Summary
Samspelet och sedimentering av lera och bakterieceller inom den marina sfären, observerats i naturliga miljöer, kan undersökas bäst i en kontrollerad laboratoriemiljö. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll, som skisserar en ny metod för att mäta sänkan av lera och Cyanobakterie floccules.
Abstract
De mekanismer som ligger till grund för nedfall av finkornig, debatteras rika organiska sediment fortfarande till stor del. Specifikt studeras under effekterna av samspelet mellan lera partiklar med reaktiva, plankton Cyanobakterie celler i sedimentära posten. Denna interaktion är en potentiellt viktig bidragsgivare till skiffer depositional modeller. Inom en lab miljö, kan flockning och sedimentation andelen dessa material undersökas och mätt i en kontrollerad miljö. Här, detalj vi ett protokoll för mätning av sänkningsreaktion Cyanobakterie/lera blandningar. Denna metod demonstreras genom en beskrivning av två exempelexperiment: först använder kaolin (en uttorkad form av lermineralet) och Synechococcus sp. PCC 7002 (en Marina kockoida cyanobakterier), och andra använder kaolin och Synechocystis sp. PCC 6803 (en sötvatten kockoida cyanobakterier). Cyanobakterie kulturer blandas med varierande mängder lera inom en specialdesignad tank apparatur optimerad för att möjliggöra kontinuerlig, realtid video och fotografiska inspelning. Provtagningsförfaranden som beskrivs liksom ett efter samling protokoll för exakt mätning av klorofyll en som koncentrationen av Cyanobakterie celler kvar i suspension kan bestämmas. Genom experimentella replikering byggs en profil som visar sänkan.
Introduction
Med nuvarande miljöförhållanden och processer för att härleda förbi depositional mekanismer har länge varit en underbyggnaden av sedimentologi. Medan moderna depositional analoger, såsom svarta havet, har använts för att förstå nedfall av rika organiska, finkornig insättningar, har laboratorieexperiment potential att sprida ytterligare ljus över beskärningen av skiffer inlåning. Ett område av förfrågningen i uppkomsten av svart skiffer är den insvetstal och mekanismen av ursprungliga bildandet. Traditionellt, det har varit en hypotes om att svart skiffer bildade i miljöer där den sänkan, primär produktivitet och organiskt respiration priser främja bevarandet av organiskt material i sediment1,2 ,3. Dock rollen som Cyanobakterie och lera flockning har till stor del återstod unconsidered. Denna mekanism för flockning skulle möjliggöra snabb deponering av rika organiska, finkorniga sediment förekommer, och nödvändiggör inte låg syrehalt. Med tanke på denna premiss, detta protokoll har två mål: 1) Mät sänkningsreaktion Cyanobakterie/lera floccules, och 2) visualisera sedimentering processen i realtid. Har använt denna metod, förutom geokemisk analys, att demonstrera denna Cyanobakterie/lera flockning kan faktiskt vara en viktig mekanism för skiffer bildandet1. Medan ursprungligen avsedd för modellering skiffer nedfall, är denna metod tillämplig på andra discipliner såsom biologi och miljöåterställning där påverkan av lera input på bakteriell ämnesomsättning och befolkningen behöver mätas.
Ett flertal studier har genomförts för att iaktta flockning av cyanobakterier och lera, för att lindra skadliga algblomningar2,3,4,5,6,7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 1 2. När du mäter cell koncentration över tid, dessa studier har tillämpas dock inte cyanobakterier/lera flockning modellering nedfall av posten rock. Som sådan, saknar dessa studier en visuell komponent, som kan vara avgörande när modellering förbi sedimentologiska processer. Dessutom majoriteten av studierna utnyttja cell-räkna (t.ex. Pan et al. 11), vilket kan vara mödosam. Vår metod, med senaste framstegen inom mätning Cyanobakterie flockning, bestämmer förändringarna i Cyanobakterie cell koncentration genom att mäta klorofyll en (Chl en) med diskreta intervall. Hopkopplingen av Chl en mätning med visuell data i en ny strategi, som kan användas för att härleda depositional villkor. De bilder som genereras kan också användas för att beräkna sänkan efter arbetet från Du et al. 13. kombinationen av visuell och numeriska data stärker tillförlitligheten i resultaten. Dessutom beskriver vi ytterligare protokoll möjliggör sedimentation av döda biomassa och lera ska också observeras. Detta är viktigt när man överväger förbi sedimentologiska miljöer, där levande och döda biomassa kan ha samtidig uppstått. Skillnader i beteendet hos döda biomassa under flockning (exempelvis minska flockning hastighet) skulle potentiellt få sedimentologiska konsekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förbereda Cyanobakterie kulturer
-
Förbereda inympning kulturerna med solid media
- Skaffa axenic Cyanobakterie celler från den amerikanska typen kultursamling eller Pasteur kultursamling. Till exempel det encelliga, Marina Synechococcus sp. PCC 7002 erhölls från samlingen Pasteur kultur, det kommer att vara härefter hänvisad till som Synechococcus.
