Summary
상호 작용 및 찰 흙 및 영역 내에서 해양, 자연적인 환경에서 관찰 된 세균성 세포의 침전 제어 환경에서 최고의 조사 수 있습니다. 여기, 우리는 점토와 cyanobacterial floccules의 침전 속도 측정 하기 위한 새로운 방법을 설명 하는 상세한 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
메커니즘의 세분화 된 증 착을 underpinning, 유기 부유한 앙금은 여전히 크게 논의. 특히, 퇴적암 레코드에 반응, planktonic cyanobacterial 셀과 점토 입자의 상호 작용의 영향 아래 공부 했습니다. 이 상호 작용은 셰 일 depositional 모델에 잠재적으로 큰 기여. 랩 설정 내에서 이러한 물질의 응집 및 침전 속도 검사 고 제어 된 환경에서 측정 될 수 있습니다. 여기, 우리 선발 cyanobacterial/점토 혼합물의 침전 속도 측정 하기 위한 프로토콜. 이 방법론은 두 개의 샘플 실험의 설명을 통해 증명: 고령 토 (kaolinite의 탈수 형태) 및 Synechococcus sp. PCC 7002 (해양 coccoid 박테리아)를 사용 하는 첫 번째 및 두 번째 고령 토 및 를 사용 하 여 Synechocystis sp. PCC 6803 (민물 coccoid 박테리아). Cyanobacterial 문화는 다양 한 양의 연속, 실시간 비디오 및 사진 기록 수 있도록 최적화 된 특별히 고안 된 탱크 장치 내에서 점토와 혼합 됩니다. 샘플링 절차 후 컬렉션 프로토콜의 엽록소는 는 cyanobacterial 세포 현 탁 액에 남아의 농도 결정 될 수 있는 정확한 측정을 위한 뿐만 아니라 자세히 나와 있습니다. 실험적인 복제를 통해 프로필 침전 속도 표시 하는 구성 되어 있습니다.
Introduction
과거의 depositional 메커니즘 유추를 존재 하는 환경 조건 및 프로세스를 사용 하 여 오랫동안 sedimentology underpinning입니다. 검은 바다 같은 현대 depositional 아날로그 유기 풍부한, 세분화 된 예금의 증 착을 이해 하는 것 사용 되었다, 실험실 실험 혈 암 예금의 근원에 추가 해 주실 수가 있다. 검은 혈 암의 창세기에의 한 지역 증 착 속도 및 원래 형성의 메커니즘 이다. 전통적으로, 그것은 되었습니다 가설 검정 shales 침전 속도, 기본 생산성 및 유기 물 호흡 속도 앙금1,2 유기 물질의 보존을 촉진 하는 환경에서 형성 ,3. 그러나, cyanobacterial의 역할 클레이 응집 크게 경솔하게 남아 있다. 응집이이 메커니즘 발생, 유기 풍부한, 세분화 된 앙금의 빠른 증 착에 대 한 허용 및 낮은 산소를 필요로 하지 않는다. 고려이 전제,이 프로토콜은 두 가지 목표: 1) cyanobacterial/클레이 floccules의 침전 속도 측정 하 고 2) 실시간으로 침전 과정을 시각화. 지구 화학 분석 외에이 방법론은 그 cyanobacterial/클레이 응집 사실 셰 일 형성1에 대 한 중요 한 메커니즘 수 있습니다 보여 주기 위해 사용 되었습니다. 원래 셰 일 증 착 모델링을 위한, 하는 동안이 메서드는 생물학, 환경 치료 등 다른 분야에 적용 가능한 세균성 물질 대사 및 인구에 클레이 입력의 영향 측정 될 필요가.
