Summary
बातचीत और मिट्टी और समुद्री क्षेत्र के भीतर बैक्टीरियल कोशिकाओं के अवसादन, प्राकृतिक वातावरण में मनाया, सबसे अच्छा एक नियंत्रित प्रयोगशाला वातावरण में जांच की जा सकती है । यहां, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल है, जो क्ले और cyanobacterial floccules की अवसादन दर को मापने के लिए एक उपंयास विधि रूपरेखा का वर्णन ।
Abstract
ठीक सुक्ष्म, कार्बनिक-युक्त तलछट के जमाव underpinning तंत्र अभी भी काफी हद तक बहस कर रहे हैं । विशेष रूप से, प्रतिक्रियाशील के साथ मिट्टी के कणों की बातचीत के प्रभाव, अवसादी रिकॉर्ड करने के लिए planktonic cyanobacterial कोशिकाओं का अध्ययन किया जा रहा है । इस बातचीत के लिए एक संभावित प्रमुख योगदान है । एक प्रयोगशाला की स्थापना के भीतर, इन सामग्रियों की flocculation और अवसादन दर की जांच की जा सकती है और एक नियंत्रित वातावरण में मापा जा सकता है । यहां, हम विस्तार cyanobacterial/मिट्टी के मिश्रण के अवसादन दर को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल । यह पद्धति दो नमूना प्रयोगों के वर्णन के माध्यम से प्रदर्शित किया जाता है: पहला उपयोग करता है kaolin (kaolinite के एक निर्जलित रूप) और Synechococcus सपा. पीसीसी ७००२ (एक मरीन coccoid cyanobacteria), और दूसरा उपयोग kaolin और Synechocystis सपा । पीसीसी ६८०३ (एक मीठे पानी coccoid cyanobacteria) । Cyanobacterial संस्कृतियों एक विशेष रूप से डिजाइन टैंक सतत, वास्तविक समय वीडियो और फोटो रिकॉर्डिंग की अनुमति के लिए अनुकूलित उपकरण के भीतर मिट्टी की मात्रा के साथ मिश्रित कर रहे हैं । नमूना प्रक्रियाओं के रूप में अच्छी तरह से एक के बाद संग्रह प्रोटोकॉल क्लोरोफिल की सटीक माप है जिसमें से cyanobacterial कोशिकाओं के निलंबन में शेष की एकाग्रता निर्धारित किया जा सकता है के लिए विस्तृत रहे हैं । प्रयोगात्मक प्रतिकृति के माध्यम से, एक प्रोफ़ाइल का निर्माण किया है कि अवसादन दर प्रदर्शित करता है ।
Introduction
वर्तमान पर्यावरण की स्थिति और प्रक्रियाओं का उपयोग करने के लिए पिछले बयाना तंत्र का अनुमान लंबे समय sedimentology के एक underpinning किया गया है । जबकि आधुनिक साठा एनालॉग, जैसे काले समुद्र, कार्बनिक के जमाव को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया है अमीर, ठीक दानेदार जमा, प्रयोगशाला प्रयोगों के लिए शेल जमा की उत्पत्ति पर अतिरिक्त प्रकाश शेड की क्षमता है । काले शेल की उत्पत्ति में जांच का एक क्षेत्र जमाव दर और मूल गठन का तंत्र है । परंपरागत रूप से, यह इस बात की कल्पना की गई है कि काले शेल वातावरण में बनते हैं जहां अवसादन दर, प्राथमिक उत्पादकता, और कार्बनिक पदार्थ श्वसन दर तलछट1,2 में कार्बनिक पदार्थ के संरक्षण को बढ़ावा ,3. हालांकि, cyanobacterial और क्ले flocculation की भूमिका काफी हद तक मानी गई है । flocculation का यह तंत्र जैविक-समृद्ध, सुक्ष्म तलछटों के तेजी से जमाव के लिए अनुमति देता है, और कम ऑक्सीजन जरूरत नहीं करता है । इस आधार को ध्यान में रखते हुए, इस प्रोटोकॉल दो लक्ष्यों: 1) cyanobacterial/क्ले floccules की अवसादन दर को मापने, और 2) वास्तविक समय में अवसादन प्रक्रिया कल्पना । इस पद्धति, geochemical विश्लेषण के अलावा, को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि cyanobacterial/वास्तव में शेल गठन1के लिए एक महत्वपूर्ण तंत्र हो सकता है flocculation । जबकि मूल रूप से मॉडलिंग शेल के लिए इरादा, इस विधि ऐसे जीव विज्ञान और पर्यावरण remediation के रूप में अंय विषयों के लिए लागू है, जहां बैक्टीरियल चयापचय और जनसंख्या पर मिट्टी इनपुट के प्रभाव को मापा जा जरूरत है ।
कई अध्ययनों cyanobacteria और मिट्टी के flocculation का निरीक्षण करने के लिए आयोजित किया गया है, हानिकारक मनोरथ खिलता है के लिए2,3,4,5,6,7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 1 2. हालांकि, समय के साथ कोशिका एकाग्रता को मापने, इन अध्ययनों cyanobacteria/क्ले flocculation रॉक रिकॉर्ड के जमाव मॉडलिंग करने के लिए लागू नहीं किया है । जैसे, इन अध्ययनों से एक दृश्य घटक है, जो महत्वपूर्ण हो सकता है जब मॉडलिंग पिछले sedimentological प्रक्रियाओं की कमी है । इसके अतिरिक्त, अध्ययन के बहुमत सेल की गिनती का उपयोग (जैसे, पैन एट अल। 