- Upprätthålla Synechococcus celler på plåtar som innehåller fasta media (A + flytande media14 och 1,5% agar15). Dessa kommer att vara nedan kallade inympning kulturer.
- Inkubera plattorna vid 32 ± 2 ° C med kontinuerlig ljus på 30 – 50 µmol fotoner m-2 s-1,15,18.
- Upprepa steg 1.1 – 1.3 och ersätta en + media med BG-11-16 i steg 1.1.2 för sötvatten Cyanobakterie arter, såsom Synechocystis sp. PCC 680316,17, härefter hänvisad till som Synechocystis. Se tabellerna 1 – 4 för sammansättningen av A + och BG-11 media.
-
Förbereda flytande kulturer: varje tank experiment kräver en 400 mL Cyanobakterie kultur.
- Samla en 250 mL och två 1 L värmebeständigt Erlenmeyerkolven.
- Skölj varje kolv med en 4 M saltsyra (HCl) lösning (30 mL HCl-lösning för varje kolv), följt av destillerat vatten.
Försiktighet: saltsyra är frätande och giftigt. Se till att en labbrock, skyddsglasögon och syrabeständiga handskar är slitna medan du använder den 4 M HCl-lösningen. Utför det här steget i ett laboratorium handfat och följ lokala bestämmelser avseende avyttring av de 4 M HCl-lösningen - Fyll i 250 mL-kolven med 50 mL flytande media (A + eller BG-11). Fyll en 1 L mätkolv med 400 mL flytande media (A + eller BG-11) och den andra 1 L kolven med 600 mL av media (A + eller BG-11).
- Försegla varje kolv med en propp av gas permeabla skum och täcka skum propp och kolvens hals med aluminiumfolie.
- Etikett och autoklavera kolvar vid 121 ° C och 100 kPa för 25 min. Låt kolvar svalna till rumstemperatur.
- Förbereda en LAF genom sterilisering ytan med 70% alkohol.
- Samla en tråd inympning slinga, en bunsenbrännare, flytande media kyls 50 mL-kolven (från steg 1.2.5) och inympning kulturen (från steg 1.1). Placera dessa objekt i steriliserade flöde huven.
- Sterilisera den Trådögla för inympning kort med lågan av en Bunsen-brännare och låt det svalna.
- Dra cool slingan längs ytan av inympningen kulturen att samla Cyanobakterie celler.
- Ta bort skum propp och folie cap från i 250 mL-kolven (utan att röra skum proppen) och sterilisera kraterrand Erlenmeyerkolven genom att passera det kortfattat genom lågan.
- Luta kolven så media är nära kolven hals och infoga inympning slingan belagd med celler i kolven. När slingan är nedsänkt i media, rör inympning slingan för att ta bort celler.
- Ta bort inympning slingan och resteriliseras läppen av kolven med bunsenbrännare lågan.
- Ersätta skum propp och folie korken på Erlenmeyerkolven (utan att röra den skum proppen).
- Sterilisera inympning slingan kort inom bunsenbrännare lågan.
- Förbereda en tillväxt rum (kallad tillväxt kammaren) där temperaturen hålls vid 30 ° C15,18 och ljusintensiteten är 30 – 50 µmol fotoner m-2 s-1,15,18 . Luftfuktighet kontrolleras inte aktivt.
- Tillåta de inokulerade 50 mL kulturen att ruva genom att skaka på 150 rpm i tillväxt kammaren, med en bibehållen temperatur av 30 ° C. Hålla munnen kolvens täckt under agitationen att styra avdunstningsförluster och förhindra förorening.
- Låt den Cyanobakterie samarbetsrelation att växa för 96 h. En framgångsrik kultur bör visas ljust grön och har en optisk densitet (OD) vid 750 nm 0,4 – 0,6.
- När kulturen har vuxit tillräckligt, placera kulturens 50 mL och 1 L kolven innehållande 400 mL flytande media (från steg 1.2.5) i LAF. Kontrollera flödet huven är steriliserad följande steg 1.2.6.
- Upprepa steg 1.2.10 för båda kolvarna inom en LAF.
- Häll 50 mL kulturen i de 400 mL av media i kolven, 1 L och resteriliseras läppen av 1 L kolven med bunsenbrännare lågan.
