Summary
De interactie en sedimentatie van klei en bacteriële cellen binnen de mariene realm, waargenomen in de natuurlijke milieus, kunnen het beste worden onderzocht in een gecontroleerde testomgeving. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol, dat een nieuwe methode voor het meten van de snelheid van sedimentatie van klei en cyanobacteriën floccules schetst.
Abstract
De mechanismen die de afzetting van fijnkorrelig, zijn organisch rijk sediment nog steeds grotendeels besproken. De gevolgen van de interactie van klei-deeltjes met reactief, planktonische cyanobacteriën cellen aan de sedimentaire record wordt in het bijzonder onder bestudeerd. Deze interactie is een potentieel grote bijdrage aan leisteen energetisch modellen. In een lab-omgeving, kunnen de flocculatie en sedimentatie tarieven van deze materialen worden onderzocht en gemeten in een gecontroleerde omgeving. Hier, detail we een protocol voor het meten van de snelheid sedimentatie van cyanobacteriën/klei mengsels. Deze methodologie wordt aangetoond door de beschrijving van twee monster experimenten: de eerste maakt gebruik van kaolien (een gedehydrateerde vorm van kaoliniet) en Synechococcus sp. PCC 7002 (een mariene coccoid cyanobacteriën), en de tweede gebruikt Kaolien en Synechocystis sp. PCC 6803 (een zoetwater coccoid cyanobacteriën). Cyanobacteriën culturen worden vermengd met wisselende hoeveelheden van klei in een speciaal ontworpen tank apparaat geoptimaliseerd zodat continue, real-time video en fotografische opname. De bemonsteringsprocedures zijn gedetailleerd en een post collectie protocol voor nauwkeurige meting van chlorofyl een waaruit de concentratie van cyanobacteriën cellen resterende in suspensie kan worden bepaald. Door middel van experimentele replicatie, is een profiel opgebouwd waarin sedimentatie tarief.
Introduction
Met behulp van huidige milieuomstandigheden en processen om te concluderen uit het verleden energetisch mechanismen is al lang een onderbouwing van de sedimentologie. Terwijl moderne energetisch analogen, zoals de Zwarte Zee, hebben gebruikt om te begrijpen van de afzetting van organische-rijke, fijnmazig deposito's, hebben laboratoriumexperimenten het potentieel om te werpen nieuw licht op de oorsprong van leisteen deposito's. Een gebied van onderzoek in de ontstaansgeschiedenis van zwarte leisteen is het mechanisme van oorspronkelijke formatie en afzetting tarief. Traditioneel, heeft zijn veronderstelde dat zwarte leisteen gevormd in omgevingen waar de snelheid sedimentatie, primaire productiviteit en organisch materiaal ademhaling tarieven het promoten van het behoud van organisch materiaal in het sediment,1,2 ,3. Echter, de rol van cyanobacteriën en klei flocculatie grotendeels ondoordachte is gebleven. Dit mechanisme van flocculatie zou voor het snelle aanbrengen van organische-rijke, fijnmazig sedimenten optreden, en doet niet vergen laag-zuurstof. Gezien dit uitgangspunt, dit protocol heeft twee doelen: 1) het meten van de snelheid sedimentatie van cyanobacteriën/klei floccules, en 2) het visualiseren van het proces van de sedimentatie in real-time. Deze methodiek, naast geochemische analyse, is gebruikt om aan te tonen dat cyanobacteriën/klei flocculatie kan in feite worden een belangrijk mechanisme voor shale formatie1. Hoewel oorspronkelijk bedoeld voor de modellering van leisteen depositie, is deze methode van toepassing op andere vakgebieden zoals biologie en milieu sanering waar de invloed van klei input op bacteriële metabolisme en de bevolking moet worden gemeten.
Talrijke studies zijn uitgevoerd om te zien hoe de flocculatie van cyanobacteriën en klei, voor het beperken van schadelijke algenbloei2,3,4,5,6,7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 1 2. echter tijdens het meten van cel concentratie na verloop van tijd, deze studies niet op hebt toegepast cyanobacteriën/klei flocculatie modellering van de afzetting van de rock-record. Deze studies niet als zodanig een visuele component, die cruciaal worden kan wanneer modellering verleden sedimentologische processen. Bovendien, de meerderheid van de studies maken gebruik van cel-tellen (bijvoorbeeld Pan et al.. 11), die moeizaam kunnen zijn. Onze methode, met de recente vooruitgang in meten cyanobacteriën flocculatie, bepaalt de veranderingen in de concentratie van cyanobacteriën cel door het meten van chlorofyl een (Chl een) met discrete tijdsintervallen. Chl een meting met visuele gegevens koppelen is een nieuwe benadering, die kan worden gebruikt voor het afleiden van energetisch voorwaarden. De beelden die gegenereerd kunnen ook worden gebruikt voor de berekening van sedimentatie tarief na het werk van Du et al.. 13. de combinatie van visuele en numerieke gegevens versterkt de betrouwbaarheid van de resultaten. Voorts schetsen wij aanvullende protocollen waardoor de bezinking van dode biomassa en klei ook worden waargenomen. Dit is belangrijk bij het overwegen van verleden sedimentologische omgevingen, waar levende en dode biomassa mede mogelijk hebben voorgedaan. Verschillen in het gedrag van dode biomassa tijdens de flocculatie (bijvoorbeeld flocculatie tarief afname) potentieel sedimentologische gevolgen zou hebben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiden van cyanobacteriën culturen
-
Voorbereiding van de culturen van de inoculatie met vaste voedingsbodems
- Een cyanobacteriën cellen verkrijgen bij de American Type Culture Collection of Pasteur Culture Collection. Bijvoorbeeld, de eencellige, mariene Synechococcus sp. PCC 7002 is verkregen uit de Pasteur Culture Collection, het zal worden aangeduid als Synechococcus.
