глюкозы транспортер 1 (Glut1) (рис. 1D). Glut1 является основным транспортера глюкозы и 18F-ФДГ и его выражение и локализации на плазматической мембраны опухолевых клеток напрямую коррелирует с 18F-ФДГ внедорожник29. Выше резолюции анализ Glut1 окрашивание (40 X) в 18F-ФДГ алчный опухоли легких показывает повышенных выражение и локализации транспортера на плазматической мембраны (рис. 1D).
Из-за ограниченного разрешения изображений ПЭТ ПЭТ/КТ и ткани авторадиографии были исполнены. Более высокое разрешение авторадиографии может определить небольшие опухоли и/или неоднородность опухоли 18F-ФДГ распределения. После индукции опухоли была проведена 18F-ФДГ-ПЭТ/КТ изображений на KL мышей (рисA) следуют авторадиографии на легких, изолированы от этих мышей (цифры 2B и 2 C). Как видно цифры 2B и 2 C, радиоавтография определены два дополнительных меньше опухоли, которые оказались позитивными на 18F-ФДГ, еще не были легко видны по ПС. После авторадиографии слайды с тканей могут использоваться также для окрашивания иммуногистохимический (IHC) из biomarker(s). H & E пятная для опухоли подтвердили наличие опухоли в левой доле (Рисунок 2D).
Далее была проведена 18F-ФДГ-ПЭТ томография на MLN0128-лечение красG12D; Lkb1- / - мышь для того чтобы использовать 18F-ФДГ как функциональный биомаркеров метаболизма глюкозы в опухоли легких (рис. 3). Мы определили, что лечение с MLN0128 надежно препятствует mTORC1 сигнализации и гликолиза как показано снижение 18F-ФДГ потребления (цифры 3А и 3Б). Эти результаты согласуются с доклинические исследования, оценки MLN0128 в KL мышей как ранее опубликованные в нашей лаборатории17,27. Наконец окрашивание IHC была выполнена на опухоли (рис. 3C). Опухоли были витражи для H & E либо с антителами против фосфо S6, который сохраняется субстрата mTORC1 и используется для обозначения mTORC1 активации (P-S6) vs. инактивация (S6). Рисунок 3 C показывает надежные ингибирование P-S6, MLN0128 в KL опухоли, по сравнению с теми относились с транспортного средства, который соглашается с ранее опубликованной работе17. В дополнение к крас онкогенные драйверы как рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) поддерживают гликолитических метаболизм в опухоли легких, а также. Таким образом мы проверили ли торможение конститутивно активных мутант EGFR с эрлотиниб подавил метаболизм 18F-ФДГ в ксенотрасплантатов мыши. Фигуры 3D и 3E показывают, что легкое человека опухоли линия HCC827, которая затаивает EGFR del19 мутации, показали значительно более 18F-ФДГ потребления после пяти дней лечения эрлотиниб.
И наконец морфометрический анализ ткани была выполнена на секционного легких и опухоли легких для количественного определения всего опухоль бремя также различать опухоли патологий, которые включали ткани подтип, некроз, кровеносных сосудов от нормальной легочной ткани и воздушное пространство. KL GEMMs разработал комплекс и патологически гетерогенных болезнь, которая представлялась с опухолями легких различной наряду. К ним относятся аденокарциномы (ADC) и плоскоклеточный рак (SCC)-Эта разнородность делает лечения этой рака трудноразрешимой проблемой. Рисунок 4 A показывает один лепесток окрашенных легких H & E с двумя большими опухолями настоящего. Выше увеличение изображения, показанный на рисунке 4B определить нормальный легких, судов и воздушное пространство и опухоль некроза, а также аденокарциномы, характеризуется четко определенную структуру папиллярный и плоскоклеточный рак. Рисунок 4 C представляет псевдо-раскраски доли легких и опухоли с помощью морфометрического программного обеспечения Информ. Рисунок 4 D показывает процент нормальных легких, судов и индивидуальных патологий, таких как некроза опухоли и опухоли подтипы сегментированные высокодифференцированных аденокарциномы от плоскоклеточный рак.