11), जो श्रमसाध्य हो सकता है । हमारे विधि, cyanobacterial flocculation को मापने में हाल ही में अग्रिम के साथ, क्लोरोफिल एक (Chl एक) असतत समय अंतराल पर मापने के द्वारा cyanobacterial कोशिका एकाग्रता में परिवर्तन निर्धारित करता है । Chl युग्मन दृश्य डेटा के साथ एक माप एक नया तरीका है, जिसका उपयोग करने के लिए जमाव की स्थिति का अनुमान किया जा सकता है । उत्पंन छवियां भी ड्यू एट अलसे काम करने के बाद अवसादन दर की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । 13. दृश्य और संख्यात्मक आंकड़ों का संयोजन परिणामों की विश्वसनीयता को मजबूत करता है । इसके अलावा, हम अतिरिक्त मृत बायोमास और मिट्टी के अवसादन के लिए अनुमति प्रोटोकॉल भी मनाया जाएगा रूपरेखा । यह महत्वपूर्ण है जब पिछले sedimentological वातावरण, जहां रहते है और मृत बायोमास सह सकता है पर विचार हुआ है । flocculation के दौरान मृत बायोमास के व्यवहार में अंतर (उदाहरण के लिए, flocculation दर में कमी) संभावित sedimentological निहितार्थ होगा ।
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Protocol
1. Cyanobacterial संस्कृतियों की तैयारी
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तैयारी टीका ठोस मीडिया का उपयोग संस्कृतियों
- अमेरिकन प्रकार culture संग्रह या पाश्चर culture संग्रह से axenic cyanobacterial कक्षों को प्राप्त करें । उदाहरण के लिए, कोशिकीय, मरीन Synechococcus sp. पीसीसी ७००२ पाश्चर संस्कृति संग्रह से प्राप्त किया गया था, इसे इसके बाद Synechococcusके रूप में संदर्भित किया जाएगा ।
- ठोस मीडिया युक्त प्लेटों पर Synechococcus कोशिकाओं को बनाए रखने (एक + तरल मीडिया14 और १.५% आगर15). इन टीका संस्कृतियों के रूप में इसके बाद भेजा जाएगा ।
- 30-50 µmol फोटॉनों एम-2 एस-1,15,18पर प्रदान की सतत प्रकाश के साथ ३२ ± 2 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट्स की मशीन ।
- दोहराएँ कदम 1.1 – 1.3 और एक + मीडिया की जगह BG-1116 के साथ मीठे पानी cyanobacterial प्रजातियों के लिए कदम 1.1.2 में, ऐसे Synechocystis सपा के रूप में. पीसीसी ६८०३16,17, इसके बाद Synechocystis के रूप में संदर्भित । एक + और BG-11 मीडिया की संरचना के लिए 1-4 तालिकाओं को देखें ।
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तरल संस्कृतियों की तैयारी: प्रत्येक टैंक प्रयोग १ ४०० मिलीलीटर cyanobacterial संस्कृति की आवश्यकता है ।
- १ २५० मिलीलीटर और दो 1 एल हीट प्रतिरोधी Erlenmeyer कुप्पी ले लीजिए ।
- एक 4 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड (hcl) समाधान (प्रत्येक कुप्पी के लिए एचसीएल समाधान के 30 मिलीलीटर), आसुत जल के बाद के साथ प्रत्येक कुप्पी कुल्ला ।
चेतावनी: हाइड्रोक्लोरिक एसिड संक्षारक और विषाक्त है । सुनिश्चित करें कि एक प्रयोगशाला कोट, सुरक्षा चश्मे, और एसिड प्रतिरोधी दस्ताने पहना रहे हैं, जबकि 4 एम एचसीएल समाधान का उपयोग कर । एक प्रयोगशाला सिंक में इस कदम प्रदर्शन और 4 एम एचसीएल समाधान के निपटान के बारे में स्थानीय विनियमों का पालन करें - तरल मीडिया (ए + या बीजी-11) के ५० मिलीलीटर के साथ २५० मिलीलीटर कुप्पी भरें । तरल मीडिया की ४०० मिलीलीटर के साथ एक 1 एल कुप्पी भरें (एक + या bg-11) और अंय 1 एल कुप्पी के साथ ६०० मीडिया के एमएल (a + या bg-11) ।
- एक गैस पारगंय फोम डाट के साथ प्रत्येक कुप्पी सील और फोम डाट और टिनफॉईल के साथ कुप्पी गर्दन को कवर किया ।
- १२१ ° c और 25 मिनट के लिए १०० केपीए पर कुप्पी और आटोक्लेव करें । कुप्पी के कमरे के तापमान को ठंडा करने के लिए अनुमति दें ।
- ७०% अल्कोहल के साथ सतह को निष्फल करके एक लामिना फ्लो हूड तैयार करें ।
- एक तार टीका पाश लीजिए, एक Bunsen बर्नर, ठंडा ५० मिलीलीटर तरल मीडिया कुप्पी (कदम 1.2.5 से), और टीका संस्कृति (१.१ कदम से). निष्फल प्रवाह हूड में इन मदों प्लेस ।
- तार टीका पाश एक Bunsen बर्नर की लौ का उपयोग संक्षेप में निष्फल और यह शांत करने के लिए अनुमति देते हैं ।
- cyanobacterial कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए टीका संस्कृति की सतह के साथ शांत पाश खींचें ।
- २५० मिलीलीटर कुप्पी से फोम डाट और पन्नी कैप निकालें (फोम डाट को छूने के बिना) और Erlenmeyer कुप्पी के रिम से गुजरते हुए इसे संक्षेप में ज्वाला के माध्यम से निष्फल करें.