- Het handhaven van Synechococcus cellen op platen met vaste voedingsbodems (A + vloeibare media14 en 1,5% agar15). Deze zal hierna worden aangeduid als inoculatie culturen.
- Incubeer de platen bij 32 ± 2 ° C met continue licht geboden bij 30-50 µmol fotonen m-2 s-1,15,18.
- Herhaal stap 1.1-1.3 en vervangen A + media met BG-11,16 in stap 1.1.2 voor zoetwater cyanobacteriën soorten, zoals Synechocystis sp. PCC 680316,17, hierna Synechocystis. Verwijzen naar tabellen 1-4 voor de samenstelling van A + en BG-11 media.
-
Voorbereiding van vloeibare culturen: elke tank experiment vereist een 400 mL cyanobacteriën cultuur.
- Verzamel een 250 mL en twee 1 L hittebestendig conische kolf.
- Spoelen van elke kolf met een 4 M zoutzuur (HCl)-oplossing (30 mL HCl-oplossing voor elke kolf), gevolgd door gedestilleerd water.
Let op: zoutzuur is bijtende en giftige. Ervoor zorgen dat een laboratoriumjas, veiligheidsbril en zuur-bestendige handschoenen worden gedragen terwijl het gebruiken van de 4 M HCl oplossing. Voer deze stap uit in een laboratorium gootsteen en volgen van de plaatselijke regelgeving inzake het weggooien van de 4 M HCl oplossing - Vul de maatkolf van 250 mL met 50 mL vloeibare media (A + of BG-11). Vul in een maatkolf van 1 L met 400 mL vloeibare media (A + of BG-11) en de andere 1 liter-kolf met 600 mL media (A + of BG-11).
- Zegel van elke kolf met een gas permeabele schuim stop en bedek de schuim stop en kolf hals met zilverpapier.
- Label en autoclaaf toestaan de kolven bij 121 ° C en 100 kPa voor 25 min. de kolven afkoelen tot kamertemperatuur.
- Bereid een laminaire flow-kap door het steriliseren van het oppervlak met 70% alcohol.
- Het verzamelen van een draad inoculatie lus, een Bunsenbrander, de afgekoelde 50 mL vloeibare media kolf (uit stap 1.2.5) en de cultuur van de inoculatie (uit stap 1.1). Plaats deze items in de gesteriliseerde stroom kap.
- De draad inoculatie lus kort met behulp van de vlam van een bunsenbrander steriliseren en laat ze afkoelen.
- Sleep de koele lus langs het oppervlak van de inoculatie cultuur voor het verzamelen van cyanobacteriën cellen.
- Verwijder de schuim stop en folie GLB van de kolf van 250 mL (zonder aan te raken de schuim stop) en de rand van de erlenmeyer door het kort door de vlam steriliseren.
- Kantelen van de kolf, dus de media in de buurt van de hals van de kolf is en de lus van de inoculatie bekleed met cellen in de maatkolf invoegen. Zodra de lus is ondergedompeld in de media, roer de inoculatie lus de cellen verwijderen.
- Verwijder de inoculatie lus en de lip van de kolf met behulp van de vlam Bunsenbrander opnieuw te steriliseren.
- Vervang de schuim stop en folie cap op de conische kolf (zonder aan te raken de schuim stop).
- De lus van de inoculatie kort in de vlam Bunsenbrander steriliseren.
- Bereiden van een kamer van de groei (hierna: de groei kamer) waar de temperatuur op 30 ° C15,18 en lichtintensiteit is 30-50 µmol fotonen m-2 s-1,15,18 . Vochtigheid is niet actief gecontroleerd.
- Toestaan dat de geënte 50 mL cultuur Incubeer door schudden bij 150 t/min in de zaal van de groei, met een onderhouden temperatuur van 30 ° C. Houd de mond van de kolf gedekt tijdens de agitatie om controle van de verdampingsemissies verliezen en verontreiniging voorkomen.
- Laat de cyanobacteriën culturen groeien voor 96 uur. Een succesvolle cultuur moet worden helder groen weergegeven en hebben een optische dichtheid (OD) bij 750 nm van 0,4-0,6.
- Zodra de cultuur is voldoende gegroeid, plaats de 50 mL-cultuur en de maatkolf van 1 L met 400 mL vloeibare media (uit stap 1.2.5) de laminaire flow Hood. Zorgen dat de stroom kap is gesteriliseerd volgende stap 1.2.6.
