Summary
In diesem Protokoll beschreiben wir wie nutzen [18-F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose-Positronen-Emissions-Tomographie und Computertomographie (18F-FDG-PET/CT) Bildgebung zur Messung der Tumor metabolische Reaktion auf die gezielte Therapie MLN0128 in einer KRAS/Lkb1 mutierte Maus Modell von Lungenkrebs und gekoppelte Bildgebung mit hoher Auflösung Ex Vivo Autoradiographie und quantitativer Histologie.
Abstract
Ein Markenzeichen der fortgeschrittenen Tumoren ist eine Umstellung auf aerobe Glykolyse, die leicht [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose Positronen-Emissions-Tomographie (18F-FDG-PET) Bildgebung gemessen wird. Co Mutationen in der KRAS -protoonkogenproduktes und das LKB1 Tumorsuppressor Gen sind häufige Ereignisse bei Lungenkrebs, die größeren, glykolytischen Tumorwachstum zu fahren. Ein kritischer Pfad regulieren das Wachstum und den Stoffwechsel dieser Tumoren ist das mechanistische Ziel von Rapamycin (mTOR) Weg, die effektiv mit selektiven katalytischen mTOR Kinase-Inhibitoren ausgerichtet werden kann. Die mTOR-Inhibitor MLN0128 unterdrückt Glykolyse bei Mäusen mit Tumoren mit Kras und Lkb1 Co Mutationen, als KL Mäuse bezeichnet. Die therapieantwort in KL Mäuse bemisst sich zunächst durch 18F-FDG-PET und Computertomographie (CT) Bildgebung vor und nach der Lieferung von MLN0128. Durch die Verwendung von 18F-FDG-PET/CT, können Forscher, dynamische Veränderungen in der Glukose-Stoffwechsel in gentechnisch Mausmodellen (GEMMs) an Lungenkrebs zu erkranken nach einer therapeutischen Intervention mit gezielten Therapien zu messen. Danach ist ex Vivo Autoradiographie und eine quantitative immunhistochemische (qIHC)-Analyse mit morphometrische Software. Die Verwendung von qIHC ermöglicht die Erkennung und Quantifizierung von deutliche Änderungen in der Biomarker-Profile nach Behandlung sowie die Charakterisierung der deutliche Tumor-Erkrankungen. Die Kupplung der PET-Bildgebung zu quantitativer Histologie ist eine wirksame Strategie zur Stoffwechsel- und therapeutische Antworten in Vivo in Mausmodellen der Krankheit zu identifizieren.
Introduction
Unsere Forschung konzentriert sich auf die Untersuchung und targeting Krebserkrankungen mit Mutationen in der Leber-Kinase B1 (LKB1, auch bezeichnet als STK11) mutierte Krebserkrankungen1. LKB1 ist ein Meister Tumorsuppressor, die mTOR Komplex 1 (mTORC1) unterdrückt durch die Aktivierung der AMP-Kinase (AMPK) führt zu der Regulation von Wachstum und Stoffwechsel. Daher führt der Verlust des LKB1 zu einer hemmungslosen mTORC1 Aktivierung, die Aktivierung der resultierenden HIF1-Alpha in einen glykolytischen Stoffwechsel Phänotyp gemeinhin als der Warburg-Effekt2,3,4. LKB1 Inaktivierung Mutationen führen direkt zur Entwicklung eines seltenen familiären Krebs Prädisposition Syndroms bekannt als Peutz-Jeghers Syndrom (PJS), die gekennzeichnet ist durch die Entwicklung von gutartigen Magen-Darm-Polypen, bekannt als Hamartomas5 , 6 , 7. Darüber hinaus LKB1 häufig Co mutiert mit Onkogene KRAS, was zu größeren und aggressiven menschlichen Lunge Tumore8,9.
Lkb1-Erkrankungen sind ohne weiteres bei Mäusen modelliert. Die heterozygote Inaktivierung von Lkb1 bei Mäusen führt zur Entwicklung des Hamartomas präzise Modellierung PJS10,11,12,13. Darüber hinaus rekapitulieren Lkb1 Mutationen, die leicht in den Mäusen genau modelliert werden Krebs Phänotypen von Lunge, Haut, Bauchspeicheldrüse und Brust14. Die Co Mutation des Kras/Lkb1 im Lungengewebe von transgenen Mäusen, ein Cre Rekombinase-vermittelte Aktivierung der Onkogene KrasG12D Allel und biallelische Löschung von Lkb1, führt zur Bildung von aggressiven und metastasierendem Lungentumoren15 ,16. Die Charakterisierung der KrasG12D; Lkb1- / - (KL) Lungentumoren isoliert von Mäusen zeigt diese Tumoren haben eine hohe mTORC1 Aktivierung und sind hochgradig glykolytischen, verwenden beide direkte Metabolit Messungen von Glukose und Laktat oder messen den Verbrauch [18F]-2- Fluoro-2-Deoxy-D-Glucose (18F-FDG) durch Positronen-Emissions-Tomographie (PET) mit der Computertomographie (CT) 17. MTORC1 hyper-Aktivierung in LKB1 mutierten Tumoren bietet eine klare Begründung für die Prüfung sowohl allosterische und katalytische Kinase-Inhibitoren von mTOR, diesen Krebs zu behandeln.