- कुप्पी झुकाव तो मीडिया कुप्पी की गर्दन के पास है और टीका कुप्पी में कोशिकाओं के साथ लेपित पाश डालें । मीडिया में लूप जलमग्न होने के बाद, कक्षों को निकालने के लिए टीका लूप को हिलाएं ।
- टीका लूप निकालें और Bunsen बर्नर लौ का उपयोग कर कुप्पी के होंठ फिर से निष्फल ।
- Erlenmeyer कुप्पी पर फोम डाट और पंनी टोपी की जगह (फोम डाट छू के बिना) ।
- Bunsen बर्नर लौ के भीतर टीका पाश संक्षेप में निष्फल ।
- एक विकास कक्ष तैयार (विकास चैंबर के रूप में संदर्भित) जहां तापमान 30 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा है15,18 और प्रकाश की तीव्रता 30 है-50 µmol फोटॉनों एम-2 एस-1,15,18 . आर्द्रता सक्रिय रूप से नियंत्रित नहीं है ।
- inoculated ५० मिलीलीटर संस्कृति की अनुमति के लिए विकास कक्ष में १५० rpm पर मिलाते हुए, 30 डिग्री सेल्सियस के एक तापमान के साथ बनाए रखा द्वारा मशीन । वाष्पीकरण घाटे को नियंत्रित करने और संक्रमण को रोकने के लिए आंदोलन के दौरान कवर की कुप्पी का मुंह रखें ।
- cyanobacterial संस्कृति (ओं) को ९६ एच के लिए विकसित करने की अनुमति दें । एक सफल संस्कृति चमकदार हरी प्रकट होना चाहिए और 0.4-0.6 के ७५० एनएम में एक ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) है ।
- एक बार संस्कृति पर्याप्त हो गया है, ५० मिलीलीटर संस्कृति और 1 एल तरल मीडिया के ४०० मिलीलीटर युक्त कुप्पी (कदम 1.2.5 से) लामिना प्रवाह हुड में जगह है । सुनिश्चित करें कि प्रवाह हूड कदम 1.2.6 के बाद निष्फल है ।
- दोहराएं एक लामिना प्रवाह हूड के भीतर दोनों कुप्पी के लिए कदम 1.2.10 ।
- 1 एल कुप्पी में मीडिया के ४०० मिलीलीटर में ५० मिलीलीटर संस्कृति डालो और फिर से Bunsen बर्नर लौ का उपयोग कर 1 एल कुप्पी के होंठ निष्फल ।
- फोम डाट और पन्नी टोपी की जगह में, एक फोम डाट, पिपेट, प्लास्टिक टयूबिंग, लाइन फिल्टर, और पंनी कुप्पी के मुंह को कवर से मिलकर एक बाँझ bubbling उपकरण देते हैं ।
- आंदोलन १५० rpm पर 30 डिग्री सेल्सियस पर 1 एल कुप्पी एक एयर पंप है, जो समाधान के माध्यम से एक humidified हवा मिश्रण परिचालित के साथ संलग्न तंत्र के साथ15,18 पर ३०० मिलीलीटर/
- संस्कृति (ओं) को विकास चैंबर में 30 डिग्री सेल्सियस के भीतर बढ़ने की अनुमति 120 के लिए-168 एच । एक सफल संस्कृति चमकदार हरी दिखाई और एक आयुध डिपो 0.4-0.6 की७५० एनएम होना चाहिए ।
- दोहराएं १.२ कदम एक नियंत्रण संस्कृति है, जो मिट्टी के साथ नहीं मिलाया जाएगा उपज के लिए ।
- मृत बायोमास का उपयोग प्रयोग एक अतिरिक्त कदम की आवश्यकता है । १२१ डिग्री सेल्सियस पर ६० मिनट के लिए 1 एल कुप्पी संस्कृति आटोक्लेव और यह कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं ।
2. प्रायोगिक सेट अप
- फ्लोरोसेंट रोशनी के एक बैंक के सामने एक आयताकार एक्रिलिक टैंक (20 सेमी की लंबाई, ५.१ सेमी की चौड़ाई, और 30 सेमी की ऊंचाई) प्लेस (नौ T8 बल्ब, कम से २,६०० लुमेन; चित्रा 1) 19. शी.