Рисунок 1 : Метаболически активные красG12D; Lkb1- / - (KL) мутант легких опухоли являются 18F-ФДГ позитивные и выражают высокий уровень глюкозы транспортер 1 (Glut1). Панелей, A и B Показать максимальной интенсивности проекции [также именуется как 3-мерного изображения (3D)] 18F-ФДГ-ПЭТ и КТ анализа на некоторых мышах FDG-алчный KL, укрывательство опухолей легкого, плоскоклеточный. Изображены (A) 3D-реконструкции и (B) поперечной, сагиттальной и корональные виды легких tumor(s) как (T). (C) Эта группа показывает весь легких гистология мыши KL, отображаемого в панели A и B, либо витражи для H & E (Верхняя панель) или с антитело конкретных для Glut1 (Нижняя панель). Пронумерованы долей легких. В баре шкалы = 2 mm. (D) Эта диаграмма представляет ориентацию и количество долей в мышах (Верхняя панель) и изображения более высокого разрешения 40 X H & E витражное или Glut1 опухолей из слайдов, отображаемые в панели C для H & E (средняя группа) или Витражи с антитело конкретных для Glut1 (Нижняя панель). В баре шкалы = 25 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: 18 F-ФДГ авторадиографии можно определить небольшие опухоли, которые активны метаболически. (A) это 18F-ФДГ-ПЭТ/КТ изображение показывает 18F-ФДГ алчный опухоли в KL мыши, как максимум интенсивности проекция изображения. T1 и T2 = опухоли, H = сердце, B = мочевого пузыря, K = почки. (B) Эта группа показывает авторадиографии ex vivo на последовательных секций правого и левого легкого долей мыши. Легкие в левой и правой панелей являются идентичными. Легкие в левой панели являются псевдо Окрашенные оранжевый. Легкие в правой панели окрашены в черный и белый. Опухоли (T1, T2 и T3) обозначаются стрелками. (C) это увеличенное изображение pseudocolored авторадиографии оранжевый (Верхняя панель) и черно-белые (Нижняя панель). (D) этой группы показывает, H & E окрашивание верхнего среза левой доли, отображаемые в панели B. В баре шкалы = 200 мкм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : MTOR ингибитор MLN0128 подавляет потребление глюкозы в опухоли легких KL мышей, как обнаружено 18F-ФДГ-ПЭТ (A) группа показывает представитель 18F-ФДГ-ПЭТ/КТ изображения KL мышей, получавших с транспортное средство (18F-ФДГ алчный, слева) или MLN0128 (18F-ФДГ не жадный, справа). Поперечный (Верхняя панель), корональных (средняя группа) и сагиттальной (Нижняя панель), показаны просмотров. Опухоли, изложены с красными линиями; H = сердце, L = печени. (B) Эта группа показывает количественную оценку SUVmax (%ID/g) между транспортное средство и MLN0128-лечение опухоли. (C) Эта панель показывает, что H & E и P-S6 окрашивание всей легких секций от KL мышей относился с транспортного средства или MLN0128. В баре шкалы = 25 µm. (D) этой группы показывает представитель 18F-ФДГ-ПЭТ и КТ изображения HCC827 EGFR (del19) ксенотрасплантатов до и пост эрлотиниб лечения. Опухоли (T) обозначается стрелкой, K = почек, B = мозга. (E) Эта группа показывает количественную оценку SUVmax (%ID/g) для HCC827 ксенотрасплантатов до и после лечения эрлотиниб. n = 10 опухоли/группа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Бремя опухоли и опухоли Гистологическая картина количественно с помощью программного обеспечения морфометрические.
(A) этой группы показывает, что H & E пятнать доли легких мыши с опухолью собранные от KL мыши. (B) эти изображения более высокого разрешения показывают плоскоклеточный рак (слева вверху), обычных легких, сосуды и воздушное пространство (справа вверху) и высокодифференцированных сосочковая аденокарцинома (внизу слева) и некроз (внизу справа). (C) Эта группа показывает pseudocoloring H & E-окрашенных легких доли с помощью морфометрического программного обеспечения. (D) группа показывает процентные показатели для отдельных легких доли и опухолевой патологии, измеряется Информ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Этой статье описаны на основе изображений экспериментальный подход, который использован для того чтобы измерить метаболических и молекулярных ответы в опухоли легких после доставки ингибитора mTOR MLN0128 18F-ФДГ-ПЭТ/КТ изображений с qIHC. MLN0128 фактически сократили 18F-ФДГ потребления, указывающее значительный метаболический ответ в опухоли. Связывая ПЭТ/КТ для иммуногистохимии, мы смогли пространственно зарегистрировать секционного опухоли на 3D PET/CT изображения и выполнять детальный анализ всей опухоли на клеточном и молекулярном уровне. Это сделало возможным подтвердить, что MLN0128 ингибирует mTOR сигнализации, подтвердив тем самым на целевой молекулярный ответ наркотиков в опухоли. Наконец воспользовавшись количественных гистологии, мы смогли карта и отдельный собственный опухоли патологий, таких как общая масса опухоли от некроза опухоли, определить аденокарциномы с плоскоклеточный рак и дополнять microPET изображений.