In einer früheren Studie haben wir gezeigt, dass die allosterische mTORC1 Inhibitor Rapamycin (RAPA) erfolgreich das Wachstum von und die Glykolyse in Gastro-intestinale (GI) Tumoren mit einer Lkb1+ /- transgenen Mausmodell PJS3gehemmt. RAPA ist derzeit zugelassen als Monotherapie Therapie für die Behandlung von Nierenzellkarzinomen aber zeigten begrenzte Wirksamkeit bei NSCLC18,19,20. RAPA ist eine allosterische mTORC1-Inhibitor und kann durch die Entwicklung der nächsten Generation mTOR-katalytische Kinase-Inhibitoren, die eine weitere fast vollständige Hemmung der mTOR-Anlagen 1 und 2 liefern verbessert werden (mTORC1 und mTORC2, beziehungsweise)21. Medikamente wie MLN0128 werden jetzt in den präklinischen Studien und frühen Phase klinischer Studien22,23evaluiert. Eine aktuelle Studie aus unserem Labor nachgewiesen, dass MLN0128 eine potente mTOR-Inhibitor in der menschlichen Lunge Tumorzelllinien und in Vivo in KL GEMMs der Lunge-Krebs-15,-16. MLN0128 unterdrückt den Lunge Tumor Wachstum und Glukose-Stoffwechsel in diesen Mäusen24.
In dieser Studie nutzen wir die gut charakterisierten adenoviralen Cre-induzierte Mausmodelle von Lungenkrebs initiierte eine bedingt aktivierte Lox-Stop-Lox-KRASG12D Onkogen15,25. Diese KrasG12D Mäuse wurden gekreuzt mit Mäusen mit Floxed Allele der Lkb1 (Lkb1L/L), KrasG12D; zu generieren Lkb1L/L (KL) Mäuse16. Im Anschluss an die intranasale Lieferung von Adeno- oder Lentivirus Cre-Rekombinase zum Ausdruck zu bringen entwickeln die KL-Mäuse frühen Läsionen durch 4 Wochen Post-Tumor-Induktion. 6 Wochen, die Tumore in der KL Mäuse Wechsel von adenomatöse Tumoren zum einen mehr bösartigen und aggressiven Tumor Phänotyp typischen Lunge Karzinome und durch 8 bis 10 Wochen entwickeln die Mäuse offene Karzinome mit einer 100 % Penetranz16,26.
Beide PET/CT-Bildgebung und quantitative Immunohistochemistry kann genutzt werden, um festzustellen, die molekularen und metabolische Reaktionen sowie die therapeutischen Antworten in Tumoren nach der Lieferung des gezielten Therapien wie z. B. MLN012817, 26,27. Hier beschriebene ist ein experimentelles Protokoll, das 18F-FDG-PET nutzt Bildgebung, um die metabolische Reaktion auf eine MLN0128 ausgerichtete Therapie zu messen. PET-Bildgebung mit quantitativer Histologie Kupplung ermöglicht die Messung der molekularen Reaktion auf mTOR-Inhibition sowie die Quantifizierung der tumorlast und Tumor-Histologie.
Protocol
Alle im Protokoll beschriebene Verfahren wurden von der institutionellen Pflege der Tiere zugelassen und verwenden Ausschuss (IACUC) an der University of California, Los Angeles.
1. 18F-FDG-PET und CT Imaging bei Mäusen
Achtung: Benutzen Sie Schutzausrüstung beim Umgang mit Radioaktivität. Befolgen Sie alle geltende rechtliche Verfahren im Umgang mit Radioaktivität.
- Legen Sie den Käfig mit den Mäusen, die auf einem warmen Bett bei 37 ° C 1 h vor dem 18F-FDG-Injektion zur Reduzierung des Verbrauchs von braunem Fettgewebe 18F-FDG abgebildet werden.
Hinweis: Fasten die Mäuse für 4-16 Uhr kann helfen den myokardialen 18F-FDG zu reduzieren. - Wiegen Sie die Maus, und notieren Sie ihr Gewicht.
- Betäuben Sie die Maus, die mit 2-3 % Isofluran in Sauerstoff bei 0,5 - 2 L/min für 2 – 3 min. mit einer Anästhesie-Kammer gehalten bei 37 ° C. Sicherzustellen Sie, dass diese Maus betäubt wurde, durch den Zeh Kneifen; keine Reaktion werden eingehalten, wenn die Maus betäubt worden. Gelten Sie ophthalmologischen Salbe für die Augen, Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Verdünnen Sie 18F-FDG (109 min. Halbwertzeit) in steriler Kochsalzlösung in eine angepasste Verfall korrigiert Injektion Konzentration von 70-75 µCi/100 µL.
Hinweis: Folgen Sie der PET-Scanner-Hersteller empfohlenen 18F Dosis für optimale Scanner Bildgebung. - Zeichnen Sie 70-75 µCi mit einer Insulin-Spritze mit einer Nadel 28 G, Messen Sie die Radioaktivität-Dosis mit einer Dosis-Kalibrator und zeichnen Sie die Messung und die Uhrzeit. Legen Sie die Spritze in einem Lead-Spritze-Halter.
Hinweis: Die Menge an Radioaktivität 18F-FDG in jeder Dosis wird mit einem dosiseichgerät, die gegen ein standard-Referenz-Material wie Cäsium-137, kalibriert ist laut des Herstellers Protokolle gemessen. Die Zeit des Lesens werden ebenfalls aufgezeichnet, um den Zerfall Korrektur zu bestimmen. - Stechen Sie das distale Ende der Maus Schwanz und Messen Sie der Maus des Blutzuckers mit einem Blutzuckermessgerät.
- Warm die Rute für 1-2 min mit einer Gaze in warmem Wasser eingeweicht. Wischen Sie die Rute mit 70 % Isopropanol, die Rute Vene kurz vor der Injektion zu dehnen. Verabreichen Sie 100 µL 18F-FDG (das gesamte Volumen in der Spritze) mit ein Bolus-Injektion über die seitlichen Tail Vene und notieren Sie die Zeit der Injektion. Messen Sie die verbleibenden Dosis in der Spritze mit der Dosis-Kalibrator und zeichnen Sie der Messung und der Dauer auf.