- रोशनी के बैंक और टैंक के माध्यम से चमकता है, जो प्रकाश को फैलाना के बीच एक पारदर्शी, सफेद प्लास्टिक की चादर रखें । यह सेट-अप सदरलैंड एट अल से अनुकूलित किया गया था । 19
- 10 सेमी की ऊंचाई पर एक्रिलिक टैंक मार्क, आधार से खड़ी मापा । सभी माप पानी स्तंभ में इस ऊंचाई पर किया जाना चाहिए सभी नमूने की निरंतरता सुनिश्चित करने के लिए ।
- एक तिपाई, टैंक के सामने 1 मीटर पर एक कैमरा प्लेस प्रत्येक प्रयोग रिकॉर्ड है । एक वीडियो कैमरा छवियों वीडियो फ़ाइलों से निकाला जा सकता है के रूप में सिफारिश की है, और गणितीय मॉडलिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, वीडियो फ़ाइलें गतिशीलता19बसने मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
- प्रकाश बैंक, टैंक, और कैमरे के बाहर प्रकाश स्रोतों से प्रयोग को ढाल के लिए एक काला कपड़ा प्लेस (चित्रा 1) ।
3. Flocculation प्रायोगिक प्रोटोकॉल
- ४०० एमएल कल्चर (स्टेप १.२), एक बड़े एेसे सिलेंडर, और ६०० एमएल के अतिरिक्त ग्रोथ मीडिया को 1 एल कुप्पी (step 1.2.5) में लीजिए ।
- ४०० मिलीलीटर संस्कृति पतला (4 की प्रारंभिक कोशिका एकाग्रता-6 मिलीग्राम/एमएल) अतिरिक्त विकास मीडिया के साथ (एक + या BG-11) के अंतिम खंड 1 एल के लिए स्नातकीय सिलेंडर का उपयोग । ऐक्रेलिक टैंक के लिए इस समाधान जोड़ें ।
- लेबल और उंहें एक्रिलिक टैंक के पास एक सुविधाजनक स्थान में रखकर 2 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों तैयार करो । प्रयोग के लिए मिट्टी के ५० ग्राम उपाय ।
- वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं । एकाधिक प्रयोगों के मामले में, कैमरे से पहले प्रयोग पहचानकर्ता के साथ एक हस्ताक्षर अस्थाई रूप से आयोजित किया जा सकता है ।
- एक पिपेट का प्रयोग, एक 1 मिलीलीटर नमूना ले लो और यह एक लेबल microfuge ट्यूब में जगह है । इस नमूने का उपयोग प्रारंभिक cyanobacterial सेल गणना आयुध डिपो७५० एनएम मूल्यों को मापने के द्वारा निर्धारित करने के लिए । सटीक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए सभी नमूनों को तपसिल में लें ।
- जल्दी डालो मिट्टी (५० ग्राम) जोरदार आंदोलन के साथ टैंक में 10 के लिए एक सरगर्मी छड़ी का उपयोग-15 एस ।
- टाइमर शुरू करें और एक P1000 पिपेट (नमूना समय0) का उपयोग कर एक दृढ़ संकल्प Chl के लिए प्रारंभिक 1 मिलीलीटर नमूना ले ।
- उपयुक्त समय अंतराल पर अतिरिक्त नमूने लें (उदा., 1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, ६० min, १८० min, and २४० min).
- एक बार प्रयोग समाप्त हो गया है, वीडियो फ़ाइल को बचाने के लिए, वीडियो कैमरा बंद है, और एक दृढ़ संकल्प (चरण 4) Chl के लिए सभी नमूनों की प्रक्रिया ।
- आटोक्लेव शेष मिट्टी/cyanobacterial समाधान । cyanobacterial प्रजातियों, स्थानीय विनियमों, और प्रयोगशाला नीति पर निर्भर करता है, उचित तरीकों का उपयोग कर समाधान के निपटान । साबुन और पानी के साथ टैंक साफ, आसुत जल के साथ कुल्ला, और हवा इसे सूखी ।
- कोई क्ले के साथ एक नियंत्रण प्रयोग तैयार जोड़ा । एक ही समय बिंदुओं पर नमूने लेते हैं । इस डेटा की तुलना में अंय प्रयोगात्मक डेटा की पुष्टि करने के लिए कि निपटान दरों मिट्टी के साथ flocculation के कारण बढ़ा रहे हैं, नहीं प्राकृतिक बसने का एक परिणाम कर सकते हैं ।
- अगर मृत बायोमास प्रयोग के दौरान प्रयोग किया जाता है, एक ही प्रयोगात्मक प्रक्रिया का उपयोग करें । हालांकि, समाधान की निपटान प्रक्रिया autoclaving की आवश्यकता नहीं है ।
4. नमूना प्रसंस्करण और मूल्यांकन
- निर्धारित Chl एक Owttrim16से संशोधित प्रक्रिया का उपयोग कर प्रत्येक कोशिका नमूने में एक एकाग्रता । एक बार एकत्र, 3 मिनट के लिए प्रत्येक नमूने से कोशिकाओं गोली १३,००० x जी में कमरे के तापमान पर एक microcentrifuge का उपयोग कर ।
- P1000 पिपेट का उपयोग करके अतिरिक्त मीडिया निकालें और १००% मेथनॉल (20 डिग्री सेल्सियस) के 1 मिलीलीटर जोड़ें । भंवर के लिए पूरी गति से नमूना 1 मिनट के लिए सेल गोली reसस्पेंड ।
चेतावनी: मेथनॉल विषाक्त और ज्वलनशील है । दस्ताने और सुरक्षा चश्मा पहनते हैं, और मेथनॉल प्रज्वलन स्रोतों से दूर रखना । - Chl के निष्कर्षण की सुविधा के लिए 24 घंटे के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन
