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Determinación de la tasa de asentamiento de arcilla/cianobacterias copo

Published: June 11, 2018 doi: 10.3791/57176
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 1,3, 4, 1, 1, 1, 1
1Department of Earth and Atmospheric Sciences, University of Alberta, 2Department of Biological Sciences, University of Alberta, 3Department of Earth Sciences, Simon Fraser University, 4Earth Sciences Department, University of Toronto

Summary

La interacción y la sedimentación de la arcilla y las células bacterianas dentro del Reino marino, observado en ambientes naturales, pueden investigarse mejor en un entorno de laboratorio controlado. Aquí, describimos un protocolo detallado, que describe un nuevo método para medir la tasa de sedimentación de arcilla y cianobacterias copo.

Abstract

Los mecanismos que sustentan la deposición de grano fino, sedimentos orgánicos ricos se debaten todavía en gran parte. Específicamente, el impacto de la interacción de partículas de arcilla con células cianobacterias planctónicas, reactivas el Registro sedimentario se estudia menos. Esta interacción es potencialmente importante colaborador modelos deposicionales de pizarra. En un entorno de laboratorio, las tarifas de la floculación y la sedimentación de estos materiales pueden ser examinadas y medidas en un ambiente controlado. Aquí detallamos un protocolo para medir la tasa de sedimentación de las mezclas de cianobacterias/de la arcilla. Esta metodología se demuestra a través de la descripción de experimentos muestra dos: la primera utiliza caolín (una forma deshidratada de la caolinita) y Synechococcus sp PCC 7002 (cianobacterias cocales Marina), y la segunda utiliza caolín y Synechocystis sp PCC 6803 (cianobacterias cocales agua dulce). Cultivos de cianobacterias se mezclan con cantidades variables de arcilla dentro de un aparato especialmente diseñado el tanque optimizado para permitir que el vídeo de la continua y en tiempo real y registro fotográfico. Se detallan los procedimientos de muestreo, así como un protocolo de la colección para medición precisa de la clorofila a que se puede determinar la concentración de células de cianobacterias en suspensión. A través de replicación experimental, se construye un perfil que muestra la tasa de sedimentación.

Introduction

Utilizando procesos y condiciones ambientales presentes a inferir más allá de los mecanismos de deposición ha sido de largo una base de Sedimentología. Mientras que los modernos análogos de deposición, como el mar negro, se han utilizado para entender la deposición de los depósitos orgánicos ricos, de grano fino, experimentos de laboratorio tienen el potencial de arrojar luz adicional sobre el origen de los depósitos de esquisto. Un área de investigación en la génesis de las pizarras negras es la tasa de deposición y mecanismo de la formación original. Tradicionalmente, se ha presumido que shales negros forman en ambientes donde la tasa de sedimentación, productividad primaria, materia orgánica respiración tarifas y promoción la conservación de la materia orgánica en el sedimento1,2 ,3. Sin embargo, el papel de cianobacterias y floculación de la arcilla se ha mantenido en gran parte unconsidered. Este mecanismo de floculación permitiría rápida deposición de los sedimentos orgánicos, con grano fino para ocurrir y no es necesario oxígeno. Teniendo en cuenta esta premisa, este protocolo tiene dos objetivos: 1) medir la velocidad de sedimentación de copo de cianobacterias/de la arcilla y 2) visualizar el proceso de sedimentación en tiempo real. Esta metodología, además de análisis geoquímico, se ha utilizado para demostrar que esa floculación de cianobacterias/de la arcilla puede en realidad ser un mecanismo importante para la formación de pizarra1. Mientras que originalmente concebidos para la modelización de la deposición de la pizarra, este método es aplicable a otras disciplinas como la biología y la remediación ambiental donde la influencia de la entrada de arcilla sobre metabolismo bacteriano y la población necesita ser medido.