- I stället för skum propp och folie GJP, bifoga en steril bubblande apparat bestående av en skum propp, pipett, plaströr, in-line-filter och folie omslag till mynningen av kolven.
- Agitera 1 L kolven vid 150 rpm vid 30 ° C till bubbelflaskan apparater kopplade till en luftpump, som cirkulerar en fuktad luftblandningen genom den lösning15,18 på 300 mL/min.
- Låt den samarbetsrelation växa inom tillväxt kammaren vid 30 ° C i 120 – 168 h. En framgångsrik kultur bör visas ljust grön och har en OD750 nm av 0,4 – 0,6.
- Upprepa steg 1.2 att producera en kontroll kultur, som inte kommer blandas med lera.
- Experiment med döda biomassa kräver ett extra steg. Autoklav 1 L kolven kultur under 60 minuter vid 121 ° C och låt den svalna till rumstemperatur.
2. experimentellt ställa in
- Placera en rektangulär akryl tank (längd 20 cm), bredd 5,1 cm, och höjden 30 cm framför en bank av lysrör (nio T8 lökar, minst 2 600 lumen. Figur 1) 19.
- Placera en genomskinlig, vit plastfolie mellan bank of lights och tanken att sprida det ljus, som skiner igenom tanken. Detta upplägg var anpassad från Sutherland o.a. 19
- Mark i akryl tanken på en höjd av 10 cm, mätt vertikalt från basen. Alla mätningar bör göras på denna höjd i kolumnen vatten att säkerställa enhetlighet i alla provtagning.
- Placera en kamera på ett stativ, 1 m framför tanken att registrera varje experiment. En videokamera rekommenderas som bilder kan extraheras från videofiler, och genom att använda matematisk modellering programvara video-filer kan användas för att modellera lösa dynamics19.
- Placera en svart trasa över ljus bank, tank och kameran att skydda experimentet från utanför ljuskällor (figur 1).
3. flockning experimentellt protokoll
- Samla 400 mL kulturen (steg 1.2), en stor graderad cylinder och 600 mL extra tillväxt medier i en 1 L mätkolv (steg 1.2.5).
- Späd den 400 mL kulturen (initial cell koncentration på 4 – 6 mg/mL) med ytterligare tillväxt medier (A + eller BG-11) till slutlig volym av 1 L med graderade cylindern. Lägg till denna lösning till akryl tank.
- Förbered 2 mL microfuge rör genom märkning och placera dem i ett bekvämt läge nära den akryl tanken. Mått 50 g av lera för experimentet.
- Börja spela in video. När det gäller flera experiment, kan en skylt med identifieraren experiment hållas tillfälligt innan kameran.
- Med pipett ta en 1 mL prov och placera den i en märkt mikrofugrör. Använd det här exemplet för att bestämma det ursprungliga Cyanobakterie celltalet genom att mäta OD750 nm värden. Ta alla prover i tre exemplar att säkerställa korrekta resultat.
- Häll snabbt leran (50 g) i tanken med kraftig agitation med en omrörning pinne för 10 – 15 s.
- Starta timern och ta det inledande 1 mL provet för Chl en bestämning med P1000 pipett (prov tid0).
- Ta extra prover vid lämpliga tidpunkter (t.ex., 1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 60 min, 180 min och 240 min).
- När experimentet är klar, spara videofilen, slå av videokameran och behandla alla prover för Chl en bestämning (steg 4).
- Autoklav återstående lera/Cyanobakterie lösningen. Beroende på Cyanobakterie arter, lokala föreskrifter och regler lab, kassera lösningen med lämpliga metoder. Tanken med tvål och vatten, skölj rengör med destillerat vatten och luft torka den.
- Förbereda en kontroll experiment med ingen lera som lagt till. Ta prov vid samma tidpunkter. Denna data kan jämföras med andra experimentella data att bekräfta att lösa priser förbättras på grund av flockning med lera, inte ett resultat av naturliga lösa.
- Om döda biomassa under experimentet, använda samma experimentell förfarande. Förfarandet för bortskaffande av lösningen kräver dock inte autoklavering.
4. prova bearbetning och utvärdering
- Bestämma Chl en koncentration i varje cell prov med en modifierad från Owttrim16. När samlat, pellet cellerna från varje prov för 3 min vid 13 000 x g använder en mikrocentrifug vid rumstemperatur.
- Ta bort överflödigt material med P1000 pipett och tillsätt 1 mL 100% metanol (20 ° C). Vortex provet vid full fart för 1 min att resuspendera cellpelleten.
Varning: Metanol är giftiga och brandfarliga. Använd skyddshandskar och skyddsglasögon och håll metanol borta från antändningskällor. - Inkubera proverna vid-20 ° C under 24 h att underlätta utvinning av Chl en.