박테리아 및 유해 조류 꽃2,3,,45,6,7 을 완화 하기 위해 점토의 응집을 관찰 수많은 연구를 실시 했습니다. , 8 , 9 , 10 , 11 , 1 그러나 2., 시간이 지남에 따라 세포 농도 측정 하는 동안 이러한 연구에 적용 되지 않은 박테리아/클레이 응집 바위 기록의 증 착 모델링. 따라서, 이러한 연구는 과거의 sedimentological 프로세스 모델링 때 중요 한 될 수 있는 시각적 구성 요소를 부족 합니다. 또한, 연구의 대다수 셀 계산 활용 (예를 들어, 팬 외. 11), 힘 드는 수 있습니다. 측정 cyanobacterial 응집, 최근의 진보와 함께 우리의 방법 측정 하 여 엽록소는 a (Chl a) 이산 시간 간격 cyanobacterial 셀 농도에 변화를 결정 합니다. Chl 시각적 데이터 측정을 페어링 depositional 조건을 유추할 수 사용 될 수 있는 새로운 접근 방식입니다. 생성 된 이미지 또한 뒤 외에서 작업 후 침전 속도 계산에 사용할 수 있습니다. 13. 결과의 신뢰성을 강화 하는 시각 및 숫자 데이터의 조합. 또한, 우리는 관찰도 죽은 바이오 매스와 점토의 침에 대 한 허용 하는 추가적인 프로토콜 개요. 어디 라이브 sedimentological 환경, 과거 고려 때 이것은 중요 하 고 죽은 바이오 매스 공동 발생 할 수 있습니다. 응집 동안 죽은 바이오 매스의 행동에 차이 (예를 들어 응집 속도 감소) sedimentological 의미 있을 것 이다.
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Protocol
1. 준비 Cyanobacterial 문화
-
단단한 미디어를 사용 하 여 접종 문화 준비
- 미국 유형 문화 수집 또는 파스퇴르 문화 컬렉션에서 axenic cyanobacterial 셀을 가져옵니다. 예를 들어 단 세포, 해양 Synechococcus 특검팀 PCC 7002 파스퇴르 문화 컬렉션에서 얻은, 그것은 금 후 Synechococcus으로 참조 됩니다.
- 단단한 미디어 (+ 액체14 와 1.5% agar15)를 포함 하는 접시에 Synechococcus 세포를 유지 합니다. 이 금 후에 접종 문화로 참조 됩니다.
- 30-50 µmol 광자 m-2 s-1,15,18에서 제공 하는 지속적인 빛 32 ± 2 ° C에 접시를 품 어.
- 1.1-1.3 단계를 반복 하 고 + 미디어 단계 1.1.2 민물 cyanobacterial 종,17, Synechocystis 의 sp PCC 6803.16,에서 BG 1116 으로 여기서 언급 바꿉니다 Synechocystis. A + 및 BG-11 미디어의 구성 표 1-4 를 참조 하십시오.
-
액체 문화 준비: 각 탱크 실험 요구 한 400 mL cyanobacterial 문화.
- 한 250 mL 및 두 1 L 내 열 삼각 플라스 크를 수집 합니다.
- 4m 염 산 (HCl) 솔루션 각 플라스 크에 대 한 HCl 솔루션의 (30 mL), 증류수 다음 각 플라스 크를 헹 구 십시오.
주의: 염 산 이며 부식성 독성입니다. 실험실 외 투, 안전 고글, 및 부식 방지 장갑 4 M HCl 솔루션을 사용 하는 동안 착용 하는 확인 하십시오. 실험실 싱크대에이 단계를 수행 하 고 4 M HCl 해결책의 처리에 관한 현지 규정에 따라 - (A + 또는 BG-11) 액체 매체의 50 mL로 250 mL 플라스 크를 채우십시오. (A + 또는 BG-11) 액체 매체의 400 mL와 함께 한 1 L 플라스 크와 미디어 (A + 또는 BG-11)의 600 mL와 다른 1 L 플라스 크를 입력 합니다.
- 가스 투과성 거품 스 토퍼와 함께 각 플라스 크를 밀봉 하 고 은박지를 거품 마 개 및 플라스 크 목 커버.
- 레이블 및 고압 121 ° C와 25 분에 대 한 100 kPa에 플라스 크를 실내 온도에 냉각 플라스 크 허용.
- 70% 알코올로 표면 살 균 하 여 층 류 후드를 준비 합니다.
- 와이어 접종 루프, 분 젠 버너, (1.2.5 단계)에서 냉각된 50 mL 액체 플라스 크와 접종 문화 (에서 단계 1.1)를 수집 합니다. 멸 균된 흐름 후드에 이러한 항목을 놓습니다.
- 짧게 분 젠 버너의 불꽃을 사용 하 여 와이어 접종 루프를 소독 하 고 진정 있습니다.
- 접종 문화 수집 cyanobacterial 셀의 표면에 따라서 쿨 루프를 끕니다.
- (폼 마 개 감동) 없이 250 mL 플라스 크에서 거품 스 토퍼와 호 일 모자를 제거 하 고 불꽃을 통해 간략하게 전달 하 여 삼각 플라스 크의 가장자리를 소독.
- 미디어 플라스 크의 목 근처 이므로 플라스 크를 기울기 고 플라스 크로 셀과 코팅 접종 루프를 삽입 합니다. 루프는 미디어에 빠져들은, 일단 세포 제거를 접종 루프를 저 어.