Hinweis: Es werden gewisse Sonde Links in die Spritze. Bevorzugt ist der Einsatz von Insulinspritzen über Spritzen mit Nadeln über Luer Sperren aufgrund der verringerten Menge der Dosis gefangen in der Spritze/Nadel nach der Injektion verabreicht wurde verbunden. - Platzieren Sie die injizierte Maus in der Anästhesie-Kammer gehalten unter 1,5-2 % Isofluran bei 37 ° C erlauben der Sonde zu verteilten über die Maus Körperkreislauf für 1 h vor der PET-Scan.
Hinweis: Es möglicherweise vorteilhaft, die Blase vor dem Scannen um ein einfacher 18F-FDG-PET Visualisierung der Tumoren in den unteren Flanken der Maus implantiert ermöglichen ungültig zu erklären. - Platzieren Sie nach 1 h den Mauszeiger in einer bildgebenden Kammer Isoflurane Narkose Nase-Kegel und bei 37 ° C, und sichern Sie seine Glieder im Ort mit medizinisches Klebeband in Rückenlage zu.
- Legen Sie die bildgebende Kammer in der PET/CT-Scanner.
- Erwerben Sie die PET- und CT-Scans, wie in der PET/CT-Scanner manuelle28beschrieben.
Hinweis: Die PET-Bildern werden erworben für 600 s mit einem Energie-Fenster von 150-650 keV, rekonstruiert mit Maximum-Likelihood Erwartung Maximierung mit Korrekturen für Photon Dämpfung, Detektor Normalisierung und Radioisotopen Verfall (war eine Scatter-Korrektur nicht angewendet). Die CT-Bilder werden in einem kontinuierlichen Modus für 50 s mit 50 kVp, 200 µA Röntgenquelle und ein Flachdetektor und sie mit dem Feldkamp Algorithmus rekonstruiert werden erworben. - Nachdem die PET/CT abgeschlossen ist, entfernen Sie die Maus aus der bildgebenden Kammer und lassen Sie es wieder in seinen Käfig. Überwachen Sie die Maus, bis es hat voll wieder zu Bewusstsein und sternalen liegen pflegen.
- Importieren Sie die rekonstruierten PET/CT-Bilder in Amid Software, indem Sie auf Dateiund dann auf Öffnen, und wählen Sie die entsprechende Datei.
- Konvertieren Sie die PET-Daten, die Maßeinheit Prozent injizierte Dosis pro Gramm (%ID/g) durch Eingabe der Dosis zum Zeitpunkt der Injektion nach Rechnungslegung für jede verbleibende Dosis in der Spritze verlassen oder die Werteinheit standardisierte Aufnahme (SUV) durch Eingabe zusätzlich des Thema Gewicht. Um dies zu tun, mit der rechten Maustaste auf den PET-Datensatz, und suchen Sie das %ID/g-Feld auf die Registerkarte " Basisdaten " Enter die %ID/g früher aufgezeichnet.
- Zeichnen Sie die Regionen-of-Interest (ROI) auf die Tumoren und normalem Gewebe (Leber, Muskeln, Lunge, Herz, Gehirn und subkutanes Fett). Um dies zu tun, klicken Sie auf Bearbeiten, wählen Sie Hinzufügen, ROI, wählen Sie ROI Form und benennen Sie dem ROI. Ziehen Sie ROIs über Tumoren und Gewebe zu und passen Sie ihre Abmessungen um Gewebe von Interesse in allen 3 Achsen zu decken.
Hinweis: Um Tiere in PET Sonde Bioverteilung Unterschiede berücksichtigen, können Tumor ROI-Werte weiter zu ROI-Werte der Leber, eine gut PERFUNDIERTEN Orgel mit minimaler Glykolytische Aktivität repräsentieren 18F-FDG im Umlauf normalisiert werden. ROI-Analysen der Tumor und normalem Gewebe werden auf die gleiche Maus durchgeführt. Lung Tumor Läsionen sind in der Regel mit 18F-FDG-PET gekennzeichnet, da die 18F-FDG-Speicherung in einer normalen Lunge relativ gering ist. CT wird auch verwendet, um Läsionen, insbesondere Läsionen zu identifizieren, die 18F-FDG nicht begeisterter sind. Eine ex-Vivo -Analyse der isolierten Lunge trägt auch zur Tumor-Läsionen zu lokalisieren.
2. 18F-FDG Autoradiographie
- Bereiten Sie die Maus für die Bildgebung mit 18F-FDG durch folgende Schritte 1.1-1.12, außer jetzt verdünnte 18F-FDG in steriler Kochsalzlösung in einer angepassten Verfall korrigiert Injektion Konzentration von 1.000 µCi/200 µL.
Hinweis: Höhere Dosen von 18F-FDG für Autoradiographie dienen entfallen zusätzliche Probe Verarbeitung Zeit und eine optimale Erkennung von Phosphor-Platten. - Einschläfern der Maus über eine tödliche Einatmen von Isofluran bei 5 % oder von CO2 (ein IACUC-zugelassenen Verfahren).
Hinweis: Zervikale Dislokation sollte nicht verwendet werden, da dies das Lungengewebe schädigen kann. - Festnageln der Maus mit der ventralen Oberfläche ausgesetzt und Besprühen Sie sie mit 70 % Ethanol zur Matte unten seine Haare vor dem Schnitt.
- Öffnen der Brusthöhle durch Anwendung einen Mittellinie Schnitt, wegschneiden des Zwerchfells und Entfernen der Brust-Wänden. Aussetzen der Luftröhre durch die Speicheldrüse sorgfältig entfernen. Legen Sie die Bulldogge Klammer auf der Luftröhre als in der Nähe der Kiefer wie möglich gewährleisten einen festen Sitz auf der Luftröhre. Platz 23 G Nadel an einer 3 mL Spritze in die Luftröhre unterhalb der Bulldog-Klemme und ~ 2 mL einer OCT:PBS (1:1) (optimale schneiden Temperatur: Phosphat gepuffert) Kochsalzlösung zu injizieren.
