Summary
يمكن التحقيق بالتفاعل والترسب من الطين والخلايا البكتيرية في نطاق البحرية، لوحظ في البيئات الطبيعية، أفضل في بيئة معملية خاضعة لمراقبة. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصلة، التي تحدد طريقة جديدة لقياس معدل ترسيب الطين وفلوككوليس سيانوباكتيريال.
Abstract
الآليات التي تدعم ترسب موضوعة بدقة، تجري مناقشات الرواسب العضوية الغنية لا تزال إلى حد كبير. على وجه التحديد، تحت هو دراسة أثر التفاعل بين جزيئات الطين مع الخلايا سيانوباكتيريال رد الفعل، والعوالق إلى السجل الرسوبي. وهذا التفاعل مساهما رئيسيا محتملاً نماذج ترسبية الزيتي. ضمن إعداد مختبر، يمكن دراسة معدلات هذه المواد معقمات والترسيب ويقاس في بيئة تسيطر عليها. هنا، نحن تفاصيل بروتوكول لقياس معدل الترسيب خلائط سيانوباكتيريال/الطين. وتتضح هذه المنهجية من خلال وصف العينة تجربتين: الأولى يستخدم الكاولين (المجففة شكل من أشكال كاولين) و سينيتشوكوككوس sp. المجلس المركزي الفلسطيني 7002 (البكتيريا البحرية كوككويد)، والثاني يستخدم الكاولين و سينيتشوسيستيس sp. 6803 PCC (البكتيريا كوككويد المياه العذبة). سيانوباكتيريال ثقافات مختلطة بمقادير متفاوتة من الطين داخل جهاز مصمم خصيصا لدبابات الأمثل للسماح بتسجيل الصور الفوتوغرافية والفيديو المستمر، في الوقت الحقيقي. وترد تفاصيل إجراءات أخذ العينات فضلا عن بروتوكول بعد جمع للقياس الدقيق للكلوروفيل من الذي يمكن تحديد تركيز سيانوباكتيريال الخلايا المتبقية في تعليق. من خلال النسخ المتماثل التجريبية، شيد الشخصية الذي يعرض معدل الترسيب.
Introduction
استخدام الظروف البيئية الحالية وعمليات الاستدلال في الماضي آليات ترسبية منذ فترة طويلة دعامة الترسبات. بينما استخدمت نظائر ترسبية الحديثة، مثل البحر الأسود، فهم ترسب الرواسب الغنية بالعضوية، وموضوعه بدقة، إمكانيات التجارب المختبرية لتسليط المزيد من الضوء على أصل الودائع الزيتي. منطقة واحدة للتحقيق في نشأة تتعلق الأسود هو معدل الترسيب، وآلية تشكيل الأصلي. تقليديا، قد تم الافتراض أن تتعلق الأسود شكلت في بيئات حيث معدل الترسيب، والإنتاجية الأولية ومعدلات التنفس مسألة العضوية تعزيز المحافظة على المواد العضوية في الرواسب1،2 ،3. ومع ذلك، دور سيانوباكتيريال ومعقمات الطين ظلت إلى حد بعيد [اونكنسدرد]. تسمح هذه الآلية من أشعة لسرعة ترسب الرواسب الغنية بالعضوية، وموضوعه بدقة تحدث، وليس بالضرورة الأكسجين المنخفض. ونظرا لهذا الافتراض، قد هذا البروتوكول هدفين: 1) قياس معدل الترسيب فلوككوليس سيانوباكتيريال/الطين، و 2) تصور عملية الترسيب في الوقت الحقيقي. وقد استخدمت هذه المنهجية، بالإضافة إلى التحليل الجيوكيميائي، تثبت أن أشعة سيانوباكتيريال/كلاي قد يكون في الواقع إليه هامة ل تشكيل الصخري1. بينما كانت مخصصة أصلاً لنمذجة الترسيب الصخري، أن هذا الأسلوب المنطبق على تخصصات أخرى مثل علم الأحياء والإصلاح البيئي حيث تأثير إدخال الطين على الأيض البكتيرية والسكان بحاجة إلى قياس.