- मशीन के बाद, ४.१ में वर्णित के रूप में सेलुलर मलबे गोली, एक पिपेट का उपयोग कर एक cuvette के लिए हरी supernatant हस्तांतरण, और spectrophotometer में cuvette जगह है । नमूना 1 मिनट के लिए spectrophotometer में आराम करने के लिए सुनिश्चित करें कि नमूना भीतर किसी भी शेष मिट्टी का निपटारा और माप के साथ हस्तक्षेप नहीं करने की अनुमति दें ।
- ६६५ एनएम और ६५२ एनएम, और आयुध डिपो में ७५० एनएम पर अवशोषण को मापने के द्वारा spectrophotometrically एक एकाग्रता Chl निर्धारित करें । Chl एक एकाग्रता सूत्र का उपयोग कर निर्धारित किया जाता है Chl एक = १६.२९ x (६६५ -आयुध डिपो७५०)-८.५४ x (एक६५२ -आयुध डिपो७५०) 20। Chl एक एकाग्रता कोशिका एकाग्रता के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में प्रयोग किया जाता है । साथ ही, ७.४ x 1010 कक्षों/l = 10g/l21 के एक रूपांतरण कारक कुछ cyanobacterial प्रजातियों के ग्राम में कोशिका एकाग्रता की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
- प्लॉट परिकलित Chl समय बनाम मान ।
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Representative Results
जब मिट्टी के संपर्क में, cyanobacterial कोशिकाओं के निलंबन22से बाहर लाया जाता है । यह प्रतिनिधि यहां दिए गए परिणामों में प्रदर्शित किया जाता है । cyanobacterial आबादी पर मिट्टी के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए और अवसादन दरों का निरीक्षण करने के लिए, दो प्रयोगों का आयोजन किया गया, जिसके दौरान Synechococcus और Synechocystis ५० g/L kaolin क्ले (तालिका 5 – 6से अवगत कराया गया, चित्रा 2– 3). Cyanobacterial संस्कृतियों के रूप में चरण 1 में वर्णित हो गए थे । बाद में, ऊपर टैंक (चरण 2) की स्थापना के बाद, पतला Synechococcus संस्कृति टैंक में डाला गया था और kaolin मिट्टी के ५० जी के साथ मिश्रित चरण 3 निंनलिखित । इस Synechocystis संस्कृति के लिए दोहराया गया था । टैंक में एक ही पोजीशन से सभी नमूने एकत्र किए गए । नमूने संसाधित किए गए थे और आयुध डिपो६५२ और आयुध डिपो६६५ की माप के साथ ही परिकलित Chl एक मान Synechococcus (तालिका 5) और Synechocystis (तालिका 6) के लिए दिया जाता है । इन परिणामों रेखांकन लाइन भूखंडों में प्लॉट किए गए थे और मानकों के परिणामों की तुलना में निर्धारित करने के लिए यदि cyanobacterial/मिट्टी के मिश्रण की दर बसने cyanobacteria के प्राकृतिक बसने की दर से अधिक था ही । इन परिणामों का प्रदर्शन है कि cyanobacterial आबादी निलंबन से बाहर मिट्टी के जोखिम के 10 मिनट (चित्रा 2-3) के भीतर लाया गया । समुद्री Synechococcus ताजा पानी Synechocystis की तुलना में एक और अधिक तेजी से अवसादन दर दिखाया , जो इस परिकल्पना के अनुरूप है कि त्रिसंयोजक cations (विकास माध्यम है, जो नमक के पानी की लवणता नकल में प्रचलित) मिट्टी के कणों और बैक्टीरियल कोशिकाओं के बीच पाटन एजेंट के रूप में कार्य, flocculation की सुविधा और, इसलिए, अवसादन1.
यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि चित्रा 3में, कुछ anomalously उच्च परिणाम हैं, विशेष रूप से डेटा बिंदु 2 पर. यह नमूना संसाधन का एक उदाहरण है जिसके दौरान चरण ४.४ पर्याप्त पीछा नहीं किया गया था और माप के दौरान नमूना पंकिल बन गया है । यह एक कृत्रिम रूप से उच्च परिणाम (चित्रा 2, डेटा बिंदु 2) पैदा करता है । समय श्रृंखला में छवियों का एक उदाहरण है, एक वीडियो से निकाला चित्रा 4में प्रदान की, Playter एट अलसे अनुकूलित कर रहे हैं । 22. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि kaolinite (not kaolin) का इस्तेमाल Playter एट अलमें किया गया था । 22.