Hinweis: OCT ist sehr zähflüssig und vermischt sich mit PBS, um eine einfachere Injektion in die Lunge zu ermöglichen. - Ziehen Sie die Nadel aus der Luftröhre und verwenden Sie Zange, um auf die Einstichstelle zu jeder Durchsickern der OCT:PBS Lösung verhindern Klemme.
- Sorgfältig die Lungen aus der Brusthöhle zu entfernen und den linken Lappen vom Rest der Lunge zu trennen. Ort der linke Lappen in beschrifteten Cryomold gefüllt mit ein paar Tropfen von OCT. Sobald die Lungenflügel in der Form ist, füllen Sie die Cryomold an der Spitze mit OCT.
- Wiederholen Sie den Vorgang mit der rechten Hälfte der Lunge.
Hinweis: Wenn das 18F-FDG-Signal im Herzen hoch sein soll oder der Lungen-Tumoren am Herzen liegen, möglicherweise es positiv auf das Herz zu entfernen, um Tracer auslaufen zu verhindern. Alternativ können die ganze Lunge in einem einzigen Cryomold eingebettet werden. Es ist wichtig, um Luftblasen zu vermeiden, bei der Arbeit mit OCT. - Mit langen Zangen, legen Sie die vorbereiteten Cryomold in einem geschlossenzelligen extrudierten Polystyrol-Hartschaum-Behälter mit einer Mischung aus Trockeneis und Isopentane.
Hinweis: Diese Mischung ca.-70 ° C sollte vor dem Einlegen der Cryomold in es zum Einfrieren. Nach dem Aushärten wird die OCT-Verbindung weiß geworden. Wenn mehrere Proben gleichzeitig verarbeitet werden, können die gefrorenen Proben im OCT Cryomolds auf Trockeneis zwischengespeichert. - Entfernen Sie den gefrorenen Block aus dem Cryomold und montieren Sie es auf einem Kryostaten für schneiden. Abschnitt des Blocks bei einer Dicke von 4 µm mit Mikrotom Klingen (34°/80 mm, hochkarätige). Übertragen Sie die Gewebeschnitte auf eine Glas-Folie, die bei Raumtemperatur gelagert wurde.
- Legen Sie den Objektträger auf einem Phosphor imaging-Platte. Die Platte in der Kassette und schließen Sie sanft, um Folien verschieben zu verhindern. Speichern Sie die Kassette in einem Gefrierschrank-20 ° C für die Plattenbelichtung, in der Regel über Nacht.
Hinweis: Die Platten und Kassetten müssen vorab bis-20 ° C vor dem Gebrauch gekühlt werden. Platzieren die Proben bei-80 ° C ist auch akzeptabel. - Nach der Exposition die Folien von der Platte zu entfernen und die Platte auf der bildleser zu lesen.
- Die Folien in Plastikfolie eingewickelt und bei-80 ° C gelagert werden können, oder können sie für Hämatoxylin und Eosin Färbung oder Immunohistochemistry hergestellt werden.
3. Ernte Lungengewebe für Histologie
- Führen Sie die Schritte 2.2-2.4, außer jetzt, statt mit der OCT:PBS-Lösung, injizieren Sie 2-3 mL 10 % normal gepuffertem Formalin, die Lunge zu beheben zu.
- Ziehen Sie die Nadel aus der Luftröhre und verwenden Sie Zange, um auf die Einstichstelle zu verhindern jede undicht das Formalin festzuklemmen. Vorsichtig entfernen Sie die Lungen aus der Brusthöhle und legen Sie sie in ein 50 mL konische Röhrchen mit ~ 20 mL 10 % normal gepuffertem Formalin für 16-24 h um eine komplette Fixierung zu gewährleisten.
Hinweis: Befestigung der Lunge ermöglicht, für die Erhaltung der optimalen anatomischen Merkmale. - Am nächsten Tag, übertragen Sie die festen Lungen aus dem Formalin zu 70 % Ethanol und bereiten Sie die Lungen in einer Kassette Gewebe platziert werden.
- Bereiten Sie die Lunge für Histologie durch sorgfältig seziert Lappen mit einer Schere schneiden bei Verzweigungspunkte zwischen 5 Lappen, nummeriert von 1-5, wie in Abbildung 1D, und legen Sie sie in eine nicht-überlappende Ausrichtung in der Gewebe-Kassette. Legen Sie eine Schaumstoff-Pad vorsichtig auf das Lungengewebe, die Orientierung intakt zu halten.
- Speichern Sie die seziert Lungenlappen in 70 % igem Ethanol bis das Paraffin einbetten.
- Betten Sie Paraffin ein-des Gewebes in Kassetten und geschnitten Sie 4 µm Dicke Abschnitte für die Färbung mit Standardverfahren.
(4) Gewebe Segmentierung und Quantifizierung mit Hilfe kommerziellen Software
- Bild Hämatoxylin und Eosin (H & E) gebeizt Lungen-Abschnitte bei 1,25 X Vergrößerung mit Hilfe eines kommerziellen multispektralen imaging Systems.
- Konvertieren Sie die Bilder in Digitalbild Würfel und laden Sie (Klicken Sie auf Dateiund dann auf Laden spektralen Bibliothek) vorgefertigte Spektrenbibliotheken für H & E.