- 접종 루프를 제거 하 고 다시 분 젠 버너 불꽃을 사용 하 여 플라스 크의 입술을 소독.
- (폼 마 개 감동) 없이 거품 스 토퍼 및 삼각 플라스 크에 호 일 모자를 교체 합니다.
- 분 젠 버너 화 염 내에서 간단히 접종 루프를 소독.
- 준비 (성장 챔버 라고도 함) 성장 방 온도 30 ° C15,18 에 유지와 빛의 강도 30-50 µmol 광자 m-2 s-1,15,18 . 습도 적극적으로 제어 하지.
- 30 ° c.의 유지 온도와 성장 챔버에 150 rpm에서 떨고에 의해 품 어 접종된 50 mL 문화 허용 계속 증발 손실을 제어 하 고 오염을 방지 하기 위해 교 반 동안 덮여 플라스 크의 입.
- 96 h에 대 한 성장 cyanobacterial 문화를 허용 한다. 성공적인 문화 한다 밝은 녹색 표시 그리고 광학 밀도 (OD)에서 750 nm 0.4-0.6의.
- 문화는 충분히 성장 했다, 일단 50 mL 문화와 층 류 두건에서 (1.2.5 단계)에서 액체 미디어의 400 mL를 포함 하는 1 L 플라스 크를 놓습니다. 흐름 후드 소독된 다음 단계 1.2.6 확인 하십시오.
- 층 류 흐름 후드 내에서 두 플라스 크에 대 한 단계 1.2.10를 반복 합니다.
- 1 L 플라스 크에 미디어의 400 mL 50 mL 문화 부 어 하 고 다시 분 젠 버너 불꽃을 사용 하 여 1 L 플라스 크의 입술을 소독.
- 거품 스 토퍼 및 호 일 모자 대신 폼 마 개, 피 펫, 플라스틱 튜브, 인라인 필터 구성 된 살 균 버블링 장치를 부착 하 고 플라스 크의 입에 덮개를 호 일.
- 300 mL/min에서 솔루션15,18 통해 습도 공기 혼합물을 회람 하는 공기 펌프에 연결 된 bubbler 기구와 30 ° C에서 150 rpm에서 1 L 플라스 크를 교 반 하십시오.
- 120-168 h 30 ° C에서 성장 챔버 내 성장 문화를 허용 한다. 성공적인 문화 밝은 녹색을 표시 해야한다 고는 OD750 nm 0.4-0.6의.
- 점토와 혼합 되지 것입니다 제어 문화를 생산 하는 1.2 단계를 반복 합니다.
- 죽은 바이오 매스를 사용 하 여 실험 한 추가 단계가 필요 합니다. 오토 클레이 브 1 L 플라스 크 121 ° C에서 60 분에 대 한 문화 고 실내 온도에 냉각.
2. 실험 설정
- 형광등 (9 T8 전구, 적어도 2600 루멘;의 은행 앞 (길이 20 cm의), 30 cm의 5.1 c m의 너비와 높이 직사각형 아크릴 탱크 배치 그림 1) 19.
- 빛의 뱅크와 탱크를 통해 빛나는 빛을 확산 하기 위해 탱크 반투명, 흰색 플라스틱 시트를 놓습니다. 이 설정 서덜랜드 외. 에서 적응 시켰다 19
- 마크 10 센티미터의 높이에 아크릴 탱크 기지에서 수직으로 측정. 모든 샘플링의 일관성을 보장 물 열이이 높이에서 모든 측정 할 수 있습니다.
- 각 실험 기록 탱크 앞 1m, 삼각대에 카메라를 배치 합니다. 비디오 카메라와 이미지, 비디오 파일에서 추출 될 수 수학적 모델링 소프트웨어를 사용 하 여 비디오 파일 안정화 역학19를 모델링 하는 데 사용할 수 있습니다 것이 좋습니다.
- 검은 천으로 빛 은행, 탱크, 그리고 카메라 외부 광원 (그림 1)에서 실험을 방패를 놓습니다.
3. 응집 실험 프로토콜
- 400 mL 문화 (1.2 단계), 큰 등급된 실린더, 및 600 mL 1 L 플라스 크 (1.2.5 단계)에 추가 성장 매체의 수집.
- 졸업된 실린더를 사용 하 여 1 L의 최종 볼륨을 추가 성장 미디어 (A + 또는 BG-11) 400ml 문화 (4-6 mg/mL의 초기 세포 농도)을 희석. 아크릴 탱크에이 솔루션을 추가 합니다.