चित्रा 1 : व्याख्यात्मक आरेख प्रयोगात्मक सेटअप illustrating । एक वीडियो कैमरा टैंक उपकरण से कम से 1 मीटर की स्थापना की है । टैंक cyanobacteria और तरल मीडिया के 1 एल से भर जाता है । रोशनी पीछे से टैंक रोशन और प्रकाश एक पारदर्शी फिल्म द्वारा फैलाया है । इस पूरे सेट अप एक काले कपड़े के साथ लिपटी को अतिरिक्त प्रकाश स्रोतों को खत्म है । सदरलैंड एट अलसे यह आंकड़ा संशोधित किया गया है । 19. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 : Chl एक सांद्रता तालिका 1 में दिए गए आयुध डिपो मानों से परिकलित की जाती है । ये मान एक Synechococcus/kaolin मिश्रण (yellow) से हैं । Chl के साथ तुलना Synechococcus के लिए एक सांद्रता केवल (नीला) cyanobacterial/मिट्टी के मिश्रण के लिए एक वृद्धि हुई अवसादन दर से पता चलता है । यह आंकड़ा Playter एट अल से संशोधित किया गया है । 22. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: तालिका 2 में दिए गए ओडी मानों से परिकलित सांद्रता Chl । ये मान Synechocystis/kaolin मिक्सचर (yellow) से हैं । Chl के साथ तुलना Synechocystis के लिए एक सांद्रता केवल (नीला) cyanobacterial/मिट्टी के मिश्रण के लिए एक वृद्धि हुई अवसादन दर से पता चलता है । यह आंकड़ा Playter एट अल से संशोधित किया गया है । 22. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4 : Synechococcus-kaolinite साठा का प्रतिनिधि समय पाठ्यक्रम. ये स्नैपशॉट असतत समय अंतराल (1 मिनट) में दर्ज वीडियो से निकाले जाते हैं । यह आंकड़ा Playter एट अल से संशोधित किया गया है । 22. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| के लिए 1 L |
| 18 ग्राम NaCl |
| ०.६ g KCl |
| 1 g नैनो3 |
| 5 छ MgSO4 ∙ 7H2ओ |
| 1 मिलि KH2पो4 |
| ७.२ एमएल CaCl2 |
| १६१ μL न2EDTA |
| 1 मिलि FeCl3 ∙ 6H2ओ |
| 10 मिलीलीटर Tris एचसीएल नं० ८.२ |
| 1 मिलीलीटर P1 धातु स्टॉक * |
तालिका 1: एक + मीडिया के लिए नुस्खा 14 . P1 धातुओं स्टॉक की संरचना के लिए तालिका 2 देखें । यह नुस्खा मीडिया के 1 एल पैदा करता है ।
| 1 एल P1 धातु स्टॉक के लिए |
| ३४.२६ g ज3बो3 |
| ४.३२ g MnCl2 ∙ ज2हे |
| ०.३१५ g ZnCl |
| ०.०३ जी मू3 (८५%) |
| ०.००३ g CuSO4 ∙ 5H2O |
| ०.०१२१५ g CoCl2 ∙ 6H2O |
तालिका 2: P1 धातुओं के लिए नुस्खा एक + मीडिया के लिए आवश्यक स्टॉक ।
| के लिए 1 L |
| 10 मिलीलीटर नैनो3 |
| 1 मिलीलीटर K2HPO4 |
| १ मिलि MgSO४7H२हे |
| १ मिलि CaCl२ २ ज२हे |
| 1 मिलीलीटर साइट्रिक एसिड एच2ओ |
| 1 मिलीलीटर घाट अमोनियम साइट्रेट |
| 1 मिलीलीटर DiNaEDTA |
| 1 मिलीलीटर ना2सह3 |
| 1 मिलीलीटर A5 Microelements * |
तालिका 3: बीजी के लिए नुस्खा-11 मीडिया 16 . A5 Microelements की रचना के लिए तालिका 4 का संदर्भ लें । यह नुस्खा मीडिया के 1 एल पैदा करता है ।
| 1 L के लिए स्टॉक समाधान |
| २.८६ g ज3बो3 |
| १.८१ g MnCl2 4 ज2हे |
| ०.२२२ g ZnSO4 7 ज2हे |
| ०.३९० g ना2मू4 2 ज2हे |
| ०.०७९ g CuSO४ ५ ज२हे |
| ०.४० g CoCl2 6 ज2हे |
तालिका 4: A5 Microelement के लिए नुस्खा BG-11 मीडिया के लिए आवश्यक स्टॉक ।
| नमूना समय (min) | आयुध डिपो ६६५ एनएम | आयुध डिपो ६५२ एनएम | Chl ए (mg/ |
| -1 | ०.५६३ | ०.३७३ | ५.९८६ |
| 0 | ०.४२८ | ०.३३ | ४.१५४ |
| 5 | ०.११२ | ०.०४६ | १.४३२ |
| 10 | ०.०२४ | ०.०३६ | ०.०८४ |
| 15 | ०.०२७ | ०.०२५ | ०.२२६ |
| 30 | ०.००७ | ०.००२ | ०.०९७ |
| ६० | 0 | ०.०६१ | ०.००० |
| १२० | ०.००७ | ०.०६१ | ०.००० |
| १८० | ०.००५ | ०.०१२ | ०.००० |
| २४० | ०.००५ | ०.०१२ | ०.००० |
तालिका 5: आयुध डिपो ६६५ और ओडी ६५२ के लिए माप Synechococcus ५० g/L kaolin क्ले की उपस्थिति में । Chl चरण ४.४ में सूत्र का उपयोग करते हुए मान परिकलित किए जाते हैं । ध्यान रहे कि नमूने t6 और t7 गायब हैं । यह कक्ष नमूना प्रोटोकॉल के अनुसार एक सुसंगत नमूना अंतराल रखने नहीं का एक उदाहरण है । मानक के लिए डेटा Playter, एट अलसे लिया जाता है । (२०१७) 2.
| नमूना समय (min) | आयुध डिपो ६६५ एनएम | आयुध डिपो ६५२ एनएम | Chl ए (mg/ |
| -1 | ०.३८४ | ०.३४५ | ३.३०९ |
| 0 | १.८६३ | १.७३९ | १५.४९७ |
| 5 | ०.६४ | ०.५२८ | ५.९१६ |
| 10 | ०.२१७ | ०.२१६ | १.६९० |
| 15 | ०.१०४ | ०.०८९ | ०.९३४ |
| 30 | ०.१२६ | ०.१६९ | ०.६०९ |
| ६० | ०.४२४ | ०.४०२ | ३.४७४ |
| ९० | ०.११५ | ०.०४८ | १.४६३ |
| १२० | ०.०१६ | ०.००७ | ०.२०१ |
| १८० | ०.०१२ | ०.००४ | ०.१६१ |
| २४० | ०.०११ | ०.००५ | ०.१३६ |
तालिका 6: आयुध डिपो ६६५ और ओडी ६५२ के लिए माप Synechocystis ५० g/L kaolin क्ले की उपस्थिति में। Chl चरण ४.४ में दिए गए सूत्र का उपयोग कर किसी मान की गणना की जाती है ।