Hinweis: Die Spektrenbibliotheken wurden vorab durch den Erwerb von spektrale Bilder aus einzeln gefärbten Lunge Abschnitten, einen Abschnitt nur mit Eosin befleckt entwickelt und der andere nur gefärbt mit Hämatoxylin, die waren in ein Open Source-proprietäre spektralen Bibliothek gespeichert Datei (.csl). Das Abbildungssystem hat Betriebssoftware, die ein Bild bei jeder Wellenlänge, was benötigt wird erwirbt (definiert durch die Übernahme-Protokoll). Diese Bilder (der "Bild-Würfel") werden in einem OpenSource-proprietäre multispektralen Dateiformat (.im3) gespeichert. Spektren sind aus dem Bild Cube die morphometrische Software extrahiert und in separaten spektralen Bibliothek-Dateien gespeichert. - Spektral unmix die Pseudo-farbigen H & E Bilder der ganzen Lunge durch Klicken auf die Schaltfläche " Unmix ".
Hinweis: Entmischen dauert weniger als 1 s. Die Anzahl der Pixel in jedem Gewebe wurden quantifiziert morphometrische Bildanalyse-Software verwenden. - Visualisieren Sie jedes Bild Cube durch die Umwandlung der multispektralen Daten in das entsprechende 3-farbig (rot, grün und blau) Bild mithilfe des Auges wellenlängenabhängigen Farbe Antwort gefaltet mit der Intensität der einzelnen Bilder.
Hinweis: Die resultierende 3 Bilder sind als standard 24-Bit-Farben-Bild angezeigt. - Pseudo-Farbe jedes ungemischte Bild durch Skalieren das Bild in einem Benutzer gewählten Farbe (z.B.rot, grün, lila, etc.) und fügen das zusammen mit anderen Pseudo-farbigen ungemischte Bilder in einem standard 24-Bit-Farbbild.
- Verwenden Sie die Standardeinstellungen für alle Analysen.
Hinweis: im Allgemeinen, da diese Art der Segmentierung stützt sich auf eine visuelle Beurteilung der Ergebnisse (d. h., eine Bewertung, wie gut die Segmentierung auf die Bilder außerhalb der Ausbildung arbeiten gesetzt), ist es wichtig, die Bilder richtig ins Training aufzuteilen, Test und Validierung Sets. - Erst mit 2-3 Bilder als Trainingsset (10-15 für menschliche Biopsie Proben), Zug auf denen die Ergebnisse gut aussehen, und dann dieses Algorithmus auf eine weitere 2-3 Bilder anwenden. Wenden Sie dann die resultierenden Algorithmus auf die vollständige Überprüfung.
Hinweis: Wahrscheinlich werden einige Umschulung erforderlich sein. - Analysieren Sie Bereich Tumor im ganzen Lunge Abschnitte durch die Berechnung der Gesamt Pixelzahl für die roten Pseudo-farbigen Tumoren in Lappen 1-5 von jeder Maus.
Hinweis: Das normale Gewebe war Pseudo-farbige grün und Blut/Blut Schiffe waren Pseudo-farbige Rosa wie in Abbildung 3dargestellt. Die mittlere tumorlast für jede Behandlungsgruppe wurde durch Messung der gesamten Pixelzahl für jede Maus in der behandelten Gruppe berechnet.
Representative Results
18 F-FDG-PET-Bildgebung wurde auf KL Mäusen durchgeführt und gezeigt, dass die Tumoren in diesen Mäusen höchst glykolytischen waren dargestellt durch einen erhöhten 18F-FDG-Verbrauch (Abb. 1A), bisher veröffentlichten Studien26zustimmen, 29. Eine Resektion der gesamten Lunge ergab das Vorhandensein von mehreren Tumoren (Abbildung 1B). Maus-Lunge können aufgeteilt 5 getrennte Lappen in Zahlen 1 und 1 Dvertreten. Lappen 1-5 wurden auf geschnittenen Lunge, die mit H & E oder Glukose-Transporter 1 (Glut1) gefärbt wurden beschriftet (Abbildung 1D). Glut1 ist eine primäre Transporter von Glukose und 18F-FDG und seinen Ausdruck und Lokalisierung in der Plasmamembran von Tumorzellen direkt korrelieren mit 18F-FDG SUV29. Eine höhere Auflösung-Analyse der Glut1 Färbung (40 X) in 18F-FDG-begeisterter Lungentumoren zeigt eine erhöhte Expression und Lokalisation des Transporters in der Plasmamembran (Abbildung 1D).
Aufgrund der begrenzten Auflösung der PET-Bildgebung PET/CT und Gewebe Autoradiographie durchgeführt wurden. Die höhere Auflösung des Autoradiographie könnte kleinere Tumoren und/oder Heterogenität der Tumor 18F-FDG Verteilung identifiziert werden. Nach der Tumor-Induktion wurde 18F-FDG-PET/CT-Bildgebung auf KL Mäuse (Abb. 2A) gefolgt von Autoradiographie auf Lunge isoliert von diesen Mäusen (Abbildungen 2 b und 2 C) durchgeführt. Wie in den Figuren 2 b und 2 Cgesehen, identifiziert die Autoradiographie zwei zusätzliche kleinere Tumoren, die waren positiv für 18F-FDG noch waren nicht ohne weiteres sichtbar durch PET. Nach Autoradiographie könnte die Folien mit Gewebe auch für die immunhistochemische (IHC) Färbung des Biomarker(s) verwendet werden. H & E Färbung für die Tumoren bestätigte das Vorhandensein von Tumoren in der linke Lappen (Abbildung 2D).