Se han realizado numerosos estudios para observar la floculación de la arcilla, para mitigar las floraciones de algas nocivas2,3,4,5,6,7 y cianobacterias , 8 , 9 , 10 , 11 , 1 2. sin embargo, al medir la concentración de células en el tiempo, estos estudios no han aplicado floculación cianobacterias/arcilla al modelado de la deposición del expediente de la roca. Así, estos estudios carecen de un componente visual, que puede ser crítico al modelado de procesos sedimentológicos pasados. Adicionalmente, la mayoría de estudios utiliza conteo de células (por ejemplo, Pan et al. 11), que puede ser laborioso. Nuestro método, con los recientes avances en medición floculación cianobacterias, determina los cambios en la concentración celular de cianobacterias mediante la medición de clorofila a (Chl a) intervalos de tiempo discretos. Emparejamiento Chl una medición con datos visuales, es un nuevo enfoque, que puede utilizarse para inferir las condiciones deposicionales. Las imágenes generadas pueden utilizarse también para calcular la tasa de sedimentación después del trabajo de Du et al. 13. la combinación de datos numéricos y visuales refuerza la fiabilidad de los resultados. Además, describimos protocolos adicionales permitiendo la sedimentación de la biomasa muerta y la arcilla también se pueden observar. Esto es importante cuando se considera más allá de ambientes sedimentológicos, donde vivo y biomasa muerta puede haber ocurrido Co. Las diferencias en el comportamiento de la biomasa muerta durante la floculación (por ejemplo, disminución en la tasa de floculación) potencialmente tendría implicaciones sedimentológicos.