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Discussion
Flocculation catalyzed द्वारा cyanobacterial सेल-क्ले इंटरेक्शन पारिस्थितिकी और इंजीनियरिंग के क्षेत्रों में ब्याज की एक बहुत आकर्षित किया है2,3,4,5,6,7 ,8,9,10,11,12, तथापि, तलछट के जमाव की मॉडलिंग की मंशा के साथ इन बातचीत की जांच जमा (जैसे कि शेल) अपेक्षाकृत नया है । इस प्रक्रिया के दृश्य, sedimentological अनुप्रयोगों के लिए इस मामले में, रिपोर्ट नहीं किया गया है । पिछले flocculation अध्ययनों में, इन बातचीत जार, परीक्षण ट्यूबों, या यूरिन में क्ले और cyanobacteria मिश्रण से जांच की गई है, और असतत समय अंतराल पर नमूना9,11,12, 26 समय के माध्यम से सेल एकाग्रता में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए । इन अध्ययनों ने cyanobacterial कोशिकाओं की एकाग्रता को अलग तरीके से मापा है. उदाहरण के लिए, नमूना cyanobacterial कोशिका आबादी एक खुर्दबीन9,11,12,26का उपयोग कर गिनती से मापा गया है. जब प्रारंभिक कोशिका एकाग्रता की तुलना में, हटाने की क्षमता की गणना कर सकते हैं9,11,12,26. एक अलग अध्ययन में, मिट्टी/सेल मिश्रण को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के बाद, ऊपर बसे सेल/मिट्टी तलछट का नमूना लिया गया था और प्रतिदीप्ति के लिए विश्लेषण के लिए निलंबन3में शेष कोशिकाओं की संख्या का अनुमान है । Chl की माप एक सीधे पानी स्तंभ नमूनों से भी सेल एकाग्रता8,10की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
इसके विपरीत, हमारी कार्यप्रणाली समय के साथ निलंबन में कोशिकाओं के उपाय, Sengco, एट अल की कार्यप्रणाली पर निर्माण । 4 प्रक्रिया के दौरान चयन समय पर माप लेने के द्वारा, और वास्तविक समय वीडियो इमेजिंग के साथ इन समय अंतराल बाँधना. जब अंय प्रयोगात्मक anionic flocculants की उपस्थिति में मिट्टी के बसने को शामिल प्रोटोकॉल के साथ तुलना में, या तो जैविक (शैवाल या cyanobacteria) या गैर जैविक (सिंथेटिक flocculent एजेंटों) flocculants का उपयोग कर, हमारे विश्लेषण पर अलग है कई मायने रखता. सबसे पहले, हमारे अध्ययन cyanobacteria के एक समुद्री coccoid प्रजातियों के उपयोग शामिल है, जबकि कई अंय अध्ययनों से ताजा पानी प्रजातियों या प्रजातियों जो extracellular polysaccharide पदार्थ का उत्पादन शामिल5,23,24 , 25. इसके अतिरिक्त, हमारे अध्ययन में एक मानक टैंक का उपयोग शामिल है, जिसके भीतर समाधान स्थिर रहता है । परीक्षण ट्यूबों या3,12,14 या flume टैंक, जहां द्रव प्रवाह6,7ब्याज की एक चर है सिलिंडरों का उपयोग किया अध्ययन के साथ यह विरोधाभासों । हमारे प्रयोगात्मक विधि की स्थैतिक प्रकृति आधारभूत अवसादन दर की माप के लिए अनुमति देता है, जहां floccules अशांत प्रवाह द्वारा निलंबन में नहीं रखा जाता है । इसके अतिरिक्त, एक टैंक का उपयोग कर के बजाय एक परीक्षण ट्यूब, जार, या चोंच, क्योंकि फ्लैट टैंक पक्षों के परिणामी जमा के बेहतर दृश्य के लिए अनुमति देता है; वीडियो छवियों curving के कारण कोई विकृति दिखाने के लिए और प्रकाश समान रूप से फैला हुआ है । तीसरा, पद्धति के स्पेसिफिकेशंस दोनों कम (2 मिनट अंतराल) और लंबी (घंटे के अंतराल) अवधि से अधिक flocculation दरों उपायों वर्णित; इसके अतिरिक्त, छवियों मिनट के लिए सेकंड के तराजू पर संकलित किया जा सकता है, प्रक्रिया के दोनों दृश्य की अनुमति है, और बसने दर का एक अतिरिक्त माप । अधिकांश अध्ययनों को मापने flocculation दर आधे से अधिक पूर्ण घंटे अंतराल के लिए5,6,23,25 या बस एक ही समय बिंदु के बाद निलंबन में छोड़ दिया कोशिकाओं की अंतिम संख्या को मापने (2 – २.५ ज)9,24, हालांकि कुछ अध्ययन9 सेल में परिवर्तन मापा या 2 मिनट के अंतराल पर एक एकाग्रता Chl है । नमूना चुना अंतराल महत्वपूर्ण है, के रूप में flocculation तेजी से हो सकता है (5 – 10 मिनट के भीतर)22. अंत में, हमारी कार्यप्रणाली की एक बड़ी ताकत यह है कि यह flocculation प्रक्रिया का वास्तविक समय छवियों का उत्पादन करता है, केवल उत्पादित समुच्चय का नहीं (उदा., Avnimelech एट अल., १९८२)24. डेटा की दो लाइनें होने, नमूना और दृश्य सबूत से सेल एकाग्रता, परिणामों की विश्वसनीयता को मजबूत और मजबूत निष्कर्ष का समर्थन करता है.