- Herhaal stap 1.2.10 voor beide kolven in een laminaire flow-kap.
- Giet de cultuur van 50 mL in de media in de maatkolf van 1 L 400 mL en de lip van de maatkolf van 1 L met behulp van de vlam Bunsenbrander opnieuw te steriliseren.
- In de plaats van het schuim stop en folie GLB, hechten een steriele borrelende apparaat bestaande uit een schuim stopper, Pipet, kunststof buizen, in-line filter en folie omslag aan de monding van de kolf.
- Agitate de maatkolf van 1 L op 150 rpm bij 30 ° C met het waskolf-apparaat aangesloten op een luchtpomp, die een bevochtigde luchtmengsel via de oplossing15,18 300 mL/min circuleert.
- Toestaan dat de culturen om te groeien in de vergaderzaal van de groei bij 30 ° C gedurende 120-168 uur. Een succesvolle cultuur moet worden helder groen weergegeven en hebben een OD750 nm van 0,4-0,6.
- Herhaal stap 1.2 voor de productie van een controle-cultuur, die zal niet worden vermengd met de klei.
- Experimenten met behulp van dode biomassa vereist een extra stap. Autoclaaf de maatkolf van 1 L cultuur voor 60 min bij 121 ° C en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur.
2. experimentele instellen
- Plaats een rechthoekige acryl tank (lengte 20 cm), 5.1 cm breed en hoogte van 30 cm voor een bank van fluorescerende lampen (negen T8 lampen, ten minste 2.600 lumen; Figuur 1) 19.
- Plaats een doorzichtige, witte plastic folie tussen de bank van de lichten en de tank om te verspreiden het licht, dat door de tank schijnt. Deze set-up werd aangepast van Sutherland et al. 19
- Mark de acryl tank op een hoogte van 10 cm, gemeten verticaal vanaf de basis. Alle metingen moeten worden verricht op deze hoogte in de waterkolom te zorgen voor de samenhang van alle bemonstering.
- Plaats een camera op een statief, 1 m vóór de tank om te registreren elk experiment. Een videocamera wordt aanbevolen aangezien beelden kunnen worden geëxtraheerd uit videodossiers, en met behulp van wiskundige modellering software, video-bestanden kunnen worden gebruikt om het model beslechting dynamics19.
- Plaats een zwarte doek over de lichte bank tank en de camera te beschermen van het experiment van externe lichtbronnen (Figuur 1).
3. flocculatie experimenteel Protocol
- Het verzamelen van de cultuur van 400 mL (stap 1.2), een grote afgestudeerd cilinder en 600 mL extra groei media in een maatkolf van 1 L (stap 1.2.5).
- Verdun de 400 mL cultuur (eerste cel concentratie van 4-6 mg/mL) met extra groei media (A + of BG-11) tot eindvolume van 1 L met behulp van de gegradueerde cilinder. Voeg deze oplossing aan de acryl tank.
- Bereiden van 2 mL microfuge buizen door labeling en plaatsen ze op een gunstige locatie in de buurt van de acryl tank. 50 g van klei voor het experiment te meten.
- Video-opname te beginnen. In het geval van meerdere experimenten, kan een bord met de id van het experiment tijdelijk worden gesteld voor de camera.
- Met behulp van een precisiepipet, neemt een 1 mL monster en breng dit in een gelabelde microfuge buis. In dit voorbeeld gebruiken om te bepalen van de initiële cyanobacteriën cel telling door het meten van de OD750 nm waarden. Alle monsters te nemen in drievoud om nauwkeurige resultaten te waarborgen.
- Snel giet de klei (50 g) in de tank met krachtige agitatie via een opzwepende stick voor 10 – 15 s.
- Start de timer en neemt de eerste 1 mL monster voor Chl een bepaling met behulp van een precisiepipet P1000 (monster tijd0).
- Extra monsters te nemen op passende tijdstippen (bijvoorbeeld, 1 min 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 60 min, 180 min en 240 min).
- Zodra het experiment is voltooid, slaat het videobestand, uitschakelen van de video-camera en verwerken van alle monsters voor Chl een bepaling (stap 4).
- Autoclaaf de resterende klei/cyanobacteriën oplossing. Afhankelijk van cyanobacteriën soorten, lokale regelgeving en lab beleid, vervreemding van de oplossing met behulp van geschikte methoden. Schoon de tank met zeep en water, spoelen met gedistilleerd water en lucht drogen.
- Bereiden een controle-experiment met geen klei toegevoegd. Monsters te nemen op de dezelfde tijd punten. Deze gegevens kan worden vergeleken met de andere experimentele gegevens om te bevestigen dat beslechting tarieven worden verbeterd als gevolg van de flocculatie met klei, niet een gevolg van de natuurlijke afwikkeling.
- Als dode biomassa wordt gebruikt tijdens het experiment, gebruik dezelfde experimentele procedure. De procedure van de beschikking van de oplossing vereist echter geen autoclaaf.