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Protocol

1. preparar cultivos de cianobacterias

  1. Preparación de las culturas de inoculación utilizando medios sólidos
    1. Obtención de células cianobacterianas axénicos de la American Type Culture Collection o colección de cultivos de Pasteur. Por ejemplo, los unicelulares, marinas Synechococcus SP. 7002 PCC se obtuvo de la colección de la cultura de Pasteur, se referirán a más allá como Synechococcus.
    2. Mantener las células de Synechococcus en placas conteniendo medio sólido (un + medios líquidos14 y 1.5% agar15). Estas se referirán a más allá como las culturas de la inoculación.
    3. Incubar las placas a 32 ± 2 ° C con luz continua en 30-50 μmol fotones m-2 s-1,15,18.
    4. Repita los pasos 1.1 – 1.3 y reemplazar un + media con BG-11 de16 en el paso 1.1.2 para especies de cianobacterias de agua dulce, como Synechocystis sp PCC 680316,17, referido en adelante como Synechocystis. Consulte las tablas 1 a 4 para la composición de los medios de comunicación A + y BG-11.
  2. Preparación líquidas culturas: cada experimento de depósito requiere una cultura de cianobacterias de 400 mL.
    1. Recoger una 250 mL y dos L 1 matraz de Erlenmeyer resistentes al calor.
    2. Enjuague cada frasco con una solución de ácido clorhídrico (HCl) de 4 M (30 mL de solución de HCl para cada frasco), seguido de agua destilada.
      PRECAUCIÓN: el ácido clorhídrico es corrosivo y tóxico. Asegurar que una bata de laboratorio, gafas de seguridad y guantes resistentes a los ácidos son usados durante el uso de la solución de HCl de 4 M. Realizar este paso en un fregadero de laboratorio y siga las normativas locales sobre la eliminación de la solución de HCl de 4 M
    3. Llene el matraz de 250 mL con 50 mL de medio líquido (A + o BG-11). Llenar un matraz de 1 L con 400 mL de medio líquido (A + o BG-11) y el otro frasco de 1 L con 600 mL de medios de comunicación (A + o BG-11).
    4. Sellar cada matraz con un tapón de espuma permeable al gas y cubre el cuello de espuma el tapón y el matraz con papel de aluminio.
    5. Etiqueta y autoclave los frascos a 121 ° C y 100 kPa durante 25 minutos deje que los frascos se enfríen a temperatura ambiente.
    6. Preparar una campana de flujo laminar esterilizando la superficie con alcohol al 70%.
    7. Recoger un asa de inoculación de alambre, un mechero de Bunsen, el frasco de 50 mL refrigerado por medios líquidos (de paso 1.2.5) y la cultura de la inoculación (del paso 1.1). Coloque estos artículos en la campana de flujo esterilizado.
    8. Esterilizar el asa de inoculación de alambre brevemente con la llama de un mechero de Bunsen y deje que se enfríe.
    9. Arrastre del bucle frío a lo largo de la superficie de la cultura de inoculación para recoger las células cianobacterianas.
    10. Retire el tapón de espuma y papel de aluminio del frasco de 250 mL (sin tocar el tapón de espuma) y esterilizar el borde del matraz Erlenmeyer al pasar brevemente por la llama.
    11. Inclinar el frasco para que los medios de comunicación está cerca del cuello del matraz y coloque el asa de inoculación cubierto con células en el matraz. Una vez que el bucle está sumergido en los medios de comunicación, agitar el asa de inoculación para eliminar las células.
    12. Retire el asa de inoculación y volver a esterilizar el labio del matraz con la llama del mechero de Bunsen.
    13. Vuelva a colocar el tapón de espuma y papel de aluminio en el matraz Erlenmeyer (sin tocar el tapón de espuma).
    14. Esterilizar el asa de inoculación brevemente dentro de la llama del mechero de Bunsen.
    15. Preparar un cuarto de crecimiento (que se refiere como la cámara de crecimiento) donde la temperatura se mantiene a 30 ° C15,18 e intensidad de luz es 30-50 μmol fotones m-2 s-1,15,18 . Humedad no está activamente controlada.
    16. Permitir que la cultura inoculado 50 mL a incubar por agitación a 150 rpm en la cámara de crecimiento, con una temperatura mantenida de 30 ° C. Mantenga la boca del matraz cubierto durante la agitación para controlar las pérdidas por evaporación y evitar la contaminación.
    17. Permita que la cultura cianobacterias creciendo durante 96 h. Una cultura exitosa debe aparecer de color verde brillante y tienen una densidad óptica (do) a 750 nm de 0,4 – 0,6.
    18. Una vez que la cultura ha crecido lo suficiente, poner la cultura de 50 mL y el matraz de 1 L que contiene 400 mL de medio líquido (del paso 1.2.5) en la campana de flujo laminar. Asegúrese de que la campana de flujo es esterilizado siguiente paso 1.2.6.
    19. Repita el paso 1.2.10 de ambos frascos dentro de una campana de flujo laminar.
    20. La cultura de 50 mL vierta 400 mL de medio en el matraz de 1 L y volver a esterilizar el labio del matraz de 1 L con la llama del mechero de Bunsen.
    21. En el lugar de la tapa del tapón y el papel de espuma, conecte un aparato burbujeante estéril que consiste en un tapón de espuma, pipeta, tubo de plástico, filtro en línea y papel de cubierta para la boca del matraz.
    22. Agitar el matraz de 1 L a 150 rpm a 30 ° C con el aparato de borboteador conectado a una bomba de aire, que circula una mezcla de aire humidificado a través de la solución15,18 a 300 mL/min.
    23. Permiten salir a crecer dentro de la cámara de crecimiento a 30 ° C de 120-168 h. Una cultura exitosa debe aparecer de color verde brillante y tiene un OD750 nm de 0,4 – 0,6.
    24. Repita el paso 1.2 para producir una cultura del control, que no se mezclará con la arcilla.
    25. Experimentos utilizando biomasa muerta requieren un paso adicional. Autoclave el matraz de 1 L cultura durante 60 min a 121 ° C y deje que se enfríe a temperatura ambiente.

2. experimental establecido

  1. Colocar un tanque de acrílico rectangular (de 20 cm de longitud), de 5,1 cm de ancho y altura de 30 cm delante de un banco de luces fluorescentes (nueve T8 bombillas, por lo menos 2.600 lúmenes; Figura 1) 19.
  2. Coloque una lámina de plástico translúcida, blanco entre el Banco de las luces y el tanque para difundir la luz, que brilla a través del tanque. Este montaje fue adaptado de Sutherland et al. 19
  3. Marca el tanque de acrílico a una altura de 10 cm, medidos verticalmente desde la base. Todas las mediciones se deben hacer a esta altura de la columna de agua para asegurar la consistencia del muestreo todos.
  4. Coloque una cámara en un trípode, 1 m frente al tanque para cada experimento. Una cámara de vídeo se recomienda ya que pueden extraer imágenes de archivos de vídeo, y usando software de modelado matemático, archivos de vídeo pueden utilizarse para modelar la clarificación dinámica19.
  5. Coloque un paño negro sobre el Banco de luz, tanque y cámara para proteger el experimento de fuentes externas de luz (figura 1).