- Efter inkubation, pellets cellulära skräp som beskrivs i 4.1, överföra gröna supernatanten till en kyvetten med pipett och placera kyvetten i spektrofotometern. Låt den vila i spektrofotometern för 1 min så att eventuella återstående lera inom provet kvittar och inte stör mätningen.
- Spektrofotometriskt avgöra Chl en koncentration genom att mäta absorbansen vid 665 nm och 652 nm och OD vid 750 nm. Chl en koncentration bestäms med hjälp av formeln Chl en = 16,29 x (en665 - OD750) - 8,54 x (en652 - OD750) 20. CHL en koncentration används som proxy för cell koncentration. Dessutom en konverteringsfaktor på 7,4 x 1010 celler/L = 10 g/L21 kan användas för att beräkna cellkoncentrationen av i gram av vissa Cyanobakterie arter.
- Rita beräknade Chl en värden kontra tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När de utsätts för lera, förs Cyanobakterie celler av suspension22. Detta framgår i de representativa resultat ges här. Att avgöra effekten av lera på Cyanobakterie populationer och att observera sedimentation rumsavgifter, två experiment utfördes under vilken Synechococcus och Synechocystis utsattes för kaolinlera 50 g/L (tabell 5 – 6, Figur 2– 3). Cyanobakterie kulturer odlades som beskrivs i steg 1. Därefter, efter inställning av tanken (steg 2), var den utspädda Synechococcus kulturen hälls i tanken och blandas med 50 g av kaolinlera efter steg 3. Detta upprepades för den Synechocystis kulturen. Alla prover samlades från samma position i tanken. Proverna bearbetades och mätningar av OD652 och OD665 samt den beräknade Chl ett värden ges för Synechococcus (tabell 5) och Synechocystis (tabell 6). Dessa resultat var plottas grafiskt i rad tomter och jämfört resultaten av standarderna som ska avgöra om lösa Cyanobakterie/lera blandningar var högre än den naturliga lösa av cyanobakterier endast. Dessa resultat visar att Cyanobakterie befolkningarna fördes ur suspension 10 min. lera exponering (figur 2– 3). Den marina Synechococcus visade en snabbare sänkan än sötvatten Synechocystis, vilket är förenligt med hypotesen att trivalenta katjoner (utbredd i odlingsmedium, som härmar salthalten i saltvatten) fungera som överbryggande agenten mellan lera partiklar och bakterieceller, underlätta flockning och sedimentation1.
Det är viktigt att notera att det finns vissa onormalt höga resultat i figur 3, särskilt på data punkt 2. Detta är ett exempel på prov bearbetning under vilket steg 4,4 tillräckligt inte följdes och provet blev grumlig under mätningen. Detta ger ett konstlat höga resultat (figur 2, data punkt 2). Ett exempel på bilder i tidsserier, extraheras från en video finns i figur 4, anpassad från Playter et al. 22. det är viktigt att notera att lermineralet (inte kaolin) användes i Playter et al. 22.
Figur 1 : Förklarande diagram som illustrerar den experimentella setup. En videokamera är inställd på minst 1 m från tank apparaten. Tanken är fylld med 1 L av cyanobakterier och flytande medier. Lamporna tänds tanken bakifrån och ljuset sprids av en genomskinlig film. Hela denna ställa in är draperad med en svart trasa för att eliminera ytterligare ljuskällor. Denna siffra har ändrats från Sutherland et al. 19. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Chl en koncentrationer beräknas utifrån OD-värdena anges i tabell 1. Dessa värden är från en Synechococcus /kaolin blandning (gul). Jämförelse med Chl en koncentrationer för Synechococcus endast (blå) visar en ökad sänkan för Cyanobakterie/lera blandningen. Denna siffra har ändrats från Playter et al. 22. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Chl en koncentrationer beräknas utifrån OD-värdena anges i tabell 2. Dessa värden är från Synechocystis /kaolin blandning (gul). Jämförelse med Chl en koncentrationer för Synechocystis endast (blå) visar en ökad sänkan för Cyanobakterie/lera blandningen. Denna siffra har ändrats från Playter et al. 22. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativa tidsförloppet för Synechococcus-lermineralet nedfall. Dessa ögonblicksbilder extraheras från den inspelade videon med diskreta intervall (1 min). Denna siffra har ändrats från Playter et al. 22. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| För 1 L |
| 18 g NaCl |
| 0,6 g KCl |
| 1 g NaNO3 |
| 5 g MgSO4 ∙ 7 H2O |
| 1 mL KH2PO4 |
| 7,2 mL CaCl2 |
| 161 μL Na2EDTA |
| 1 mL FeCl3 ∙ 6 H2O |
| 10 mL Tris HCl pH 8,2 |
| 1 mL P1 metaller lager * |
Tabell 1: recept för en + media 14 . Se tabell 2 för sammansättningen av P1 metaller lager. Detta recept ger 1 L av media.