- 라벨 및 아크릴 탱크 근처 편리한 위치에 배치 하 여 2 mL microfuge 관을 준비 합니다. 실험에 대 한 클레이의 50 g을 측정 합니다.
- 비디오 녹화를 시작 합니다. 여러 실험의 경우 실험 식별자 기호 수 일시적으로 전에 개최 카메라.
- 피 펫을 사용 하 여 1 mL 샘플 고 레이블이 microfuge 관에. 이 샘플을 사용 하 여 초기 cyanobacterial 세포 수는 OD를 측정 하 여 결정750 nm 값. 정확한 결과 보장 하기 위해 3 중에서 모든 샘플을 가져가 라.
- 신속 하 게 부 어 클레이 (50 g) 탱크에 교 반 막대기를 사용 하 여 10-15에 대 한 활발 한 동요와 함께.
- 타이머를 시작 하 고 Chl P1000 피 펫 (샘플 시간0)를 사용 하 여 결정에 대 한 초기 1 mL 샘플을 가져가 라.
- 적절 한 시간 간격 (예:1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 10 분, 15 분, 30 분, 60 분, 180 분, 240 분) 추가 샘플을 가져가 라.
- 실험 완료 되 면 비디오 파일을 저장 하 고 비디오 카메라를 해제 한 Chl 결정 (4 단계) 에 대 한 모든 샘플을 처리.
- 압력솥 나머지 점토/cyanobacterial 솔루션입니다. Cyanobacterial 종, 법규, 및 연구소 정책에 따라 적절 한 방법을 사용 하 여 솔루션의 처분. 깨끗 한 비누와 물, 탱크 증류수로 그것을 씻어 하 고 공기 건조.
- 추가 없는 점토와 제어 실험을 준비 합니다. 같은 시간 지점에서 샘플을 가져가 라. 이 데이터는 점토, 아니라 자연 정착의 결과와 응집으로 인해 안정화 속도 향상 된 것인지 다른 실험 데이터를 비교할 수 있습니다.
- 실험 기간 동안 죽은 바이오 매스를 사용 하는 경우 동일한 실험적인 절차를 사용 합니다. 그러나, 솔루션의 처리 절차는 압력가 마로 소독을 필요 하지 않습니다.
4. 샘플 처리 및 평가
- Chl Owttrim16에서 수정 하는 절차를 사용 하 여 각 셀 샘플의 농도 결정 합니다. 일단 수집, 13000 x g 는 microcentrifuge를 사용 하 여 실내 온도에 3 분 동안 각 샘플에서 셀을 펠 렛.
- P1000 피 펫을 사용 하 여 초과 미디어를 제거 하 고 100% 메탄올 (20 ° C)의 1 mL를 추가 합니다. 소용돌이 1 분 셀 펠 릿 resuspend 최고 속도로 샘플.
주의: 메탄올은 유독 하 고 가연성. 장갑, 안전 안경, 착용 하 고 점화 소스에서 메탄올을 유지. - Chl는 는의 적 출을 촉진 하기 위하여 24 시간 동안-20 ° C에서 샘플을 품 어.
- 부 화, 후 4.1에 설명 된 대로 세포 파편을 펠 릿, 녹색 표면에 뜨는 베트는 피 펫을 사용 하 여 전송 고는 베트는 분 광 광도 계 합니다. 1 분 샘플 내 모든 나머지 점토 침전 하 고 측정을 방해 하지 않습니다에 대 한 분 광 광도 계에 샘플을 수 있습니다.
- 665에서 흡 광도 측정 하 여 농도 Chl를 spectrophotometrically 결정 및 652 nm, 및 750에서 OD nm. Chl는 농도는 수식 Chl는 는 사용 하 여 결정 됩니다 (는665 -OD750)-x 16.29 = (는652 -OD750) x 8.54 20. Chl 농도 세포 농도 대 한 프록시로 사용 됩니다. 또한, 1010 셀/L x 7.4의 변환 계수 = 10 g/L21 일부 cyanobacterial 종족의 그램에서 셀 농도 계산 하기 위해 사용할 수 있습니다.
- 플롯은 Chl 시간에 대 한 값을 계산합니다.