जबकि मिट्टी और cyanobacteria की flocculation दरों को मापने के लिए उपयुक्त है, हमारे प्रोटोकॉल के साथ परिश्रम की आवश्यकता है टैंक के भीतर नमूना स्थान का संबंध है । टैंक का एक ही क्षेत्र (एक्स, वाई, जेड) हर बार नमूना होना चाहिए या नमूना परिणाम टेढ़ा हो सकता है । देखभाल भी सभी कण से पहले ओडी माप किया जाता है बसने की अनुमति के लिए लिया जाना चाहिए । महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं: मैं) एक उचित नमूना अंतराल जो सभी प्रयोगों के लिए संगत रहता है का उपयोग कर, और द्वितीय) सुनिश्चित करना है कि मिट्टी/cyanobacterial गोली पर्याप्त मेथनॉल के अलावा के लिए पर्याप्त निष्कर्षण सुनिश्चित करने के बाद टूट गया है कोशिकाओं से क्लोरोफिल ।
यहां बताई गई तकनीक भी पूरी तरह oxygenated परिस्थितियों के तहत flocculation मॉडलिंग तक सीमित है । प्रायोगिक तंत्र और प्रक्रिया के लिए anoxic नीचे पानी के साथ एक स्तरीकृत जल कॉलम मॉडल को संशोधित करने की आवश्यकता होगी ।
sedimentological संदर्भ के भीतर, इस विधि के लिए विभिंन मिट्टी के अनुपात या जैविक सामग्री की मॉडलिंग जमा करने के लिए लागू होने की क्षमता है ताकि कार्बनिक पदार्थ और riverine इनपुट से लवणता में परिवर्तन के रूप में पहलुओं को समझने के लिए । इसके अलावा, इस विधि का उपयोग कर उत्पादित तलछट floc पर फिर से तैयार करने के लिए संभावित तूफान के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है-मिश्रण या आंदोलन से जुटना । दृश्य छवियों के साथ cyanobacterial सेल एकाग्रता के प्रत्यक्ष माप बाँधना द्वारा, इस प्रोटोकॉल cyanobacteria के पारंपरिक अनुप्रयोगों का अतिक्रमण/क्ले flocculation प्रक्रियाओं और इन प्रक्रियाओं के लिए अनुमति देता है के लिए लागू करने के लिए sedimentological रॉक रिकॉर्ड की मॉडलिंग ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक कृतज्ञता कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (०५४४८, १६५८३१ और २१३४११) से धन स्वीकार करते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cyanobacteria (in this study: Synechococcus sp. PCC 7002 and Synechocystis sp. PCC 6803) | Pasteur Culture Collection | PCC 7002 or PCC 6803 | used to inoculate the plates |
| agar | Thermo Scientific | CM0003 | used to fill two petri dishes |
| Petri plates (standard bacteriology, 100 x 15 mm) | Sarstedt | 82.1473.001 | 2 required |
| 1 L heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-125 | 1 required |
| 250 mL heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-250 | 1 required |
| Nichrome inoculating loop with handle | Fisher Scientific | 14-956-103 | 1 required |
| tinfoil | Reynolds Wrap Aluminum Foil | 89079-067 | 50 cm required; used to cover foam stopper and neck of erlenmeyer flasks |
| growth media (e.g. A+) | 1050 mL required; produced using composition described in tables 1-4 | ||
| Bunsen Burner | Fisher Scientific | S95941 | 1 required |
| plastic tubing | Fisher Scientific | S504591 | 1 m required; used to create the bubbling apparatus |
| sponge stopper | Jaece Industries Inc | 14-127-40E | 1 required; hole made in center for pipette; used for constructin the bubbling apparatus |
| acrylic sheet | Home Depot | Optix clear acrylic sheet model # MC-102S | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| clear waterproof silicone adhesive | Home Depot | Loctite clear silicone model # 908570 | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| camera or video recorder | Panasonic | HC-V770 HD camcorder | 1 required |
| tripod | Magnus | VT-300 | 1 required |
| black cloth | primomart | EAN 0726670162199; Part number 680254blacknappedfr | 1 required; duvetyne light block-out cloth; approximatly 152 x 213 cm to cover tank experiment |
| heat resistant serological pipet | corning incorporated C708510 | 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus |
| sample vials | Dynalon | S30467 | at least 12 (will vary with time interval chosen) |
| heat resistant glass pipette | Fisher Scientific | Corning Incorporated C708510, 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus; Polystyrene serological pipet would also work, but should be connected to the tubing and stopper after the rest of the apparatus is autoclaved. |
| microcentrifuge | Eppendorf | 22 62 120-3 | 1 required;Comparable products may be used if capable of centrifuging 1.5 -2 mL microfuge tubes at 13,000 x g |
| vortex machine (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries, Inc | SI-0236 | 1 required |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-500 SDS | at least 12 mL (1mL per sample) required; Caution: Flammable, toxic. Wear gloves and safety glasses. Do not use or store near ignition source. Alternate sources may be used. |
| cuvettes (1.6 mL, polystyrene) | Sarstedt | 67.742 | at least 12 required |
| spectrophotometer | Fisher Scientific | 222-271600 | 1 required; Pharmacia Biotech Novaspec ll could also be used. |
| light bulbs | Home Depot | model # 451807; internet #205477895; store SKU #1001061538 | 6-8 bulbs required to provide light for the tank experiments |
| pipette (Pipetman Classic P1000 | Gilson | F123602 | used to collect samples |
| 37 % Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Caution: Corrosive and toxic. Wear lab coat, safety glasses and acid-resistant gloves while using. Prepared to 4 N before use by dilution into deionized water in a chemical fumehood. |
| Foam stopper (small) | Canlab | T 1385 | |
| Foam stopper (large) | Canlab | T 1387 | Requires some intact stoppers and some with a single hole through the centre |
| 30 °C incubator/growth room with continuous illumination | 1 required | ||
| 70 % Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 30 mL required;Caution: Toxic and flammable. Wear lab coat and safety glasses |
| hydrophobic air filter (Midisart 2000, 0.2 µm) | Sartorius | 17805 | 1 required |
| clay (e.g. kaolin) | Fisher Scientific | MFCD00062311 | at least 50 g required |
| microfuge tubes (2 mL, polypropylene) | Sarstedt | 72.695.500 | Comparable products may be used. At least 12 (will vary with time interval chosen) |
| 1000 µL pipet tips | Sarstedt | 70.762 | 1 required |
References
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