4. verwerking en evaluatie van de proeven
- Bepaal Chl een concentratie in elk monster van de cel met behulp van een procedure van Owttrim16gewijzigd. Zodra verzameld, pellet de cellen van elk monster gedurende 3 minuten op 13.000 x g met behulp van een microcentrifuge bij kamertemperatuur.
- Verwijder overtollige media met behulp van een precisiepipet P1000 en voeg 1 mL 100% methanol (20 ° C). Vortex het monster bij volledige snelheid voor 1 min aan resuspendeer de pellet cel.
Let op: Methanol is giftig en brandbaar. Draag handschoenen en veiligheidsbril, en methanol uit de buurt van ontstekingsbronnen houden. - Incubeer de monsters bij-20 ° C gedurende 24 uur om de winning van Chl een.
- Na incubatie, pellet het cellulaire puin zoals beschreven in punt 4.1, de groene supernatant overbrengen in een cuvet met behulp van een precisiepipet en plaats de cuvette in de spectrofotometer. Toestaan dat de steekproef om uit te rusten in de spectrofotometer voor 1 min om ervoor te zorgen dat alle resterende klei binnen het monster afwikkelt en niet met de meting interfereert.
- Chl een concentratie spectrophotometrically bepalen door het meten van de absorptie bij 665 nm en 652 nm en OD bij 750 nm. De Chl een concentratie wordt bepaald met behulp van de formule Chl een = 16.29 x (een665 - OD750) - 8.54 x (een652 - OD750) 20. CHL een concentratie wordt gebruikt als een proxy voor cel concentratie. Bovendien, een conversiefactor van 7,4 x 1010 cellen/L = 10 g/L21 kan worden gebruikt voor het berekenen van de concentratie van de cel in gram van sommige soorten van cyanobacteriën.
- Berekende Chl een waarden tegen de tijd uitgezet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wanneer blootgesteld aan klei, worden cyanobacteriën cellen gebracht uit schorsing22. Dit wordt geïllustreerd in de representatieve resultaten hier gegeven. Om het effect van klei op cyanobacteriën populaties te bepalen en te observeren de bezinking tarieven, twee experimenten werden uitgevoerd tijdens die Synechococcus en Synechocystis werden blootgesteld aan 50 g/L Kaolien klei (tabel 5-6, Figuur 2–3). Cyanobacteriën culturen zijn geteeld zoals beschreven in stap 1. Vervolgens, na het opzetten van de tank (stap 2), was de verdunde Synechococcus cultuur in de tank gegoten en gemengd met 50 g van Kaolien klei na stap 3. Dit werd herhaald voor de Synechocystis -cultuur. Alle monsters werden genomen van de overeenkomstige positie in de tank. De monsters werden verwerkt en metingen van OD652 OD665 alsmede de berekende Chl een waarde worden gegeven voor de Synechococcus (tabel 5) en Synechocystis (tabel 6). Deze resultaten werden uitgezet grafisch op de lijn percelen en vergeleken met de resultaten van de normen om te bepalen als de beslechting tarief van cyanobacteriën/klei mengsels hoger dan de natuurlijke beslechting van cyanobacteriën alleen was. Deze resultaten tonen aan dat de cyanobacteriën populaties werden gebracht uit schorsing binnen 10 min van klei blootstelling (Figuur 2–3). De mariene Synechococcus toonde een meer snelle sedimentatie tarief dan het verse water Synechocystis, die met de hypothese strookt dat driewaardig kationen (overwegend in het groeimedium, die het zoutgehalte van zout water bootst) fungeren als de "passerelle" agent tussen de klei-deeltjes en bacteriële cellen, flocculatie en, derhalve, sedimentatie1te vergemakkelijken.
Het is belangrijk om er rekening mee dat in Figuur 3, er zijn enkele anomalously hoge resultaten, speciaal op gegevens punt 2. Dit is een voorbeeld van monster verwerking tijdens welke stap 4.4 was niet voldoende gevolgd en het monster werd troebel tijdens de meting. Dit produceert een kunstmatig hoog resultaat (Figuur 2, gegevens punt 2). Een voorbeeld van beelden in tijdreeksen, gewonnen uit een video vindt u in Figuur 4, aangepast van Playter et al. 22. het is belangrijk op te merken dat kaoliniet (niet kaolien) werd gebruikt in Playter et al. 22.