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Representative Results
점토에 드러낼 때, cyanobacterial 세포 현 탁 액22에서 주어진 다. 이 대표적인 결과 여기에 설명 했다. Cyanobacterial 인구에 점토의 효과 확인 하 고 관찰 하는 침전 속도, 두 실험 기간 동안 Synechococcus 및 Synechocystis 50 g/L 고령 토 찰 흙 (표 5-6, 에 노출 됐다 실시 했다 그림 2-3). 1 단계에서 설명한 대로 cyanobacterial 문화 성장 했다. 그 후, 탱크 (2 단계)를 설정한 후 희석된 Synechococcus 문화 탱크에 부 어 되었고 50 g 3 단계에 따라 고령 토 찰 흙의 혼합. 이것은 Synechocystis 문화에 대 한 반복 되었다. 모든 샘플은 탱크에서 동일한 위치에서 수집 되었습니다. 샘플 처리 되며 계산된 Chl는 값 뿐만 아니라 OD652 와 OD665 의 측정 Synechococcus (표 5) 및 Synechocystis (표 6) 주어진 다. 이러한 결과 선 음모에 그래픽으로 표시 하 고 cyanobacterial/점토 혼합물의 침전 속도 박테리아의 자연 침전 속도 보다 더 높은 결정 하는 기준의 결과에 비해 했다. 이 결과 cyanobacterial 인구 클레이 노출 (그림 2-3)의 10 분 이내 정지에서 보내진 보여 줍니다. 해양 Synechococcus 보여 신선한 물 Synechocystis, 가설과 일치 하는 보다 더 빠른 침 강 속도 3가 양이온 (바닷물의 염 분을 모방한 성장 매체에서 널리 퍼진) 응집 및 침전1따라서 촉진 찰 흙 입자와 세균 세포 사이 브리징 에이전트 역할을 합니다.
그림 3은 몇 가지 anomalously 높은 결과, 특히 데이터 시점 2 중요 하다. 이 단계는 동안 4.4 했다 충분히 따르지 샘플 처리의 예 이며 샘플 측정 동안 탁 되었다. 이 인위적으로 높은 결과 생성 (그림 2, 데이터 포인트 2). 시간 시리즈, 비디오에서 추출 된 이미지의 예는 그림 4, Playter 외에서 적응에 제공 됩니다. 22. 그 kaolinite (아니 카)는 Playter 외에 사용 하는 것이 중요 하다. 22.
그림 1 : 실험적인 체제를 설명 하는 설명 다이어그램. 비디오 카메라 1 m 이상 탱크 장치에서 설정 되어 있습니다. 탱크는 박테리아 및 액체 미디어의 1 L 채워집니다. 빛 탱크 뒤에서 조명 하 고 빛 반투명 필름에 의해 분산. 이 전체 설정 추가 광원을 제거 검은 천으로 draped입니다. 이 그림은 서덜랜드 외에서 수정 되었습니다. 19. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Chl 농도 표 1에 주어진 세 값에서 계산. 이러한 값은에서 Synechococcus /카 혼합물 (노란색). Chl Synechococcus 만 (블루)에 대 한 농도 와 비교 cyanobacterial/찰 흙 혼합물에 대 한 증가 침전 속도를 보여줍니다. 이 그림 Playter 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 22. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Chl 는 농도 표 2에 주어진 OD 값에서 계산 됩니다. 이 값은 Synechocystis /카 혼합물 (노란색). Chl Synechocystis 만 (블루)에 대 한 농도 와 비교 cyanobacterial/찰 흙 혼합물에 대 한 증가 침전 속도를 보여줍니다. 이 그림 Playter 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 22. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : Synechococcus의 대표적인 시간 과정-kaolinite 착. 이러한 스냅샷 이산 시간 간격 (1 분)에서 녹화 된 비디오에서 추출 됩니다. 이 그림 Playter 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 22. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 1 L에 대 한 |
| 18 g NaCl |
| 0.6 g KCl |
| 1 g 나노3 |
| 5 g MgSO4 ∙ 7 H2O |
| 1 mL KH2포4 |
| 7.2 mL CaCl2 |
| 161 μ 없음2EDTA |
| 1 mL FeCl3 ∙ 6 H2O |
| 10 mL Tris HCl pH 8.2 |
| 1 mL P1 금속 주식 * |
표 1: + 미디어에 대 한 제조 법 14 . P1 금속 재고의 구성 표 2 를 참조 하십시오. 이 제조 법은 미디어의 1 L를 생성합니다.
| 1 L p 1 금속 주식에 대 한 |
| 34.26 g H3보3 |
| 4.32 g MnCl2 ∙ H2O |
| 0.315 g ZnCl |
| 0.03 g 무3 (85%) |
| 0.003 g CuSO4 ∙ 5 H2O |
| 0.01215 g CoCl2 ∙ 6 H2O |
표 2: p 1에 대 한 제조 법 주식 + 미디어에 필요한 금속.