Als nächstes erfolgte 18F-FDG-PET-Bildgebung auf MLN0128 behandelt KrasG12D; Lkb1- / - Mäusen um 18F-FDG als funktionelle Biomarker des Glukosestoffwechsels bei Lungentumoren (Abbildung 3) nutzen zu können. Wir identifiziert, die eine Behandlung mit MLN0128 robust mTORC1 Signalisierung und Glykolyse dargestellt durch einen reduzierten 18F-FDG-Verbrauch (Abbildungen 3A und 3 b) gehemmt. Diese Ergebnisse stimmen mit präklinischen Studien bewerten MLN0128 in KL Mäuse als zuvor veröffentlichten durch unser Labor17,27. Zu guter Letzt wurde IHC Beflecken an Tumoren (Abb. 3C) durchgeführt. Tumoren wurden gebeizt für H & E oder mit Antikörpern gegen Phospho-S6, die konservierten Substrat von mTORC1 und wird verwendet, um eine Aktivierung von mTORC1 anzugeben (P-S6) vs. Inaktivierung (S6). Abbildung 3 C zeigt eine robuste Hemmung der P-S6 von MLN0128 in KL Tumoren im Vergleich zu denen mit einem Fahrzeug, das zuvor veröffentlichte Arbeit17zustimmt behandelt. Neben der KRAS unterstützen Onkogenen Treiber wie z. B. den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) den glykolytischen Stoffwechsel in Lungentumoren sowie. Deshalb haben wir getestet, ob die Hemmung von konstitutiv aktiv mutiertem EGFR mit Erlotinib 18F-FDG-Stoffwechsel in Maus Xenotransplantate unterdrückt. Figuren 3D und 3E zeigen, dass die menschliche Lunge Tumor Linie HCC827, die eine EGFR-Mutation del19 birgt, zeigte einen deutlich reduzierten 18F-FDG-Verbrauch nach fünf Tagen von Erlotinib Behandlung.
Zu guter Letzt wurde morphometrische gewebeanalysen am geschnittenen Lunge und Lungentumoren, sowie die gesamte tumorlast zu quantifizieren, um Tumor-Erkrankungen zu unterscheiden, die enthalten Gewebe Subtyp, Nekrose, Blutgefäße aus normalem Lungengewebe und Luft-Raum durchgeführt. KL GEMMs entwickelte eine komplexe und krankhaft heterogene Erkrankung, die präsentierte sich mit Lungen-Tumoren der unterschiedlichen Histopathologies. Dazu zählen Adenokarzinome (ADC) und Squamous Zelle Karzinome (SCC)-diese Heterogenität macht die Behandlung dieses Krebses eine gewaltige Herausforderung. Abbildung 4 A zeigt einen einzelnen H & E gefärbt Lungenflügel mit zwei großen Tumoren vorhanden. Die Bilder mit höherer Vergrößerung dargestellt in Abbildung 4B identifizieren eine normale Lunge, Gefäße, und Luftraum und Tumor-Nekrose sowie Adenokarzinom, zeichnet sich durch eine klar definierte papillären Struktur und ein Plattenepithelkarzinom. Abbildung 4 C steht für die Pseudo-Färbung der Lungenflügel und Tumor mit Inform morphometrische Software. Abbildung 4 D zeigt die Prozentsätze der normalen Lunge, Gefäße und einzelnen Pathologien wie Tumor-Nekrose und Tumor-Untertypen, die gut differenzierten Adenokarzinom vom Squamous Zelle Krebsgeschwür segmentiert.
Abbildung 1 : Metabolisch aktiven KrasG12D; Lkb1- / - (KL) mutierte Lungentumoren sind 18F-FDG positive und express hohe Konzentrationen von Glukose-Transporter 1 (Glut1). Panels A und B zeigen eine maximale Intensität Projektion [auch als 3-dimensionale (3D) Bild bezeichnet] 18F-FDG-PET und CT-Analyse auf einige FDG-begeisterter KL Mäuse beherbergen Plattenepithelkarzinom Lungentumoren. Gezeigt werden (A) eine 3D-Rekonstruktion und (B) transversale, sagittale und koronale Ansichten der Lunge Lidrand als (T). (C) dieses Panel zeigt eine ganze Lunge Histologie der KL Maus abgebildet in Platten A und B, entweder gebeizt für H & E (Oberseite) oder mit einem Antikörper spezifische für Glut1 (Bodenplatte). Die Lungenlappen sind nummeriert. Die Maßstabsleiste = 2 mm. (D) dieses Diagramm zeigt die Ausrichtung und die Anzahl der Lappen in den Mäusen (Oberseite) und Bilder mit höherer Auflösung 40 X der H & E - oder Glut1-gefärbten Tumoren von den Folien gezeigt im Bedienfeld " C " für H & E (Mitte Platte) oder gebeizt mit einem Antikörper spezifische für Glut1 (Bodenplatte). Die Maßstabsleiste = 25 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: 18 F-FDG Autoradiographie erkennen kleine Tumoren, die metabolisch aktiv sind. (A) dieses 18F-FDG-PET/CT-Bild zeigt 18F-FDG-begeisterter Tumoren in einer KL-Maus als eine maximale Intensität Projektionsbild gezeigt. T1 und T2 = Tumoren, H = Herz, B = Blase, K = die Nieren. (B) dieses Panel zeigt die ex-Vivo -Autoradiographie auf Schnittserien von der rechten und linken Lungenlappen der Maus. Die Lunge in den linken und rechten Panels sind identisch. Die Lungen in den linken Panels sind Pseudo-Orange gefärbt. Die Lunge in die richtigen Platten sind in schwarz und weiß gefärbt. Die Tumoren (T1, T2 und T3) sind mit Pfeilen gekennzeichnet. (C) Dies ist eine vergrößerte Ansicht der Autoradiographie Pseudocolored orange (Oberseite) und schwarz / weiß (Bodenplatte). (D) zeigt dieses Fenster die H & E Färbung des oberen Segments des linken Lappens im Bedienfeld " B" angezeigt. Die Maßstabsleiste = 200 µm Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Die mTOR-Inhibitor MLN0128 unterdrückt Glukose Verbrauch in Lungentumoren KL Mäuse wie von 18F-FDG-PET erkannt (A) dieses Panel zeigt repräsentative 18F-FDG-PET/CT-Bilder von KL Mäuse behandelten mit einem Fahrzeug (18F-FDG begeisterter, Links) oder MLN0128 (18F-FDG nicht eifriger, nicht wahr). Die quer (Oberseite), koronal (Mitte Platte) und sagittale (untere Leiste) Ansichten gezeigt. Die Tumoren sind mit roten Linien umrissen; H = Herz, L = die Leber. (B) dieses Panel zeigt eine Quantifizierung der SUVmax (%ID/g) zwischen Fahrzeug und MLN0128-behandelten Tumoren. (C) zeigt dieses Fenster die H & E und P-S6 Färbung der ganzen Lunge Abschnitte von KL-Mäusen mit Fahrzeug oder MLN0128 behandelt. Die Maßstabsleiste = 25 µm. (D) dieses Panel zeigt repräsentative 18F-FDG-PET und CT-Aufnahmen des HCC827 EGFR (del19) Xenotransplantate Pre- und Post-Erlotinib Behandlung. Der Tumor (T) wird mit einem Pfeil, K = Niere, B = Gehirn. (E) dieses Panel zeigt eine Quantifizierung der SUVmax (%ID/g) für HCC827 Xenotransplantate vor und nach der Behandlung von Erlotinib. n = 10 Tumoren/Gruppe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Tumorlast und Tumor-Histologie quantifiziert mit morphometrische Software.