3. Protocolo Experimental floculación

  1. Recoger la cultura de 400 mL (paso 1.2) y un gran cilindro graduado, 600 mL de medio de crecimiento adicional en un matraz de 1 L (paso 1.2.5).
  2. Diluir la cultura 400 mL (concentración celular inicial de 4 – 6 mg/mL) con medios de crecimiento adicional (A + o BG-11) a volumen final de 1 L utilizando el cilindro graduado. Añadir esta solución al tanque de acrílico.
  3. Preparar 2 mL tubos del microfuge etiquetado y colocarlos en una ubicación conveniente cerca del tanque de acrílico. Medida 50 g de arcilla para el experimento.
  4. Comenzar a grabar video. En el caso de múltiples experimentos, un cartel con el identificador de experimento puede llevado a cabo temporalmente ante la cámara.
  5. Usando una pipeta, tomar una muestra de 1 mL y colóquelo en un tubo de microcentrífuga etiquetados. Utilice este ejemplo para determinar el conteo inicial de cianobacterias mediante la medición del OD750 nm valores. Tomar todas las muestras por triplicado para asegurar resultados exactos.
  6. Rápidamente verter la arcilla (50 g) en el tanque con agitación vigorosa con un palito de agitación de 10 – 15 s.
  7. Iniciar el temporizador y se toma la muestra inicial de 1 mL para Chl una determinación con una pipeta de P1000 (muestra tiempo0).
  8. Tomar muestras adicionales a intervalos de tiempo apropiados (por ejemplo, 1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 60 min, min 180 y 240 min).
  9. Una vez finalizado el experimento, guardar el archivo de vídeo, apague la cámara y procesar todas las muestras de Chl una determinación (paso 4).
  10. La solución restante arcilla/cianobacterias del autoclave. Dependiendo de especies de cianobacterias, las regulaciones locales y política de laboratorio, deseche la solución utilizando métodos apropiados. Limpia el tanque con agua y jabón, enjuagarlo con agua destilada y aire secará.
  11. Preparar un experimento de control con ninguna arcilla añadida. Tomar muestras en los mismos puntos de tiempo. Estos datos pueden ser comparados con los otros datos experimentales para confirmar que se han mejorado las tasas de sedimentación debido a la floculación con arcilla, no un resultado de solución natural.
  12. Si se utiliza biomasa muerta durante el experimento, utilizar el mismo procedimiento experimental. Sin embargo, el procedimiento de eliminación de la solución no requiere de autoclave.

4. evaluación y procesamiento de la muestra

  1. Determinar la Chl una concentración en cada muestra de células mediante un procedimiento modificado de Owttrim16. Una vez recogido, sedimenten las células de cada muestra durante 3 min a 13.000 x g utilizando una microcentrífuga a temperatura ambiente.
  2. Eliminar exceso de medios utilizando una pipeta P1000 y añadir 1 mL de metanol al 100% (20 ° C). Vórtice de la muestra a toda velocidad durante 1 min Resuspender el precipitado de células.
    PRECAUCIÓN: El metanol es tóxico e inflamable. Use guantes y gafas de seguridad y metanol alejar fuentes de ignición.
  3. Incubar las muestras a-20 ° C durante 24 h facilitar la extracción de Chl un.
  4. Después de la incubación de la pelotilla de la ruina celular como se indica en 4.1, transferir el verde sobrenadante a una cubeta con una pipeta y coloque la cubeta en el espectrofotómetro. Permita que la muestra en el espectrofotómetro para 1 minuto asegurar que cualquier arcilla restante dentro de la muestra se instala y no interfiere con la medición.
  5. Determinar una concentración Chl espectrofotométricamente midiendo absorbancia a 665 nm y 652 nm y OD a 750 nm. El Chl una concentración se determina mediante la fórmula Chl un = 16.29 x (un665 - OD750) - 8.54 x (un652 - OD750) 20. CHL una concentración se utiliza como proxy para la concentración de células. Además, un factor de conversión de 7.4 x 1010 células/L = 10 g/L21 puede utilizarse para calcular la concentración de células en gramos de algunas especies de cianobacterias.
  6. Parcela calculada Chl un valores frente al tiempo.