| 1 L에 대 한 |
| 10 mL 나노3 |
| 1 mL K2HPO4 |
| 1 mL MgSO47 H2O |
| 1 mL CaCl2 2 H2O |
| 1 mL 연산 H2O |
| 1 mL 제 2 철 암모늄 시트르산 |
| 1 mL DiNaEDTA |
| 1 mL 나2CO3 |
| 1 mL A5 Microelements * |
표 3: BG-11 미디어에 대 한 제조 법 16 . A5 Microelements의 구성 표 4 를 참조 하십시오. 이 제조 법은 미디어의 1 L를 생성합니다.
| 재고 솔루션의 1 리터에 대 한 |
| 2.86 g H3보3 |
| 1.81 g MnCl2 4 H2O |
| 0.222 g ZnSO4 7 H2O |
| 0.390 g Na2무4 2 H2O |
| 0.079 g CuSO4 5 H2O |
| 0.40 g CoCl2 6 H2O |
표 4: BG-11 미디어에 필요한 미 량 원소 A5 재고에 대 한 제조 법.
| 샘플 시간 (분) | OD 665 nm | OD 652 nm | Chl는 는 (mg/mL) |
| -1 | 0.563 | 0.373 | 5.986 |
| 0 | 0.428 | 0.33 | 4.154 |
| 5 | 0.112 | 0.046 | 1.432 |
| 10 | 0.024 | 0.036 | 0.084 |
| 15 | 0.027 | 0.025 | 0.226 |
| 30 | 0.007 | 0.002 | 0.097 |
| 60 | 0 | 0.061 | 0.000 |
| 120 | 0.007 | 0.061 | 0.000 |
| 180 | 0.005 | 0.012 | 0.000 |
| 240 | 0.005 | 0.012 | 0.000 |
표 5: OD 665 그리고 세 652 에 대 한 측정 Synechococcus 50 g/L 고령 토 찰 흙의 존재. Chl 값 단계 4.4에서에서 수식을 사용 하 여 계산 됩니다. 참고 샘플 t6, t 7 누락 된입니다. 이 셀 샘플링 프로토콜에 의하여 일관 된 샘플 간격을 유지 하지의 예입니다. 데이터 표준에 대 한 Playter에서 가져온 것입니다 외. (2017) 2.
| 샘플 시간 (분) | OD 665 nm | OD 652 nm | Chl는 는 (mg/mL) |
| -1 | 0.384 | 0.345 | 3.309 |
| 0 | 1.863 | 1.739 | 15.497 |
| 5 | 0.64 | 0.528 | 5.916 |
| 10 | 0.217 | 0.216 | 1.690 |
| 15 | 0.104 | 0.089 | 0.934 |
| 30 | 0.126 | 0.169 | 0.609 |
| 60 | 0.424 | 0.402 | 3.474 |
| 90 | 0.115 | 0.048 | 1.463 |
| 120 | 0.016 | 0.007 | 0.201 |
| 180 | 0.012 | 0.004 | 0.161 |
| 240 | 0.011 | 0.005 | 0.136 |
표 6: OD 665 그리고 세 652 에 대 한 측정 Synechocystis 50 g/L 고령 토 찰 흙의 존재. Chl 값 단계 4.4에서에서 제공 하는 수식을 사용 하 여 계산 됩니다.
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Discussion
응집 cyanobacterial 셀-클레이 상호 작용에 의해 촉매 생태 및 엔지니어링2,3,,45,6,7 분야에 관심을 많이 받고 있다 그러나 ,,89,10,11,12,, 퇴적암의 증 착 모델링의 목적으로 이러한 상호 작용의 조사 예금 (혈 암) 등은 상대적으로 새로운입니다. 이 프로세스의 시각화가 경우 sedimentological 응용 프로그램에 대 한 되지 보고 되었습니다. 과거의 응집 연구에서 이러한 상호 작용 점토 항아리, 시험관, 또는 비 커, 그리고 이산 시간 간격9,,1112, 샘플링에 남조류를 혼합 하 여 조사 되었습니다. 26 시간을 통해 셀 농도 변화를 확인 하. 이러한 연구는 다양 한 방법으로 cyanobacterial 셀의 농도 측정. 예를 들어 샘플링된 cyanobacterial 세포 인구는 현미경9,11,,1226를 사용 하 여 계산 하 여 측정 되었다 있다. 초기 세포 농도에 비해, 제거 효율 계산된9,11,,1226수 있습니다. 별도 연구에서 정착, 찰 흙/셀 혼합물 허용 후 정착된 셀/점토 퇴적 물 위에 유체 남은 샘플링 되었고 정지3에 나머지 셀의 수를 견적 하는 형광에 대 한 분석. Chl는 는 직접 물 열 샘플에서에서의 측정 또한 셀 농도8,10계산에 사용 되었습니다.