| För 1 L P1 metall lager |
| 34.26 g H3BO3 |
| 4.32 g MnCl2 ∙ H2O |
| 0.315 g ZnCl |
| 0.03 g MoO3 (85%) |
| 0,003 g CuSO4 ∙ 5 H2O |
| 0.01215 g CoCl2 ∙ 6 H2O |
Tabell 2: Recept för P1 metaller lager som krävs för en + media.
| För 1 L |
| 10 mL NaNO3 |
| 1 mL K2HPO4 |
| 1 mL MgSO47 H2O |
| 1 mL CaCl2 2 H2O |
| 1 mL citronsyra H2O |
| 1 mL järn (III) ammoniumcitrat |
| 1 mL DiNaEDTA |
| 1 mL Na2CO3 |
| 1 mL A5 mikroelement * |
Tabell 3: recept för BG-11 media 16 . Se tabell 4 för sammansättningen av A5 mikroelement. Detta recept ger 1 L av media.
| För 1 L stamlösning |
| 2.86 g H3BO3 |
| 1,81 g MnCl2 4 H2O |
| 0.222 g ZnSO4 7 H2O |
| 0.390 g Na2MoO4 2 H2O |
| 0.079 g CuSO4 5 H2O |
| 0.40 g CoCl2 6 H2O |
Tabell 4: Recept för A5 Microelement lager krävs för BG-11 media.
| Sample tid (min) | OD 665 nm | OD 652 nm | CHL en (mg/mL) |
| -1 | 0.563 | 0.373 | 5.986 |
| 0 | 0.428 | 0,33 | 4.154 |
| 5 | 0.112 | 0.046 | 1.432 |
| 10 | 0,024 | 0,036 | 0,084 |
| 15 | 0,027 | 0,025 | 0,226 |
| 30 | 0,007 | 0,002 | 0.097 |
| 60 | 0 | 0,061 | 0.000 |
| 120 | 0,007 | 0,061 | 0.000 |
| 180 | 0,005 | 0,012 | 0.000 |
| 240 | 0,005 | 0,012 | 0.000 |
Tabell 5: OD 665 och OD 652 mätningar för Synechococcus i närvaro av 50 g/L kaolinlera. CHL en värden beräknas enligt formeln i steg 4,4. Observera att prover t6 och t7 saknas. Detta är ett exempel på att inte hålla en konsekvent samplingsintervallet enligt protokollet cell provtagning. Data för standard tas från Playter, et al. (2017) 2.
| Sample tid (min) | OD 665 nm | OD 652 nm | CHL en (mg/mL) |
| -1 | 0,384 | 0.345 | 3.309 |
| 0 | 1.863 | 1.739 | 15.497 |
| 5 | 0,64 | 0.528 | 5.916 |
| 10 | 0.217 | 0,216 | 1.690 |
| 15 | 0,104 | 0.089 | 0,934 |
| 30 | 0.126 | 0.169 | 0.609 |
| 60 | 0.424 | 0,402 | 3.474 |
| 90 | 0,115 | 0,048 | 1.463 |
| 120 | 0,016 | 0,007 | 0.201 |
| 180 | 0,012 | 0,004 | 0.161 |
| 240 | 0,011 | 0,005 | 0.136 |
Tabell 6: OD 665 och OD 652 mätningar för Synechocystis i närvaro av 50 g/L kaolinlera. CHL en värden beräknas enligt den formel som anges i steg 4,4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flockning katalyseras av Cyanobakterie cell-lera interaktion har rönt stort intresse inom ekologi och teknik2,3,4,5,6,7 ,8,9,10,11,12, dock utredningen av dessa interaktioner med avsikt av modellering nedfall av sedimentära insättningar (såsom skiffer) är relativt ny. Visualisering av denna process, har i detta fall för sedimentologiska tillämpningar, inte rapporterats. I tidigare flockning studier, har dessa interaktioner undersökts genom att blanda lera och cyanobakterier i burkar, provrör, eller bägare och provtagning i diskret tid intervall9,11,12, 26 att fastställa förändringar i cell koncentration genom tiden. Dessa studier har mätt koncentrationen av Cyanobakterie celler på olika sätt. Exempelvis har de samplade Cyanobakterie cellpopulationer mätts genom att räkna med hjälp av en Mikroskop9,11,12,26. Jämfört med den initiala cellkoncentrationen, kan reningsgrad vara beräknat9,11,12,26. I en separat studie, efter att låta lera/cell blandningen sedimentera, var flytande resterande ovan fast cell/lera sedimenten provtas och analyseras för fluorescens att uppskatta antalet resterande celler i suspension3. Mätningar av Chl en direkt från kolumn vattenprover har också använts för att beräkna cellen koncentration8,10.