(A) dieses Panel zeigt die H & E Färbung von einem einzigen Mausklick Lungenflügel mit einem Tumor von einer KL Maus gesammelt. (B) zeigen diese Bilder mit höherer Auflösung, Squamous Zelle Krebsgeschwür (oben links), der normalen Lunge, die Gefäße und den Luftraum (oben rechts), und gut differenzierte papilläres Adenokarzinom (unten links) und Nekrose (unten rechts). (C) dieses Panel zeigt die Pseudocoloring der H & E-gefärbten Lunge Lappen mit morphometrische Software. (D) dieses Panel zeigt die Prozentsätze für die einzelnen Lunge Lappen und Tumor Erkrankungen durch Inform gemessen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
In diesem Artikel beschrieben einen Imaging-basierte experimentellen Ansatz, der 18F-FDG-PET/CT-Bildgebung mit qIHC genutzt, um den Stoffwechsel und molekulare Reaktionen in Lungentumoren nach der Lieferung des mTOR-Inhibitor MLN0128 messen. MLN0128 reduziert effektiv 18F-FDG Verbrauch zeigt eine signifikante metabolische Reaktion in den Tumoren. Durch die Verknüpfung von PET/CT-Bildgebung, Immunohistochemistry, durften wir räumlich abgegrenzten Tumoren auf die 3D PET/CT-Bilder zu registrieren und führen eine detaillierte Untersuchung der ganzen Tumoren auf zellulärer und molekularer Ebene. Dies ermöglichte es zu bestätigen, dass MLN0128 gehemmt, die mTOR Signaltechnik, und bestätigt damit eine zielgenaue Molekulare Reaktion auf das Medikament in den Tumoren. Zu guter Letzt unter Ausnutzung der quantitativen Histologie waren wir in der Lage, und separate deutliche Tumor Krankheiten wie Tumor Gesamtmasse von Tumor-Nekrose, Adenokarzinom vom Squamous Zelle Karzinome zu definieren und ergänzen MicroPET Bildgebung.
MicroPET wird derzeit von einer räumlichen Auflösung von ca. 1 mm begrenzt. Darüber hinaus kann 18F-FDG-Speicherung in bestimmten Geweben beeinflusst werden durch verschiedene Faktoren, einschließlich der Plasma-Glukose-Spiegel, Art und Dauer der Narkose Belichtung, der Umgebungstemperatur und der allgemeine Gesundheitszustand des Tieres, die auswirken können 18 F-FDG Pharmakokinetik30. Diese Parameter wurden für dieses Protokoll optimiert, sondern sollte für jedes Tier Modell optimiert werden. Reproduzierbarkeit Studien der 18F-FDG Bildgebung von subkutanen Tumoren in Mäusen zeigen ein Variationskoeffizient für die mittlere %ID/g von ca. 15 %, was darauf hindeutet, dass der Tumor therapeutische Reaktion einer einzelnen Maus von 18 bewertet F-FDG-PET sollte größer als diese Schwelle zuverlässig und bedeutende31berücksichtigt werden.
Die zelluläre und sogar subzelluläre Verteilung der PET-Tracer kann durch Autoradiographie Gewebe mit den Abschnitten anschließend gebeizt und Co bei qIHC registriert beurteilt werden. Co-registrierenden PET mit CT ermöglicht eine PET-Bild, um in einem anatomischen Kontext gestellt werden; Dies ist äußerst wertvoll, auch bei niedrigen Weichgewebe Kontrast. Das Fehlen von Weichgewebe Kontrast von CT kann mit Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) überwunden werden. Darüber hinaus Biomarker für die Fluoreszenz-Bildgebung können zur Glykolyse in Vivo, aber Photon Absorption zu beurteilen und Streuung in den Hohlraum der Lunge beeinträchtigen die genaue Quantifizierung oder Erkennung Empfindlichkeit-32. Zusammenfassend lässt sich sagen liefert Nutzung ganze Tier PET/CT-Bildgebung mit quantitativer Histologie eine genaue und Echtzeit-Karte der Tumorbiologie nach einer therapeutischen Intervention.