반면, 우리의 방법론 측정 셀 서 스 펜 션에 시간이 지남에, Sengco, 그 외 의 방법론에 건물 과정을 통해, 선택 시간에 측정 하 고 실시간으로 비디오 이미지와 함께이 시간 간격을 페어링 하 여 4 . 비교 될 때 음이온 flocculants 존재 클레이의 정착 관련 된 다른 실험 프로토콜, 생물 (조류 또는 박테리아) 또는 비 생물학 (합성 부드러운 에이전트) flocculants를 사용 하 여 우리의 분석 다른 많은 계산합니다. 첫째, 우리의 연구 사용을 포함 한다 박테리아의 해양 coccoid 종의 민물 종 또는 생산 하는 세포 외 다 당 류 물질5,,2324 종을 포함 하는 많은 다른 연구 , 25. 우리의 연구는 솔루션 정적 유지 표준 탱크의 사용을 포함 하는 또한. 이 연구 수행 테스트 튜브 또는 실린더3,12,14 또는 수조 탱크, 유체 흐름은 관심6,7의 변수를 사용 하 여 대조. 우리의 실험 방법의 정적 자연 어디 floccules 하지 보관에 난 류 흐름에 의해 초기 침 강 속도의 측정에 대 한 수 있습니다. 또한, 테스트 튜브, 항아리, 또는 비 커, 대신 탱크를 사용 하 여 허용 결과 예금의 더 나은 시각화 플랫 탱크 면; 때문에 비디오 이미지 표시 커브 때문 아니 왜곡 하 고 빛 균등 하 게 분산 된. 셋째, 방법론 여기에 설명 된 조치 응집 속도 짧은 (2 분 간격) 및 긴 기간 (시간 간격); 또한, 이미지는 초 분, 모두, 프로세스의 시각화와 정착 속도의 추가 측정의 비늘에서 컴파일할 수 있습니다. 대부분 연구 측정 응집 속도 절반 전체 시간 간격5,6,,2325 이상 또는 단순히 측정 셀 왼쪽의 마지막 숫자를 한 번 후에 포인트 (2- 2.5 h)9,24, 비록 일부 연구9 셀 또는 Chl 2 분 간격에 걸쳐 농도 변화 측정. 응집 빠르게 (5-10 분) 내에서 발생할 수 있습니다 샘플 간격 선택이 중요,22. 마지막으로, 우리의 방법론의 주요 힘은 단순히 생산된 집계의 응집 공정의 실시간 이미지 생성 (예., Avnimelech 외 알., 1982)24. 데이터를 샘플링 하 고 시각적 증거에서 세포 농도의 두 줄을 데 결과의 신뢰성을 강화 하 고 강력한 결론을 지원 합니다.
점토와 남조류, 우리의 프로토콜의 응집 속도 측정을 위해 적당 한 탱크 내에서 샘플링 위치에 관하여 근 면을 합니다. 탱크 (x, y, z)의 같은 지역 때마다 샘플링 해야 합니다 또는 샘플 결과 왜곡 될 수 있습니다. 또한 해야 합니다 주의 정착 OD 측정 전에 모든 입자를 허용 하도록. 중요 한 단계를 포함: i), 모든 실험에 대 한 일관성 있는 남아 있는 적합 한 샘플링 간격을 사용 하 여 고 2)의 적절 한 추출 되도록 메탄올의 추가 후 찰 흙/cyanobacterial 펠 릿은 충분히 깨진 셀에서의 엽록소
여기서 설명 하는 기술도 완전히 산소 조건에서 응집 모델링에 제한 됩니다. 실험 장치 및 절차 무산 소 아래쪽 물 층 화 물 열을 수정 해야 합니다.