Figuur 1 : Verklarende schematische weergave van de experimentele opstelling. Een videocamera is ingesteld ten minste 1 m van de tank-apparatuur. De tank is gevuld met 1 L van cyanobacteriën en vloeibare media. Lichten verlichten van achter de tank en het licht wordt verspreid door een doorzichtige film. Deze hele instellen is gedrapeerd met een zwarte doek te elimineren van extra lichtbronnen. Dit cijfer is gewijzigd van Sutherland et al.. 19. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Chl een concentraties berekend op basis van de OD-waarden opgenomen in tabel 1. Deze waarden zijn opgenomen in een Synechococcus /kaolien mengsel (geel). Vergelijking met Chl een concentraties voor Synechococcus alleen (blauw) toont een verhoogde sedimentatie tarief voor het mengsel van cyanobacteriën/klei. Dit cijfer is gewijzigd van Playter et al. 22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Chl een concentraties berekend op basis van de OD-waarden opgenomen in tabel 2. Deze waarden liggen tussen- Synechocystis /kaolien mengsel (geel). Vergelijking met Chl een concentraties voor Synechocystis alleen (blauw) toont een verhoogde sedimentatie tarief voor het mengsel van cyanobacteriën/klei. Dit cijfer is gewijzigd van Playter et al. 22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Representatief tijdsverloop van Synechococcus-kaoliniet depositie. Deze momentopnamen worden geëxtraheerd uit de opgenomen video met discrete tijdsintervallen (1 min). Dit cijfer is gewijzigd van Playter et al. 22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Voor 1 liter |
| 18 g NaCl |
| 0.6 g KCl |
| 1 g NaNO3 |
| 5 g MgSO4 ∙ 7 H2O |
| 1 mL KH2PO4 |
| 7,2 mL CaCl2 |
| 161 μL nb2EDTA |
| 1 mL FeCl3 ∙ 6 H2O |
| 10 mL Tris HCl pH 8.2 |
| 1 mL P1 metalen voorraad * |
Tabel 1: recept voor een + media 14 . Raadpleeg tabel 2 voor de samenstelling van P1 metalen voorraad. Dit recept produceert 1 L voor de media.
| Voor 1 L P1 metalen voorraad |
| 34.26 g H3BO3 |
| 4,32 g MnCl2 ∙ H2O |
| 0.315 g ZnCl |
| 0.03 g MoO3 (85%) |
| 0.003 g CuSO4 ∙ 5 H2O |
| 0.01215 g CoCl2 ∙ 6 H2O |
Tabel 2: Recept voor P1 metalen voorraad vereist voor A + media.
| Voor 1 liter |
| 10 mL NaNO3 |
| 1 mL K2HPO4 |
| 1 mL MgSO47 H2O |
| 1 mL CaCl2 2 H2O |
| 1 mL citroenzuur H2O |
| 1 mL Ferri-ammoniumcitraat |
| 1 mL DiNaEDTA |
| 1 mL nb2CO3 |
| 1 mL A5 Microelements * |
Tabel 3: recept voor BG-11 media 16 . Raadpleeg tabel 4 voor de samenstelling van de A5 Microelements. Dit recept produceert 1 L voor de media.
| Voor 1 liter-stockoplossing |
| 2.86 g H3BO3 |
| 1,81 g MnCl2 4 H2O |
| 0.222 g ZnSO4 7 H2O |
| 0.390 g nb2MoO4 2 H2O |
| 0.079 g CuSO4 5 H2O |
| 0,40 g CoCl2 6 H2O |
Tabel 4: Recept voor A5 Microelement voorraad vereist voor BG-11 media.
| Monster tijd (min) | OD 665 nm | OD 652 nm | CHL een (mg/mL) |
| -1 | 0.563 | 0.373 | 5.986 |
| 0 | 0.428 | 0,33 | 4.154 |
| 5 | 0.112 | 0.046 | 1.432 |
| 10 | 0.024 | 0,036 | 0.084 |
| 15 | 0.027 | 0,025 | 0.226 |
| 30 | 0,007 | 0.002 | 0.097 |
| 60 | 0 | 0.061 | 0.000 |
| 120 | 0,007 | 0.061 | 0.000 |
| 180 | 0.005 | 0,012 | 0.000 |
| 240 | 0.005 | 0,012 | 0.000 |
Tabel 5: OD 665 en OD 652 metingen voor Synechococcus in aanwezigheid van 50 g/L Kaolien klei. CHL een waarden worden berekend aan de hand van de formule in stap 4.4. Merk op dat t6 en t7 monsters worden vermist. Dit is een voorbeeld van het niet houden van een consequente controle-interval vanaf het mobiele bemonstering-protocol. Gegevens voor de standaard is ontleend aan Playter, et al.. (2017) 2.
| Monster tijd (min) | OD 665 nm | OD 652 nm | CHL een (mg/mL) |
| -1 | 0.384 | 0.345 | 3.309 |
| 0 | 1.863 | 1.739 | 15.497 |
| 5 | 0.64 | 0.528 | 5.916 |
| 10 | 0.217 | 0.216 | 1.690 |
| 15 | 0.104 | 0.089 | 0.934 |
| 30 | 0.126 | 0.169 | 0.609 |
| 60 | 0.424 | 0.402 | 3.474 |
| 90 | 0.115 | 0.048 | 1.463 |
| 120 | 0.016 | 0,007 | 0.201 |
| 180 | 0,012 | 0.004 | 0.161 |
| 240 | 0.011 | 0.005 | 0.136 |
Tabel 6: OD 665 en OD 652 metingen voor Synechocystis in aanwezigheid van 50 g/L Kaolien klei. CHL een waarden worden berekend aan de hand van de formule in stap 4.4 bedoelde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flocculatie gekatalyseerd door cyanobacteriën cel-klei interactie heeft aangetrokken veel van belang op het gebied van ecologie en engineering2,3,4,5,6,7 ,8,9,10,11,12, echter, het onderzoek van deze interacties met de bedoeling van de afzetting van sedimentaire modellering deposito's (zoals leisteen) is relatief nieuw. De visualisatie van dit proces, is in dit geval voor sedimentologische toepassingen, niet gemeld. In afgelopen flocculatie studies, zijn deze interacties onderzocht door het mengen van klei en cyanobacteriën in potten, reageerbuisjes, of bekerglazen en bemonstering in discrete tijd intervallen9,11,12, 26 te bepalen van de veranderingen in de concentratie van de cel door de tijd. Deze onderzoeken hebben de concentratie van cyanobacteriën cellen op verschillende manieren gemeten. Bijvoorbeeld, zijn de bemonsterde cyanobacteriën cel populaties gemeten door te tellen met behulp van een Microscoop9,11,12,26. In vergelijking met de eerste cel concentratie, kunnen de efficiëntie van de verwijdering berekende9,11,12,26. In een afzonderlijke studie, na de klei/cel mengsel te regelen, zodat werd de vloeistof nog boven de vaste cel/klei sedimenten bemonsterd en geanalyseerd voor fluorescentie te schatten het aantal resterende cellen in schorsing3. Metingen van Chl een rechtstreeks vanaf kolom watermonsters worden ook gebruikt voor het berekenen van8,10van de concentratie van de cel.