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Representative Results

Cuando se expone a la arcilla, las células cianobacterianas son sacadas de suspensión22. Esto se demuestra en los resultados representativos dados aquí. Tarifas para determinar el efecto de la arcilla en las poblaciones de cianobacterias y observar la sedimentación, se realizaron dos experimentos durante los cuales Synechococcus y Synechocystis expusieron a caolín 50 g/L (tabla 5-6, Figura 2– 3). Cianobacterias culturas crecieron como se describe en el paso 1. Posteriormente, después de instalar el tanque (paso 2), la cultura de Synechococcus diluida se vierte en el tanque y mezclada con 50 g de caolín siguiendo el paso 3. Esto se repitió para la cultura de Synechocystis . Todas las muestras se recolectaron de la misma posición en el tanque. Las muestras fueron procesadas y se dan medidas de OD652 OD665 como el Chl un valor calculado de Synechococcus (tabla 5) y Synechocystis (tabla 6). Estos resultados se trazan gráficamente en diagramas de línea y en comparación con los resultados de los estándares para determinar si la tasa de asentamiento de las mezclas de cianobacterias/arcilla fue mayor que la tasa de sedimentación natural de las cianobacterias solo. Estos resultados demuestran que las poblaciones de cianobacterias fueron llevadas fuera de la suspensión dentro de 10 minutos de la exposición de la arcilla (figura 2– 3). La Marina Synechococcus mostró una tasa de sedimentación más rápida que el agua dulce Synechocystis, y cual es consistente con la hipótesis de cationes trivalentes (frecuente en el medio de crecimiento, que imita la salinidad del agua salada) actuar como agente de puente entre las partículas de arcilla y las células bacterianas, facilitando la floculación y sedimentación1.

Es importante notar que en la figura 3, hay algunos resultados anómalamente altas, específicamente en los datos del punto 2. Este es un ejemplo de procesamiento de las muestras durante el paso que 4.4 no fue suficientemente seguido y la muestra se convirtió turbia durante la medición. Esto produce un resultado artificial alto (figura 2, punto 2). Un ejemplo de imágenes en serie de tiempo, extraída de un vídeo se proporcionan en la figura 4, adaptada de Playter et al. 22. es importante señalar que caolinita (no caolín) fue utilizado en Playter et al. 22.

Figure 1
Figura 1 : Diagrama explicativo ilustrativo la configuración experimental. Una cámara de vídeo está configurada por lo menos 1 m del aparato tanque. El tanque se llena con 1 L de cianobacterias y medios líquidos. Las luces iluminan el tanque por detrás y la luz se dispersa por un film transparente. Esta todo configurado es cubierto con un paño negro para eliminar fuentes de luz adicionales. Esta figura ha sido modificada de Sutherland et al. 19. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Chl una concentración calculada a partir de los valores de OD en la mesa 1. Estos valores son de un Synechococcus /mezcla de caolín (amarillo). Comparación con Chl a concentraciones de Synechococcus solamente (azul) muestra una tasa de incremento de la sedimentación de la mezcla de cianobacterias/arcilla. Esta figura ha sido modificada de Playter et al. 22. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Chl un las concentraciones calculan de los valores de OD dados en la tabla 2. Estos valores son de Synechocystis /mezcla de caolín (amarillo). Comparación con Chl a concentraciones para Synechocystis solamente (azul) muestra una tasa de incremento de la sedimentación de la mezcla de cianobacterias/arcilla. Esta figura ha sido modificada de Playter et al. 22. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Curso de representante temporal de Synechococcus-deposición caolinita. Estas instantáneas se extraen el vídeo grabado a intervalos de tiempo discreto (1 min). Esta figura ha sido modificada de Playter et al. 22. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para 1 L
18 g de NaCl
0.6 g de KCl
1 g de NaNO3
g 5 MgSO4 ∙ 7 H2O
1 mL KH2PO4
7,2 mL CaCl2
161 μL Na2EDTA
1 mL FECLAS3 ∙ 6 H2O
10 mL de Tris HCl, pH 8.2
1 mL P1 metales stock *

Tabla 1: receta para un + media 14 . Consulte la tabla 2 para la composición de la bolsa de metales de P1. Esta receta produce 1 L de los medios de comunicación.