MicroPET в настоящее время ограничено пространственным разрешением около 1 мм. Кроме того, 18F-ФДГ удержания в определенных тканях может зависеть от различных факторов, включая уровень глюкозы в плазме, тип и продолжительность обезболивающее воздействие, температуры окружающей среды и общего состояния здоровья животного, которое может повлиять на 18 F-ФДГ фармакокинетики30. Эти параметры были оптимизированы для настоящего Протокола, но должны быть оптимизированы для каждой модели на животных. Воспроизводимость результатов исследования 18F-ФДГ изображений подкожной опухолей у мышей демонстрируют коэффициент вариации для средней %ID/g приблизительно 15%, предполагая, что опухоль терапевтические реакции отдельных мыши оценены 18 F-ФДГ-ПЭТ должно быть больше, чем этот порог будет считаться надежным и значительных31.
Клеточном и субклеточном даже распределение Трейсеры PET может оцениваться радиоавтографией ткани с разделами впоследствии витражи и зарегистрированных совместно с qIHC. Совместно языковые PET с КТ позволяет образ PET положить в анатомической связи; Это чрезвычайно ценным, даже с низким мягких тканей контраст. Отсутствие контраст мягких тканей, CT могут быть преодолены с магнитно-резонансная томография (МРТ). Кроме того biomarkers для флуоресценции изображений может использоваться для оценки гликолиза в естественных условиях, но Фотон поглощения и рассеяния в полости легких может повлиять на точный количественный или обнаружения чувствительность32. В резюме используя весь животных PET/CT изображений с количественным гистология обеспечивает точную и реальном времени карта биология опухоли после терапевтического вмешательства.
Многоспектральных изображений (MSI) применяется в любой ситуации, где цветного изображения могут быть использованы. По крайней мере MSI предоставляет ту же информацию, цветного изображения, и для некоторых приложений, MSI может предоставить более подробную информацию о спектральных свойств образца, чем простой широкополосный трехцветная (RGB) изображения. В целом ограничения MSI являются те цвета изображений, за исключением того, что MSI медленнее и занимает больше времени для получения изображений. Морфометрические программного обеспечения был использован для получения воспроизводимых, точной сегментации результаты для изображений и описан в Таблице материалов. Есть дополнительные коммерчески доступные продукты, которые могут использоваться для сегментации ткани и количественная оценка гистологии.
Сложность рака метаболизма выходит за рамки Варбург эффект и метаболизм глюкозы33,34. Это весьма вероятно, что опухоли будет легко адаптироваться к лечения одного агента, которые подавляют гликолиза. Зависимость аминокислотного обмена хорошо задокументировано в рак, и ожидается, что опухоли полагаться на целый amino acids глутамин, глицин, и серина, а также других метаболитов, таких как свободные жирные кислоты35,36, 37. В дополнение к 18F-ФДГ зонды, например 18F - и 11помечены C глютамин, холин, ацетат, 1-(2'-Deoxy-2'-fluoroarabinofuranosyl) цитозином (КВС) и fluorothymidine (FLT) успешно использовались для изображения аминокислоты, нуклеотидов и жирового обмена в моделях животных, раком38,,3940,41. Автоматизация и микромасштабной трассирующими радиохимии технологий в сочетании с более высоким разрешением, выше чувствительность ПЭТ сканеров повысит доступность ПЭТ для измерения различных биологических процедур42,43. Как понимания метаболизма возрастает, вполне логично, что репертуар PET radiotracers возрастет также, исследователи и врачи неинвазивно профиль опухоли метаболизма.
Использование ПЭТ/КТ изображений и количественные гистология адреса клинических потребностей, который быстро перевести скамейке открытий на клинического использования. Для этого, исследователи должен иметь возможность точно измерить как терапевтический ответ, так и приобретенной резистентности к препаратам, которые ПЭТ/КТ позволяет. Кроме того, ПЭТ/КТ и Иммуногистохимический анализ опухоли легких используются как стандарт медицинской помощи для пациентов и таким образом, непосредственно переводимые в клиническую практику. Важно отметить, что ПЭТ/КТ легко определяет терапия устойчивостью опухолей, которых исследователи могут изолировать и допросить на молекулярном уровне, с тем чтобы лучше понять механизмы заболеваний. Это итеративный процесс, что позволило лучше понять механизмы сопротивления и разрабатывать более эффективные терапевтические стратегии для клинических перевода.