In tegenstelling, meet onze methodologie de cellen in suspensie na verloop van tijd, voortbouwend op de methodologie van Sengco, et al. 4 door metingen select tijde gedurende het gehele proces en koppeling van deze tijdsintervallen met real-time video beeldvorming. In vergelijking met andere experimentele protocollen met betrekking tot de afwikkeling van klei in het bijzijn van anionactieve flocculanten, verschilt met biologische (algen of cyanobacteriën) of niet-biologische (synthetische flocculator agenten) flocculanten, onze analyse op veel graven. Ten eerste, onze studie impliceert het gebruik van een mariene coccoid soorten van cyanobacteriën, terwijl veel andere studies betrekken of zoetwater soorten die extracellulaire polysaccharide stoffen5,23,24 produceren , 25. Bovendien, onze studie impliceert het gebruik van een standaard tank, waarbinnen de oplossing statisch blijft. Dit in tegenstelling tot studies gedaan met behulp van reageerbuizen of cilinders3,12,14 of meetgoot tanks, waar de vloeistofstromen een variabele rente6,7 is. De statische aard van onze experimentele methode zorgt voor de meting van de basislijn sedimentatie tarieven, waar floccules worden niet bewaard in suspensie door turbulente stroming. Bovendien, zorgt met behulp van een tank in plaats van een reageerbuis, jar- of bekerglas, voor betere visualisatie van de resulterende deposito's vanwege de platte tank zijden; de video beelden tonen niet wordt verstoord als gevolg van gebogen en het licht is gelijkmatig verspreid. Ten derde, de methodologie die hierin worden beschreven maatregelen flocculatie tarieven over zowel de korte (2 min intervallen) en lange (uur intervallen) termijn; Bovendien kunnen de beelden op een schaal van seconden tot minuten, waardoor zowel visualisatie van het proces, als een aanvullende meting van het beslechting tarief worden gecompileerd. De meeste studies maatregel flocculatie tarieven meer dan de helft vol uur intervallen5,6,23,25 of gewoon maatregel het definitieve aantal cellen links in suspensie na een enkele keer wijs (2 – 2,5 h)9,24, hoewel sommige studies9 hebben gemeten wijzigingen in cel of Chl een concentratie over 2 minieme intervallen. Het controle-interval gekozen is van cruciaal belang, zoals flocculatie snel (binnen 5 – 10 min optreden kan)22. Tot slot, een belangrijke troef van onze methodologie is dat het real-time beelden van de flocculatie proces, niet alleen van de geproduceerde aggregaten produceert (bv., Avnimelech, et al.., 1982)24. Met twee regels met gegevens, cel concentratie van bemonsterings- en visuele aanwijzingen, versterkt de betrouwbaarheid van de resultaten en de conclusies van de robuuste ondersteunt.
Terwijl geschikt voor het meten van flocculatie tarieven van klei en cyanobacteriën, ons protocol vereist toewijding met betrekking tot de locatie van de bemonstering in de tank. Hetzelfde gebied van de tank (x, y, z) moet worden bemonsterd telkens of de resultaten van de steekproef kunnen worden scheefgetrokken. Ook moet worden gezorgd dat alle deeltjes te regelen voordat OD metingen zijn verricht. Kritische stappen omvatten: i) het gebruikmaken van een passende voorbeeldinterval die consistent zijn voor alle experimenten blijft, en ii) om ervoor te zorgen dat de klei/cyanobacteriën pellet voldoende gebroken na toevoeging van methanol om ervoor te zorgen de passende winning van chlorofyl uit de cellen.
De hier beschreven techniek is ook beperkt tot modellering flocculatie volledig zuurstofrijk omstandigheden. De experimentele apparatuur en procedure zou moeten worden gewijzigd om het model van een gestratificeerde waterkolom met zuurstofvrije onder water.