Para 1 L P1 metal stock
34,26 g H3BO3
g 4,32 MnCl2 ∙ H2O
g 0,315 vivencias
0,03 g MoO3 (85%)
0,003 g CuSO4 ∙ 5 H2O
0,01215 g CoCl2 ∙ 6 H2O

Tabla 2: Receta para P1 metales stock requerido para un + medios de comunicación.

Para 1 L
10 mL de NaNO3
1 mL K2HPO4
1 mL MgSO47 H2O
1 mL CaCl2 2 H2O
1 mL ácido cítrico H2O
Citrato de amonio férrico 1 mL
1 mL DiNaEDTA
1 mL de Na2CO3
1 mL A5 microelementos *

Tabla 3: receta de medio BG-11 16 . Consulte la tabla 4 para la composición de microelementos de A5. Esta receta produce 1 L de los medios de comunicación.

Para 1 L de solución madre
2,86 g H3BO3
g 1,81 MnCl2 4 H2O
0,222 g ZnSO4 7 H2O
0,390 g Na2MoO4 2 H2O
0,079 g CuSO4 5 H2O
0,40 g CoCl2 6 H2O

Tabla 4: Receta para caldo de A5 microelemento necesario para el medio BG-11.

Tiempo de la muestra (min) OD 665 nm OD 652 nm CHL un (mg/mL)
-1 0,563 0.373 5.986
0 0.428 0.33 4.154
5 0.112 0.046 1.432
10 0.024 0,036 0,084
15 0.027 0.025 0.226
30 0.007 0.002 0,097
60 0 0.061 0.000
120 0.007 0.061 0.000
180 0.005 0.012 0.000
240 0.005 0.012 0.000

Tabla 5: OD 665 y OD 652 medidas para Synechococcus en la presencia de caolín 50 g/L. CHL por valores se calculan utilizando la fórmula en el paso 4.4. Tenga en cuenta que muestras t6 y t7 faltan. Este es un ejemplo de no mantener un intervalo de muestreo consistente según el protocolo de muestreo de la célula. Datos de la norma es tomados de Playter, et al. (2017) 2.

Tiempo de la muestra (min) OD 665 nm OD 652 nm CHL un (mg/mL)
-1 0.384 0.345 3.309
0 1.863 1.739 15.497
5 0,64 0.528 5.916
10 0.217 0.216 1.690
15 0.104 0.089 0.934
30 0.126 0.169 0,609
60 0.424 0.402 3.474
90 0.115 0.048 1.463
120 0.016 0.007 0.201
180 0.012 0.004 0.161
240 0.011 0.005 0.136

Tabla 6: OD 665 y OD 652 medidas para Synechocystis en presencia de 50 g/L de caolín. CHL por valores se calcula utilizando la fórmula proporcionada en el paso 4.4.

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Discussion

Floculación, catalizada por la interacción de células cianobacterianas-arcilla ha atraído un gran interés en los campos de la ecología y la ingeniería2,3,4,5,6,7 ,8,9,10,11,12, sin embargo, la investigación de estas interacciones con la intención de modelar el depósito de sedimentación depósitos (como pizarras) es relativamente nuevo. La visualización de este proceso, en este caso para aplicaciones sedimentológicos, no se ha divulgado. En los últimos estudios de floculación, estas interacciones han sido investigadas por mezcla de arcilla y cianobacterias en frascos, tubos de ensayo o vasos y muestreo en tiempo discreto intervalos9,11,12, 26 para determinar los cambios en la concentración de células a través del tiempo. Estos estudios han medido la concentración de células cianobacterianas en maneras diferentes. Por ejemplo, las poblaciones de células cianobacterianas muestreados se han medido contando utilizando un microscopio9,11,12,26. En comparación con la concentración celular inicial, la eficiencia de remoción puede ser calculado9,11,12,26. En un estudio separado, después de permitir que la mezcla arcilla/celular colocar, el líquido restante sobre el sedimento de células colocadas/de la arcilla fue muestreado y analizado por fluorescencia estimar el número de células restantes en suspensión3. Las mediciones de la Chl un directamente en muestras de columna de agua también se han utilizado para calcular la concentración de la célula8,10.