Disclosures
Кевин P. Фрэнсис является сотрудником Perkin Elmer. Джеймс Mansfield является общественный акционер Перкинэлмер, Inc (PKI) акций на NASDAQ. Авторы имеют ничего, чтобы раскрыть.
Acknowledgments
Мы благодарим университете California Лос-Анджелеса Крамп доклинических Imaging технологии центра за их помощь с ПЭТ/КТ мышей, поступательные лаборатории патологии Core и Core статистики в Калифорнийском университете Лос-Анджелеса Дэвид Геффен школа медицины за их помощь с опухоли пробоподготовки и анализа. Для финансирования, Дэвид б. Shackelford была поддержана CTSI и КЛ2 поступательного науки за Грант KL2TR000122 и UL1TR000124 в Дэвид Геффен школе медицины в Калифорнийском университете и в Департамент из обороны легких Рак исследований программы переводчика Исследования, партнерство W81XWH-13-1-0459 и ACS RSG-16-234-01-ГТД. Шон т. Бейли был поддержан NIH T32 обучения Грант HL072752 через Дэвид Геффен школы медицины в Лос-Анджелесе. Энтони Джонс поддерживается программы обучения биологии Калифорнийского университета опухолевых клеток (USHHS Рут л Kirschstein институциональных национальной исследовательской службы премии # T32 CA009056). Джихад Абдельхади поддерживается NIH/NCI разнообразия дополнение R01CA208642.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| G8 PET/CT | Perkin Elmer | CLS139564 | Used for 18F-FDG PET and CT imaging of mice |
| Axio Imager.M2 | Zeiss | 490020-0003-000 | Acquiring images of FFPE lung tumor sections |
| Inform software | Perkin Elmer | CLS135781 | Morphometric used for image analysis of tumor pathologies |
| Glut1 antibody | Alpha Diagnostics | GT12-A | IHC staining of FFPE lung tumor sections |
| Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP™ Rabbit mAb | Cell Signaling Technologies | 4858 | IHC staining of FFPE lung tumor sections |
| MX35 Premier microtome blades | Thermo Fisher Scientific | 3051835 | Microtome blades for sectioning tissue for autoradiography |
References
- Shackelford, D. B., Shaw, R. J. The LKB1-AMPK pathway: metabolism and growth control in tumour suppression. Nature Reviews Cancer. 9 (8), 563-575 (2009).
- Shaw, R. J., et al. The LKB1 tumor suppressor negatively regulates mTOR signaling. Cancer Cell. 6 (1), 91-99 (2004).
- Shackelford, D. B., et al. mTOR and HIF-1alpha-mediated tumor metabolism in an LKB1 mouse model of Peutz-Jeghers syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11137-11142 (2009).
- Faubert, B., et al. Loss of the tumor suppressor LKB1 promotes metabolic reprogramming of cancer cells via HIF-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2554-2559 (2014).
- Hemminki, A. The molecular basis and clinical aspects of Peutz-Jeghers syndrome. Cellular and Molecular Life Sciences. 55, 735-750 (1999).
- Hemminki, A., et al. A serine/threonine kinase gene defective in Peutz-Jeghers syndrome. Nature. 391 (6663), 184-187 (1998).
- Sanchez-Cespedes, M. A role for LKB1 gene in human cancer beyond the Peutz-Jeghers syndrome. Oncogene. 26 (57), 7825-7832 (2007).
- Sanchez-Cespedes, M., et al. Inactivation of LKB1/STK11 is a common event in adenocarcinomas of the lung. Cancer Research. 62 (13), 3659-3662 (2002).
- Ding, L., et al. Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma. Nature. 455 (7216), 1069-1075 (2008).
- Ylikorkala, A., et al. Vascular abnormalities and deregulation of VEGF in Lkb1-deficient mice. Science. 293 (5533), 1323-1326 (2001).
- Bardeesy, N., et al. Loss of the Lkb1 tumour suppressor provokes intestinal polyposis but resistance to transformation. Nature. 419 (6903), 162-167 (2002).
- Miyoshi, H., et al. Gastrointestinal hamartomatous polyposis in Lkb1 heterozygous knockout mice. Cancer Research. 62 (8), 2261-2266 (2002).