In het sedimentologische kader heeft deze methode het potentieel om te worden toegepast op modellering stortingen van verschillende klei verhoudingen of biologische materialen om te begrijpen van aspecten zoals veranderingen in organisch materiaal en zoutgehalte van riverine input. Bovendien, de sedimenten geproduceerd met behulp van deze methode kunnen worden gebruikt om te onderzoeken van het effect van potentiële storm herwerken op floc-coherence door remixen of agitatie. Door rechtstreekse meting van cyanobacteriën cel concentratie met visuele beelden in paren rangschikken, dit protocol overstijgt de traditionele toepassingen van cyanobacteriën/klei flocculatie processen en voorziet in deze processen moeten worden toegepast op sedimentologische modellering van de rock-record.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen dankbaar financiering uit de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (05448, 165831 en 213411).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cyanobacteria (in this study: Synechococcus sp. PCC 7002 and Synechocystis sp. PCC 6803) | Pasteur Culture Collection | PCC 7002 or PCC 6803 | used to inoculate the plates |
| agar | Thermo Scientific | CM0003 | used to fill two petri dishes |
| Petri plates (standard bacteriology, 100 x 15 mm) | Sarstedt | 82.1473.001 | 2 required |
| 1 L heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-125 | 1 required |
| 250 mL heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-250 | 1 required |
| Nichrome inoculating loop with handle | Fisher Scientific | 14-956-103 | 1 required |
| tinfoil | Reynolds Wrap Aluminum Foil | 89079-067 | 50 cm required; used to cover foam stopper and neck of erlenmeyer flasks |
| growth media (e.g. A+) | 1050 mL required; produced using composition described in tables 1-4 | ||
| Bunsen Burner | Fisher Scientific | S95941 | 1 required |
| plastic tubing | Fisher Scientific | S504591 | 1 m required; used to create the bubbling apparatus |
| sponge stopper | Jaece Industries Inc | 14-127-40E | 1 required; hole made in center for pipette; used for constructin the bubbling apparatus |
| acrylic sheet | Home Depot | Optix clear acrylic sheet model # MC-102S | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| clear waterproof silicone adhesive | Home Depot | Loctite clear silicone model # 908570 | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| camera or video recorder | Panasonic | HC-V770 HD camcorder | 1 required |
| tripod | Magnus | VT-300 | 1 required |
| black cloth | primomart | EAN 0726670162199; Part number 680254blacknappedfr | 1 required; duvetyne light block-out cloth; approximatly 152 x 213 cm to cover tank experiment |
| heat resistant serological pipet | corning incorporated C708510 | 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus |
| sample vials | Dynalon | S30467 | at least 12 (will vary with time interval chosen) |
| heat resistant glass pipette | Fisher Scientific | Corning Incorporated C708510, 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus; Polystyrene serological pipet would also work, but should be connected to the tubing and stopper after the rest of the apparatus is autoclaved. |
| microcentrifuge | Eppendorf | 22 62 120-3 | 1 required;Comparable products may be used if capable of centrifuging 1.5 -2 mL microfuge tubes at 13,000 x g |
| vortex machine (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries, Inc | SI-0236 | 1 required |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-500 SDS | at least 12 mL (1mL per sample) required; Caution: Flammable, toxic. Wear gloves and safety glasses. Do not use or store near ignition source. Alternate sources may be used. |
| cuvettes (1.6 mL, polystyrene) | Sarstedt | 67.742 | at least 12 required |
| spectrophotometer | Fisher Scientific | 222-271600 | 1 required; Pharmacia Biotech Novaspec ll could also be used. |
| light bulbs | Home Depot | model # 451807; internet #205477895; store SKU #1001061538 | 6-8 bulbs required to provide light for the tank experiments |
| pipette (Pipetman Classic P1000 | Gilson | F123602 | used to collect samples |
| 37 % Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Caution: Corrosive and toxic. Wear lab coat, safety glasses and acid-resistant gloves while using. Prepared to 4 N before use by dilution into deionized water in a chemical fumehood. |
| Foam stopper (small) | Canlab | T 1385 | |
| Foam stopper (large) | Canlab | T 1387 | Requires some intact stoppers and some with a single hole through the centre |
| 30 °C incubator/growth room with continuous illumination | 1 required | ||
| 70 % Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 30 mL required;Caution: Toxic and flammable. Wear lab coat and safety glasses |
| hydrophobic air filter (Midisart 2000, 0.2 µm) | Sartorius | 17805 | 1 required |
| clay (e.g. kaolin) | Fisher Scientific | MFCD00062311 | at least 50 g required |
| microfuge tubes (2 mL, polypropylene) | Sarstedt | 72.695.500 | Comparable products may be used. At least 12 (will vary with time interval chosen) |
| 1000 µL pipet tips | Sarstedt | 70.762 | 1 required |
References
- Macquaker, H. S., Keller, M. A., Davies, S. J. Algal blooms and "marine snow": mechanisms that enhance preservation of organic carbon in ancient fine-grained sediments. J. Sediment. Res. 80, 934-942 (2010).
- Tyson, R. V. Sedimentation rate, dilution, preservation and total organic carbon: some results of a modeling study. Org. Geochem. 32, 333-339 (2001).