Por el contrario, nuestra metodología mide las células en suspensión con el tiempo, partiendo de la metodología de Sengco, et al. 4 tomando mediciones en tiempos seleccionados durante todo el proceso, y vinculación de estos intervalos de tiempo con imágenes de video en tiempo real. Comparación con otros protocolos experimentales que implican el establecimiento de la arcilla en presencia de floculantes aniónicos, usando floculantes no biológicos (agentes floculante sintético), o biológico (algas o cianobacterias) nuestro análisis difiere en muchos cuenta. En primer lugar, nuestro estudio consiste en el uso de una especie marina cocoide de cianobacterias, mientras que muchos otros estudios involucran especies de agua dulce o especies que producen polisacárido extracelular sustancias5,23,24 , 25. Además, nuestro estudio implica el uso de un tanque estándar, dentro de la cual la solución permanece estática. Esto contrasta con estudios realizados utilizando tubos de ensayo o cilindros de3,12,14 o saetín de tanques, donde el fluido es una variable de interés6,7. La naturaleza estática de nuestro método experimental permite la medición instantánea de tasas de sedimentación, donde copo no se mantiene en suspensión por el flujo turbulento. Además, utilizando un tanque en lugar de un tubo de ensayo, frasco o vaso de precipitados, permite mejor visualización de los depósitos resultantes por los lados del tanque plano; las imágenes de vídeo no muestran distorsión debido a la curvatura y la luz se disperse uniformemente. En tercer lugar, la metodología describe a continuación medidas de tasas de floculación más corto (intervalos de 2 min) y largo plazo (intervalos de hora); Además, las imágenes pueden ser compiladas en escalas de segundos a minutos, lo que permite tanto la visualización del proceso y una medición adicional de la tasa de sedimentación. Mayoría estudios medida floculación más tarifas media hora intervalos5,6,23,25 o de simplemente medir el número final de células izquierda en suspensión después de una sola vez (2 – 2.5 h)9,24, aunque algunos estudios9 han medido los cambios en la célula o Chl una concentración sobre intervalos de minutos 2. El intervalo de muestra escogido es crítico, como la floculación puede ocurrir rápidamente (dentro de 5-10 min)22. Por último, una fuerza importante de nuestra metodología es que produce imágenes en tiempo real del proceso de floculación, no sólo de los agregados producidos (por ej., Avnimelech et al., 1982)24. Tener dos líneas de datos, la concentración celular de evidencia visual y muestreo, fortalece la confiabilidad de los resultados y apoya conclusiones sólidas.

Aunque conveniente para la medición de las tasas de floculación de la arcilla y cianobacterias, nuestro protocolo requiere diligencia en cuanto a la ubicación de la toma de muestras dentro del tanque. La misma área del tanque (x, y, z) debe ser muestreada cada vez o la muestra de resultados puede ser sesgado. También debe tenerse cuidado para permitir que todas las partículas a instalarse antes de las mediciones de OD. Pasos críticos incluyen: i) utilizando un intervalo de muestreo apropiado que permanece constante para todos los experimentos y ii) asegurar que los pellets de arcilla/cianobacterias es suficientemente rotos después de la adición de metanol para la extracción adecuada de clorofila de las células.

La técnica descrita aquí es también limitada al modelado de floculación en condiciones completamente oxigenadas. El aparato experimental y el procedimiento tendría que ser modificado para una columna de agua estratificada con aguas anóxicas inferior del modelo.