- Jishage, K., et al. Role of Lkb1, the causative gene of Peutz-Jegher's syndrome, in embryogenesis and polyposis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (13), 8903-8908 (2002).
- Shackelford, D. B. Unravelling the connection between metabolism and tumorigenesis through studies of the liver kinase B1 tumour suppressor. Journal of Carcinogenesis. 12, 16 (2013).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes & Development. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Ji, H., et al. LKB1 modulates lung cancer differentiation and metastasis. Nature. 448 (7155), 807-810 (2007).
- Momcilovic, M., et al. Heightening energetic stress selectively targets LKB1-deficient non-small cell lung cancers. Cancer Research. 75 (22), 4910-4922 (2015).
- Wislez, M., et al. Inhibition of mammalian target of rapamycin reverses alveolar epithelial neoplasia induced by oncogenic K-ras. Cancer Research. 65 (8), 3226-3235 (2005).
- Liang, M. C., et al. TSC1 loss synergizes with KRAS activation in lung cancer development in the mouse and confers rapamycin sensitivity. Oncogene. 29 (11), 1588-1597 (2010).
- Hudes, G., et al. Temsirolimus, interferon alfa, or both for advanced renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 356 (22), 2271-2281 (2007).
- Wander, S. A., Hennessy, B. T., Slingerland, J. M. Next-generation mTOR inhibitors in clinical oncology: how pathway complexity informs therapeutic strategy. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1231-1241 (2011).
- Pourdehnad, M., et al. Myc and mTOR converge on a common node in protein synthesis control that confers synthetic lethality in Myc-driven cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11988-11993 (2013).
- Hsieh, A. C., et al. The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis. Nature. 485 (7396), 55-61 (2012).
- Momcilovic, M., et al. Heightening energetic stress selectively targets LKB1-deficient non-small cell lung cancers. Cancer Research. 75 (22), 4910-4922 (2015).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
- Shackelford, D. B., et al. LKB1 inactivation dictates therapeutic response of non-small cell lung cancer to the metabolism drug phenformin. Cancer Cell. 23 (2), 143-158 (2013).
- Momcilovic, M., et al. Targeted Inhibition of EGFR and Glutaminase Induces Metabolic Crisis in EGFR Mutant Lung Cancer. Cell Reports. 18 (3), 601-610 (2017).
- Preclinical PET Imaging Systems | GA PET/X-ray & G8 PET/CT. Perkin Elmer. , Available from: http://www.perkinelmer.com/preclinical-pet-imaging/index.html (2018).
- Goodwin, J., et al. The distinct metabolic phenotype of lung squamous cell carcinoma defines selective vulnerability to glycolytic inhibition. Nature Communications. 8, 15503 (2017).
- Fueger, B. J., et al. Impact of animal handling on the results of 18F-FDG PET studies in mice. Journal of Nuclear Medicine. 47 (6), 999-1006 (2006).
- Dandekar, M., Tseng, J. R., Gambhir, S. S. Reproducibility of 18F-FDG microPET studies in mouse tumor xenografts. Journal of Nuclear Medicine. 48 (4), 602-607 (2007).
- Luker, G. D., Luker, K. E. Optical imaging: current applications and future directions. Journal of Nuclear Medicine. 49 (1), 1-4 (2008).
- Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324 (5930), 1029-1033 (2009).
- Vander Heiden, M. G., DeBerardinis, R. J. Understanding the intersections between metabolism and cancer biology. Cell. 168 (4), 657-669 (2017).
- Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
- Possemato, R., et al. Functional genomics reveal that the serine synthesis pathway is essential in breast cancer. Nature. 476, 346-350 (2011).
- Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (7360), 552-563 (2015).
- Hassanein, M., et al. Preclinical evaluation of 4-[(18)F]fluoroglutamine PET to assess ASCT2 expression in lung cancer. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 18-23 (2016).
- Qu, W., et al. Preparation and characterization of L-[5-11C]-glutamine for metabolic imaging of tumors. Journal of Nuclear Medicine. 53 (1), 98-105 (2012).
- Venneti, S., et al. Glutamine-based PET imaging facilitates enhanced metabolic evaluation of gliomas in vivo. Science Translational Medicine. 7 (274), 217 (2015).
- Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
- Keng, P. Y., et al. Micro-chemical synthesis of molecular probes on an electronic microfluidic device. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (3), 690-695 (2012).
- Lazari, M., et al. ELIXYS - a fully automated, three-reactor high-pressure radiosynthesizer for development and routine production of diverse PET tracers. EJNMMI Research. 3 (1), 52 (2013).