Däremot mäter vår metod cellerna i fjädring över tid, bygger på metodiken för Sengco, o.a. 4 av mätningar vid utvalda tillfällen under hela processen, och para ihop dessa tidsintervall med realtid video imaging. När jämfört med andra experimentella protokoll som omfattar reglerandet av lera i närvaro av anjon flockningsmedel, med hjälp av biologiska (alger eller cyanobakterier) eller icke-biologiska (syntetiska flockig agenter) flockningsmedel, vår analys skiljer sig på många räknar. Första innebär vår studie användning av en Marina kockoida arter av cyanobakterier, medan många andra studier innebär sötvatten arter eller arter som producerar extracellulära polysackarid ämnen5,23,24 , 25. Dessutom vår studie innebär användning av en standard tank, inom vilken lösningen förblir statiska. Detta kontrasterar mot studier som gjorts med hjälp av provrör eller cylindrar3,12,14 eller flume tankar, där strömningen är en variabel av intresse6,7. Den statiska karaktären av vår experimentella metod möjliggör mätning av baslinjen sedimentering priser, där floccules inte hålls i suspension av turbulent flöde. Dessutom möjliggör med en tank i stället för ett provrör, burk eller bägare, bättre visualisering av de resulterande insättningarna på grund av de platta tank sidorna; video bilder visar ingen distorsion på grund av svängda och ljuset sprids jämnt. För det tredje, metoden som beskrivs häri åtgärder flockning priser över både kort (2 min intervaller) och långa (timmars intervall) sikt. Dessutom kan bilder sammanställas på skalor sekunder till minuter, så att både visualisering av processen, och en ytterligare mätning av den lösa hastigheten. De flesta studier mäta flockning priser över hälften till hel timme intervall5,6,23,25 eller helt enkelt mått det slutliga antalet celler kvar i suspension efter en enda gång pekar (2 – 2,5 h)9,24, även om vissa studier9 har mätt förändringar i cellen eller Chl en koncentration över 2 minuters intervall. Samplingsintervallet valt är kritisk, eftersom flockning kan uppstå snabbt (inom 5 – 10 min)22. Slutligen, en stor styrka i vår metodik är att den producerar realtidsbilder av flockning processen, inte bara av producerade mängderna (t.ex., Avnimelech et al., 1982)24. Att ha två rader av data, cell koncentration från provtagning och visuella bevis, stärker tillförlitligheten av resultaten och stöder hållbara slutsatser.
Även lämplig för att mäta flockning priser av lera och cyanobakterier, våra protokoll kräver aktsamhet när det gäller provtagning platsen i tanken. Samma område av behållaren (x, y, z) skall provtas varje gång eller provresultaten kan bli sned. Också måste vara försiktig att tillåta alla partiklar sedimentera innan OD mätningar görs. Kritiska steg omfattar: (i) använda lämpliga provtagningsintervall som förblir konsekvent för alla experiment, och ii) att säkerställa att lera/Cyanobakterie pelleten är tillräckligt bruten efter tillsats av metanol att säkerställa adekvat utvinning av klorofyll från cellerna.
Den teknik som beskrivs här är också begränsad till modellering flockning fullt syresatt villkor. De experimentella apparater och förfarandet skulle behöva ändras för att modellera ett stratifierat vattenpelare med syrefria botten vatten.