Dentro del contexto sedimentológico, este método tiene el potencial para ser aplicado a depósitos de modelado de arcilla diferentes proporciones o materiales biológicos para entender aspectos como los cambios en materia orgánica y salinidad desde la entrada fluvial. Además, los sedimentos producidos mediante este método pueden utilizarse para investigar el impacto de la tormenta potencial vuelve a trabajar sobre la coherencia de los flóculos por remezcla o agitación. Mediante el acople de la medición directa de la concentración celular de cianobacterias con imágenes visuales, este protocolo trasciende las aplicaciones tradicionales de los procesos de floculación de cianobacterias/arcilla y permite estos procesos a sedimentológicos modelado del disco rock.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores reconocen con gratitud la financiación de las ciencias naturales y Consejo de investigación ingeniería de Canadá (05448, 165831 y 213411).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cyanobacteria (in this study: Synechococcus sp. PCC 7002 and Synechocystis sp. PCC 6803) Pasteur Culture Collection PCC 7002 or PCC 6803 used to inoculate the plates
agar Thermo Scientific CM0003 used to fill two petri dishes
Petri plates (standard bacteriology, 100 x 15 mm) Sarstedt 82.1473.001 2 required
1 L heat resistant Erlenmeyer flask Pyrex 4980-125 1 required
250 mL heat resistant Erlenmeyer flask Pyrex 4980-250 1 required
Nichrome inoculating loop with handle Fisher Scientific 14-956-103 1 required
tinfoil Reynolds Wrap Aluminum Foil 89079-067 50 cm required; used to cover foam stopper and neck of erlenmeyer flasks
growth media (e.g. A+) 1050 mL required; produced using composition described in tables 1-4
Bunsen Burner Fisher Scientific S95941 1 required
plastic tubing Fisher Scientific S504591 1 m required; used to create the bubbling apparatus
sponge stopper Jaece Industries Inc 14-127-40E 1 required; hole made in center for pipette; used for constructin the bubbling apparatus
acrylic sheet  Home Depot Optix clear acrylic sheet model # MC-102S 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm)
clear waterproof silicone adhesive Home Depot Loctite clear silicone model # 908570 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm)
camera or video recorder Panasonic HC-V770 HD camcorder 1 required
tripod Magnus VT-300 1 required
black cloth primomart  EAN 0726670162199; Part number 680254blacknappedfr 1 required; duvetyne light block-out cloth; approximatly 152 x 213 cm to cover tank experiment
heat resistant serological pipet corning incorporated C708510 13-671-101G 1 required; used to create the bubbling apparatus
sample vials  Dynalon S30467 at least 12 (will vary with time interval chosen)
heat resistant glass pipette Fisher Scientific Corning Incorporated C708510, 13-671-101G 1 required; used to create the bubbling apparatus; Polystyrene serological pipet would also work, but should be connected to the tubing and stopper after the rest of the apparatus is autoclaved.
microcentrifuge Eppendorf 22 62 120-3  1 required;Comparable products may be used if capable of centrifuging 1.5 -2 mL microfuge tubes at 13,000 x g
vortex machine (Vortex-Genie 2) Scientific Industries, Inc SI-0236 1 required
100% methanol Fisher Scientific A412-500 SDS at least 12 mL (1mL per sample) required; Caution: Flammable, toxic. Wear gloves and safety glasses. Do not use or store near ignition source. Alternate sources may be used.
cuvettes (1.6  mL, polystyrene) Sarstedt 67.742 at least 12 required
spectrophotometer Fisher Scientific 222-271600 1 required; Pharmacia Biotech Novaspec ll could also be used.
light bulbs Home Depot model # 451807; internet #205477895; store SKU #1001061538 6-8 bulbs required to provide light for the tank experiments
pipette (Pipetman Classic P1000 Gilson F123602 used to collect samples
37 % Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 Caution: Corrosive and toxic. Wear lab coat, safety glasses and acid-resistant gloves while using. Prepared to 4 N before use by dilution into deionized water in a chemical fumehood.
Foam stopper (small) Canlab T 1385
Foam stopper (large) Canlab T 1387 Requires some intact stoppers and some with a single hole through the centre
30 °C incubator/growth room with continuous illumination 1 required
70 % Ethanol Fisher Scientific BP8201500 30 mL  required;Caution: Toxic and flammable. Wear lab coat and safety glasses
hydrophobic air filter (Midisart 2000, 0.2 µm) Sartorius 17805 1 required
clay (e.g. kaolin) Fisher Scientific MFCD00062311 at least 50 g required
microfuge tubes (2 mL, polypropylene) Sarstedt 72.695.500 Comparable products may be used. At least 12 (will vary with time interval chosen)
1000 µL pipet tips Sarstedt 70.762 1 required

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References

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Determinación de la tasa de asentamiento de arcilla/cianobacterias copo
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