Multispektrale Bildgebung (MSI) ist anwendbar in jeder Situation, wo ein Farbbild verwendet werden könnten. Am allerwenigsten MSI bietet die gleichen Informationen wie ein Farbbild, und für einige Anwendungen, MSI kann bieten weitere Informationen über die spektralen Eigenschaften der Probe als ein einfaches Breitband-Dreifarben (RGB) Bild. Im Allgemeinen sind die Grenzen der MSI Farbe imaging, mit der Ausnahme, dass MSI langsamer ist und länger dauert, Bilder zu erwerben. Die morphometrische Software wurde verwendet, um reproduzierbare und genaue Segmentierung Ergebnisse für die Bilder und wird in der Tabelle der Materialienbeschrieben. Es gibt weitere kommerziell erhältliche Produkte, die für Gewebe Segmentierung und die Quantifizierung der Histologie verwendet werden können.
Die Komplexität der Krebs Stoffwechsel erstreckt sich jenseits der Warburg-Effekt und Glukose-Stoffwechsel-33,-34. Es ist sehr wahrscheinlich, dass Tumoren ohne weiteres Einzelsubstanz Behandlungen anpassen, die Glykolyse zu hemmen. Die Abhängigkeit von Aminosäure-Stoffwechsel in der Krebstherapie gut dokumentiert, und es wird erwartet, dass Tumoren auf eine Vielzahl von Amino acids wie Glutamin, Glycin, Serin sowie anderen Metaboliten wie z. B. freie Fettsäuren35,36verlassen, 37. Neben 18F-FDG wurden Sonden wie 18F - 11C-Label Glutamin, Cholin und Acetat, 1-(2'-Deoxy-2'-Fluoroarabinofuranosyl) Cytosin (FAC) und Fluorothymidine (FLT) erfolgreich zu Bild Aminosäure eingesetzt, Nukleotid- und Fettstoffwechsel in Tiermodellen der Krebs38,39,40,41. Automatisierung und Microscale Tracer Radiochemie Technologien gepaart mit höherer Auflösung, werden höhere Empfindlichkeit PET-Scanner die Barrierefreiheit von PET verbessern, zur Messung der verschiedenen biologischen Verfahren42,43. Als das Verständnis der Stoffwechsel erhöht ist es logisch, dass das Repertoire des PET Radiotracer ebenso steigen ermöglicht Forschern und Ärzten, nicht-invasiv Profil Tumor Stoffwechsel.
Die Nutzung von PET/CT-Bildgebung und quantitativer Histologie richtet sich klinische Notwendigkeit, die Bank Entdeckungen in klinischen Gebrauch schnell zu übersetzen ist. Um dies zu erreichen, müssen Forscher in der Lage, genau zu messen, die therapeutische Reaktion sowie die erworbenen Resistenzen gegen Medikamente, welche PET/CT-Bildgebung ermöglicht werden. Darüber hinaus die PET/CT und immunhistochemische Analyse von Lungentumoren dienen als Standardtherapie für Patienten, und somit direkt in die klinische Praxis übersetzbar sind. Wichtig ist, identifiziert PET/CT-Bildgebung ohne weiteres Therapie-resistenten Tumoren, welche Forscher isolieren können und auf molekularer Ebene zu befragen, um die Mechanismen der Krankheit besser zu verstehen. Dies ist ein iterativer Prozess, der es ermöglicht hat, besser zu verstehen die Mechanismen der Resistenz und effektivere Therapiestrategien für die klinische Übersetzung zu entwerfen.
Disclosures
Kevin P. Francis ist ein Mitarbeiter von Perkin Elmer. James Mansfield ist ein öffentliche Aktionär von PerkinElmer, Inc. (PKI) Aktien an der NASDAQ. Die Autoren haben nichts anderes zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken der University of California Los Angeles Crump präklinische Imaging Technology Center für ihre Unterstützung mit der PET/CT-Bildgebung der Mäuse, die translationale Pathologielabor Kern und Statistiken Kern an der University of California Los Angeles David Geffen School of Medicine für ihre Unterstützung bei der Tumor-Probenvorbereitung und Analyse. Für die Finanzierung, David B. Shackelford wurde unterstützt durch die CTSI und Translationale Wissenschaftspreis KL2 gewähren Nummern KL2TR000122 und UL1TR000124 an der David Geffen School of Medicine an der UCLA und durch die Abteilung der Verteidigung Lunge Krebs Forschung Programm Translational Forschung Partnerschaft W81XWH-13-1-0459 und ACS RSG-16-234-01-TBG. Sean T. Bailey wurde von einem NIH T32 Ausbildung Grant HL072752 durch der David Geffen School of Medicine an der UCLA unterstützt. Anthony Jones wird von der UCLA Tumor Zelle Biologie Trainingsprogramm (USHHS Ruth L. Kirschstein institutionelle nationale Forschung Service Award # T32 CA009056) unterstützt. Gihad Abdelhady wird unterstützt durch ein NIH/NCI Vielfalt Ergänzung R01CA208642.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| G8 PET/CT | Perkin Elmer | CLS139564 | Used for 18F-FDG PET and CT imaging of mice |
| Axio Imager.M2 | Zeiss | 490020-0003-000 | Acquiring images of FFPE lung tumor sections |
| Inform software | Perkin Elmer | CLS135781 | Morphometric used for image analysis of tumor pathologies |
| Glut1 antibody | Alpha Diagnostics | GT12-A | IHC staining of FFPE lung tumor sections |
| Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP™ Rabbit mAb | Cell Signaling Technologies | 4858 | IHC staining of FFPE lung tumor sections |
| MX35 Premier microtome blades | Thermo Fisher Scientific | 3051835 | Microtome blades for sectioning tissue for autoradiography |
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