Inom ramen för sedimentologiska har denna metod potential att tillämpas för modellering insättningar av olika lera nyckeltal eller biologiskt material för att förstå aspekter såsom förändringar i organiskt material och salthalt från riverine input. Dessutom kan de sediment som framställs med denna metod användas för att undersöka effekten av potentiella storm omarbetning på floc-coherence av remixa eller agitation. Genom att para ihop direkt mätning av Cyanobakterie cellkoncentrationen med visuella bilder, detta protokoll överskrider de traditionella tillämpningarna av cyanobakterier/lera flockning processer och möjliggör dessa processer ska tillämpas på sedimentologiska modellering av posten rock.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt finansiering från de naturliga vetenskaperna och Engineering Research Council of Canada (05448, 165831 och 213411).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cyanobacteria (in this study: Synechococcus sp. PCC 7002 and Synechocystis sp. PCC 6803) | Pasteur Culture Collection | PCC 7002 or PCC 6803 | used to inoculate the plates |
| agar | Thermo Scientific | CM0003 | used to fill two petri dishes |
| Petri plates (standard bacteriology, 100 x 15 mm) | Sarstedt | 82.1473.001 | 2 required |
| 1 L heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-125 | 1 required |
| 250 mL heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-250 | 1 required |
| Nichrome inoculating loop with handle | Fisher Scientific | 14-956-103 | 1 required |
| tinfoil | Reynolds Wrap Aluminum Foil | 89079-067 | 50 cm required; used to cover foam stopper and neck of erlenmeyer flasks |
| growth media (e.g. A+) | 1050 mL required; produced using composition described in tables 1-4 | ||
| Bunsen Burner | Fisher Scientific | S95941 | 1 required |
| plastic tubing | Fisher Scientific | S504591 | 1 m required; used to create the bubbling apparatus |
| sponge stopper | Jaece Industries Inc | 14-127-40E | 1 required; hole made in center for pipette; used for constructin the bubbling apparatus |
| acrylic sheet | Home Depot | Optix clear acrylic sheet model # MC-102S | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| clear waterproof silicone adhesive | Home Depot | Loctite clear silicone model # 908570 | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| camera or video recorder | Panasonic | HC-V770 HD camcorder | 1 required |
| tripod | Magnus | VT-300 | 1 required |
| black cloth | primomart | EAN 0726670162199; Part number 680254blacknappedfr | 1 required; duvetyne light block-out cloth; approximatly 152 x 213 cm to cover tank experiment |
| heat resistant serological pipet | corning incorporated C708510 | 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus |
| sample vials | Dynalon | S30467 | at least 12 (will vary with time interval chosen) |
| heat resistant glass pipette | Fisher Scientific | Corning Incorporated C708510, 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus; Polystyrene serological pipet would also work, but should be connected to the tubing and stopper after the rest of the apparatus is autoclaved. |
| microcentrifuge | Eppendorf | 22 62 120-3 | 1 required;Comparable products may be used if capable of centrifuging 1.5 -2 mL microfuge tubes at 13,000 x g |
| vortex machine (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries, Inc | SI-0236 | 1 required |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-500 SDS | at least 12 mL (1mL per sample) required; Caution: Flammable, toxic. Wear gloves and safety glasses. Do not use or store near ignition source. Alternate sources may be used. |
| cuvettes (1.6 mL, polystyrene) | Sarstedt | 67.742 | at least 12 required |
| spectrophotometer | Fisher Scientific | 222-271600 | 1 required; Pharmacia Biotech Novaspec ll could also be used. |
| light bulbs | Home Depot | model # 451807; internet #205477895; store SKU #1001061538 | 6-8 bulbs required to provide light for the tank experiments |
| pipette (Pipetman Classic P1000 | Gilson | F123602 | used to collect samples |
| 37 % Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Caution: Corrosive and toxic. Wear lab coat, safety glasses and acid-resistant gloves while using. Prepared to 4 N before use by dilution into deionized water in a chemical fumehood. |
| Foam stopper (small) | Canlab | T 1385 | |
| Foam stopper (large) | Canlab | T 1387 | Requires some intact stoppers and some with a single hole through the centre |
| 30 °C incubator/growth room with continuous illumination | 1 required | ||
| 70 % Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 30 mL required;Caution: Toxic and flammable. Wear lab coat and safety glasses |
| hydrophobic air filter (Midisart 2000, 0.2 µm) | Sartorius | 17805 | 1 required |
| clay (e.g. kaolin) | Fisher Scientific | MFCD00062311 | at least 50 g required |
| microfuge tubes (2 mL, polypropylene) | Sarstedt | 72.695.500 | Comparable products may be used. At least 12 (will vary with time interval chosen) |
| 1000 µL pipet tips | Sarstedt | 70.762 | 1 required |
References
- Macquaker, H. S., Keller, M. A., Davies, S. J. Algal blooms and "marine snow": mechanisms that enhance preservation of organic carbon in ancient fine-grained sediments. J. Sediment. Res. 80, 934-942 (2010).
- Tyson, R. V. Sedimentation rate, dilution, preservation and total organic carbon: some results of a modeling study. Org. Geochem. 32, 333-339 (2001).
- Piper, D. Z., Calvert, S. E. A marine biogeochemical perspective on black shale deposition. Earth-Sci. Rev. 95, 63-96 (2009).
- Sengco, M. R., Li, A. S., Tugend, K., Kulis, D., Anderson, D. M. Removal of red- and brown-tide cells using clay flocculation I. Laboratory culture experiments with Gymnodiniumbreve and Aureococcus anophagefferens. Mar. Ecol. Prog. Ser. 210, 41-53 (2001).