- Piper, D. Z., Calvert, S. E. A marine biogeochemical perspective on black shale deposition. Earth-Sci. Rev. 95, 63-96 (2009).
- Sengco, M. R., Li, A. S., Tugend, K., Kulis, D., Anderson, D. M. Removal of red- and brown-tide cells using clay flocculation I. Laboratory culture experiments with Gymnodiniumbreve and Aureococcus anophagefferens. Mar. Ecol. Prog. Ser. 210, 41-53 (2001).
- Guenther, M., Bozelli, R. Factors influencing algae-clay aggregation. Hydrobiologia. 523, 217-223 (2004).
- Archambault, M. -C., Grant, J., Bricelj, V. M. Removal efficiency of the dinoflagellate Heterocapsa triquetra by phosphatic clay and implications for the mitigation of harmful algal blooms. Mar. Ecol. Prog. Ser. 253, 97-109 (2003).
- Beaulieu, S. E., Sengco, M. R., Anderson, D. M. Using clay to control harmful algal blooms: deposition and resuspension of clay/algal flocs. Harmful Algae. 4, 123-138 (2005).
- de Magalhães, L., Noyma, N., Furtado, L., Mucci, M., van Oosterhout, F., Husza, V., Marinho, M., Lürling, M. Efficacy of coagulants and ballast compounds in removal of cyanobacteria (Microcystis) from water of the tropical lagoon Jacarepaguá (Rio de Janeiro, Brazil). Estuaries and Coasts. 40, 121-133 (2017).
- Li, L., Pan, G. A universal method for flocculating harmful algal blooms in marine and fresh waters using modified sand. Environ. Sci. Tech. 47, 4555-4562 (2013).
- Miranda, M., Noyma, N., Pacheco, F. S., de Magalhães, L., Pinto, E., Santos, S., Soares, M., Huszar, V., Lürling, M., Marinho, M. The efficiency of combined coagulant and ballast to remove harmful cyanobacterial blooms in a tropical shallow system. Harmful Algae. 65, 27-39 (2017).
- Pan, G., Chen, J., Anderson, D. Modified local sands for the mitigation of harmful algal blooms. Harmful Algae. 10, 381-387 (2011).
- Shi, W., Tan, W., Wang, L., Pan, G. Removal of Microcystis aeruginosa using cationic starch modified soils. Water Research. 97, 19-25 (2016).
- Du, J., Pushkarova, R. A., Smart, R. A cryo-SEM study of aggregate and floc structure changes during clay settling and raking processes. Int. J. Miner. Process. 93, 66-72 (2009).
- A+ Medium Recipe, 2017. UTEX Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin. , Available from: http://web.biosci.utexas.edu/utex/Media%20PDF/a%20plus%20medium.pdf (2017).
- Stevens, S. E., Porter, R. D. Transformation in Agmenellum quadruplicatum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 6052-6056 (1980).
- Owttrim, G. W. RNA helicases in cyanobacteria: biochemical and molecular approaches. Methods Enzymol. 511, 385-403 (2012).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. Microbiology. 111, 1-61 (1979).
- Chamot, D., Owttrim, G. W. Regulation of cold shock-induced RNA helicase gene expression in the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol. 182, 1251-1256 (2000).
- Sutherland, B. R., Barrett, K. J., Gingras, M. K. Clay settling in fresh and salt water. Environ. Fluid Mech. 15, 147-160 (2014).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 975, 384-394 (1989).
- Liu, Y. X., Alessi, D. S., Owttrim, G. W., Petrash, D. E., Mloszewska, A. M., Lalonde, S. V., Martinez, R. E., Zhou, Q. X., Konhauser, K. O. Cell surface reactivity of Synechococcus sp. PCC 7002: implications for metal sorption from seawater. Geochim. Cosmochim. Acta. 169, 30-44 (2015).
- Playter, T., Konhauser, K., Owttrim, G., Hodgson, C., Warchola, T., Mloszewska, A. M., Sutherland, B., Bekker, A., Zonneveld, J. -P., Pemberton, S. G., Gingras, M. Microbe-clay interactions as a mechanism for the preservation of organic matter and trace metal biosignatures in black shales. Chem Geol. 459, 75-90 (2017).
- Verspagen, J. M. H., Visser, P. M., Huisman, J. Aggregation with clay causes sedimentation of the buoyant cyanobacteria Microcystis spp. Aquat. Microb. Ecol. 44, 165-174 (2006).
- Avnimelech, Y., Troeger, B. W., Reed, L. W. Mutual flocculation of algae and clay: evidence and implications. Science. 216, 63-65 (1982).
- Chen, L., Men, X., Ma, M., Li, P., Jiao, Q., Lu, S. Polysaccharide release by Aphanothece halophytica inhibits cyanobacteria/clay flocculation. J. Phycol. 46, 417-423 (2010).
- Pan, G., Zhang, M. -M., Chen, H., Zou, H., Yan, H. Removal of cyanobacterial blooms in Taihu Lake using local soils. I. Equilibrium and kinetic screening on the flocculation of Microcystis aeruginosa using commercially available clays and minerals. Environ. Poll. 141, 195-200 (2006).