Sedimentological 컨텍스트 내에서이 방법은 유기 물질과 강가의 입력에서 염 분 변화와 같은 측면을 이해 하기 위해 다른 점토 비율 또는 생물학 자료의 모델링 예금에 적용 될 가능성이 있다. 또한,이 메서드를 사용 하 여 생산 하는 앙금 리믹스 또는 교 반에 의해 floc 일관성에 reworking 잠재적인 폭풍의 영향을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다. 시각적 이미지와 cyanobacterial 셀 농도의 직접 측정 함으로써,이 프로토콜 남조류/클레이 응집 공정의 전통적인 애플 리 케이 션을 초월 하 고 이러한 프로세스를 sedimentological에 적용 될 수 있습니다. 바위 기록의 만들기.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 기꺼이 자연과학 및 공학 연구 위원회 캐나다의 (05448, 165831 213411)에서 자금을 인정 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cyanobacteria (in this study: Synechococcus sp. PCC 7002 and Synechocystis sp. PCC 6803) | Pasteur Culture Collection | PCC 7002 or PCC 6803 | used to inoculate the plates |
| agar | Thermo Scientific | CM0003 | used to fill two petri dishes |
| Petri plates (standard bacteriology, 100 x 15 mm) | Sarstedt | 82.1473.001 | 2 required |
| 1 L heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-125 | 1 required |
| 250 mL heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-250 | 1 required |
| Nichrome inoculating loop with handle | Fisher Scientific | 14-956-103 | 1 required |
| tinfoil | Reynolds Wrap Aluminum Foil | 89079-067 | 50 cm required; used to cover foam stopper and neck of erlenmeyer flasks |
| growth media (e.g. A+) | 1050 mL required; produced using composition described in tables 1-4 | ||
| Bunsen Burner | Fisher Scientific | S95941 | 1 required |
| plastic tubing | Fisher Scientific | S504591 | 1 m required; used to create the bubbling apparatus |
| sponge stopper | Jaece Industries Inc | 14-127-40E | 1 required; hole made in center for pipette; used for constructin the bubbling apparatus |
| acrylic sheet | Home Depot | Optix clear acrylic sheet model # MC-102S | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| clear waterproof silicone adhesive | Home Depot | Loctite clear silicone model # 908570 | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| camera or video recorder | Panasonic | HC-V770 HD camcorder | 1 required |
| tripod | Magnus | VT-300 | 1 required |
| black cloth | primomart | EAN 0726670162199; Part number 680254blacknappedfr | 1 required; duvetyne light block-out cloth; approximatly 152 x 213 cm to cover tank experiment |
| heat resistant serological pipet | corning incorporated C708510 | 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus |
| sample vials | Dynalon | S30467 | at least 12 (will vary with time interval chosen) |
| heat resistant glass pipette | Fisher Scientific | Corning Incorporated C708510, 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus; Polystyrene serological pipet would also work, but should be connected to the tubing and stopper after the rest of the apparatus is autoclaved. |
| microcentrifuge | Eppendorf | 22 62 120-3 | 1 required;Comparable products may be used if capable of centrifuging 1.5 -2 mL microfuge tubes at 13,000 x g |
| vortex machine (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries, Inc | SI-0236 | 1 required |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-500 SDS | at least 12 mL (1mL per sample) required; Caution: Flammable, toxic. Wear gloves and safety glasses. Do not use or store near ignition source. Alternate sources may be used. |
| cuvettes (1.6 mL, polystyrene) | Sarstedt | 67.742 | at least 12 required |
| spectrophotometer | Fisher Scientific | 222-271600 | 1 required; Pharmacia Biotech Novaspec ll could also be used. |
| light bulbs | Home Depot | model # 451807; internet #205477895; store SKU #1001061538 | 6-8 bulbs required to provide light for the tank experiments |
| pipette (Pipetman Classic P1000 | Gilson | F123602 | used to collect samples |
| 37 % Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Caution: Corrosive and toxic. Wear lab coat, safety glasses and acid-resistant gloves while using. Prepared to 4 N before use by dilution into deionized water in a chemical fumehood. |
| Foam stopper (small) | Canlab | T 1385 | |
| Foam stopper (large) | Canlab | T 1387 | Requires some intact stoppers and some with a single hole through the centre |
| 30 °C incubator/growth room with continuous illumination | 1 required | ||
| 70 % Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 30 mL required;Caution: Toxic and flammable. Wear lab coat and safety glasses |
| hydrophobic air filter (Midisart 2000, 0.2 µm) | Sartorius | 17805 | 1 required |
| clay (e.g. kaolin) | Fisher Scientific | MFCD00062311 | at least 50 g required |
| microfuge tubes (2 mL, polypropylene) | Sarstedt | 72.695.500 | Comparable products may be used. At least 12 (will vary with time interval chosen) |
| 1000 µL pipet tips | Sarstedt | 70.762 | 1 required |
References
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