- Guenther, M., Bozelli, R. Factors influencing algae-clay aggregation. Hydrobiologia. 523, 217-223 (2004).
- Archambault, M. -C., Grant, J., Bricelj, V. M. Removal efficiency of the dinoflagellate Heterocapsa triquetra by phosphatic clay and implications for the mitigation of harmful algal blooms. Mar. Ecol. Prog. Ser. 253, 97-109 (2003).
- Beaulieu, S. E., Sengco, M. R., Anderson, D. M. Using clay to control harmful algal blooms: deposition and resuspension of clay/algal flocs. Harmful Algae. 4, 123-138 (2005).
- de Magalhães, L., Noyma, N., Furtado, L., Mucci, M., van Oosterhout, F., Husza, V., Marinho, M., Lürling, M. Efficacy of coagulants and ballast compounds in removal of cyanobacteria (Microcystis) from water of the tropical lagoon Jacarepaguá (Rio de Janeiro, Brazil). Estuaries and Coasts. 40, 121-133 (2017).
- Li, L., Pan, G. A universal method for flocculating harmful algal blooms in marine and fresh waters using modified sand. Environ. Sci. Tech. 47, 4555-4562 (2013).
- Miranda, M., Noyma, N., Pacheco, F. S., de Magalhães, L., Pinto, E., Santos, S., Soares, M., Huszar, V., Lürling, M., Marinho, M. The efficiency of combined coagulant and ballast to remove harmful cyanobacterial blooms in a tropical shallow system. Harmful Algae. 65, 27-39 (2017).
- Pan, G., Chen, J., Anderson, D. Modified local sands for the mitigation of harmful algal blooms. Harmful Algae. 10, 381-387 (2011).
- Shi, W., Tan, W., Wang, L., Pan, G. Removal of Microcystis aeruginosa using cationic starch modified soils. Water Research. 97, 19-25 (2016).
- Du, J., Pushkarova, R. A., Smart, R. A cryo-SEM study of aggregate and floc structure changes during clay settling and raking processes. Int. J. Miner. Process. 93, 66-72 (2009).
- A+ Medium Recipe, 2017. UTEX Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin. , Available from: http://web.biosci.utexas.edu/utex/Media%20PDF/a%20plus%20medium.pdf (2017).
- Stevens, S. E., Porter, R. D. Transformation in Agmenellum quadruplicatum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 6052-6056 (1980).
- Owttrim, G. W. RNA helicases in cyanobacteria: biochemical and molecular approaches. Methods Enzymol. 511, 385-403 (2012).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. Microbiology. 111, 1-61 (1979).
- Chamot, D., Owttrim, G. W. Regulation of cold shock-induced RNA helicase gene expression in the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol. 182, 1251-1256 (2000).
- Sutherland, B. R., Barrett, K. J., Gingras, M. K. Clay settling in fresh and salt water. Environ. Fluid Mech. 15, 147-160 (2014).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 975, 384-394 (1989).
- Liu, Y. X., Alessi, D. S., Owttrim, G. W., Petrash, D. E., Mloszewska, A. M., Lalonde, S. V., Martinez, R. E., Zhou, Q. X., Konhauser, K. O. Cell surface reactivity of Synechococcus sp. PCC 7002: implications for metal sorption from seawater. Geochim. Cosmochim. Acta. 169, 30-44 (2015).
- Playter, T., Konhauser, K., Owttrim, G., Hodgson, C., Warchola, T., Mloszewska, A. M., Sutherland, B., Bekker, A., Zonneveld, J. -P., Pemberton, S. G., Gingras, M. Microbe-clay interactions as a mechanism for the preservation of organic matter and trace metal biosignatures in black shales. Chem Geol. 459, 75-90 (2017).
- Verspagen, J. M. H., Visser, P. M., Huisman, J. Aggregation with clay causes sedimentation of the buoyant cyanobacteria Microcystis spp. Aquat. Microb. Ecol. 44, 165-174 (2006).
- Avnimelech, Y., Troeger, B. W., Reed, L. W. Mutual flocculation of algae and clay: evidence and implications. Science. 216, 63-65 (1982).
- Chen, L., Men, X., Ma, M., Li, P., Jiao, Q., Lu, S. Polysaccharide release by Aphanothece halophytica inhibits cyanobacteria/clay flocculation. J. Phycol. 46, 417-423 (2010).
- Pan, G., Zhang, M. -M., Chen, H., Zou, H., Yan, H. Removal of cyanobacterial blooms in Taihu Lake using local soils. I. Equilibrium and kinetic screening on the flocculation of Microcystis aeruginosa using commercially available clays and minerals. Environ. Poll. 141, 195-200 (2006).