أجريت دراسات عديدة لمراقبة معقمات من البكتيريا الزرقاء والطين، للتخفيف من حدة تكاثر الطحالب الضارة2،3،،من45،،من67 , 8 , 9 , 10 , 11 , 1 2-ومع ذلك، أثناء قياس تركيز الخلية مع مرور الوقت، هذه الدراسات لم يتقدم معقمات البكتيريا الزرقاء/الطين إلى نمذجة ترسب الصخور بسجل. على هذا النحو، أن هذه الدراسات تفتقر إلى عنصر مرئي، التي يمكن أن تكون حاسمة عند وضع النماذج في الماضي عمليات الترسب. بالإضافة إلى ذلك، استخدام معظم الدراسات عد الخلايا (مثل عموم et al. 11)، التي يمكن أن تكون شاقة. لدينا أسلوب، مع التقدم الذي أحرز مؤخرا في قياس أشعة سيانوباكتيريال، يحدد التغيرات في تركيز خلية سيانوباكتيريال بقياس الكلوروفيل (شيلي ) في فترات زمنية منفصلة. مزاوجة شيلي القياس مع البيانات البصرية هو نهج جديد، التي يمكن استخدامها للاستدلال على ظروف ترسبية. يمكن أيضا استخدام الصور التي تم إنشاؤها لحساب معدل الترسيب بعد العمل من Du وآخرون. 13-الجمع بين البيانات البصرية والرقمية ويعزز موثوقية النتائج. وعلاوة على ذلك، فإننا مخطط البروتوكولات الإضافية التي تسمح للترسب من الكتلة الأحيائية الميت والطين يحتفل به أيضا. هذا مهم عند النظر في الماضي بيئات الترسب، حيث يعيش، والكتلة الحيوية الميت قد يكون قد حدث شاركت. الاختلافات في السلوك للكتلة الأحيائية الميت أثناء أشعة (على سبيل المثال، انخفاض في معدل معقمات) يحتمل أن تكون آثار الترسب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الثقافات سيانوباكتيريال
-
إعداد الثقافات التطعيم باستخدام الوسائط الصلبة
- الحصول على خلايا سيانوباكتيريال أكسينيك من النوع الأميركي ثقافة جمع أو تحصيل الثقافة باستور. على سبيل المثال، حصل أحادي الخلية، والبحرية سينيتشوكوككوس sp. 7002 المجلس المركزي الفلسطيني من "جمع الثقافة باستور"، فإنه سيشار إلى الآخرة سينيتشوكوككوس.
- الحفاظ على خلايا سينيتشوكوككوس على لوحات تتضمن الوسائط الصلبة (+ وسائط سائلة14 و 1.5% أجار15). سوف تحال هذه إلى الآخرة كثقافات التطعيم.
- احتضان اللوحات في 32 ± 2 درجة مئوية مع استمرار الضوء المقدمة في 30 – 50 µmol الفوتونات m-2 s-1,15،18.
- كرر الخطوات من 1، 1، 1-3 واستبدال + وسائط الإعلام مع حرس الحدود-1116 في خطوة 1.1.2 لأنواع سيانوباكتيريال المياه العذبة، مثل سينيتشوسيستيس sp. 6803 المجلس المركزي الفلسطيني16،17، يشار إلى الآخرة ك سينيتشوسيستيس. الرجوع إلى الجداول 1-4 لتكوين وسائل الإعلام A + وحرس الحدود-11.
-
إعداد الثقافات السائل: يتطلب كل تجربة خزان واحد 400 مل سيانوباكتيريال الثقافة.
- جمع مل 250 واحد واثنين ل 1 قارورة Erlenmeyer المقاوم للحرارة.
- أشطف كل قارورة بمحلول حمض الهيدروكلوريك (HCl) م 4 (30 مل من محلول HCl لكل قارورة)، متبوعاً بالماء المقطر.
تنبيه: حمض الهيدروكلوريك الأكالة والسامة. ضمان أن يتم ارتداء معطف مختبر، ونظارات واقية، وقفازات مقاومة للأحماض أثناء استخدام الحل م 4 HCl. تنفيذ هذه الخطوة في بالوعة مختبر واتباع الأنظمة المحلية فيما يتعلق بالتخلص الحل HCl م 4 - ملء قارورة 250 مل مع 50 مل من سائل وسائط الإعلام (A + أو حرس الحدود-11). ملء قارورة 1 لتر واحد مع 400 مل من سائل وسائط الإعلام (A + أو حرس الحدود-11) وفي قارورة 1 لتر أخرى مع 600 مل من وسائل الإعلام (A + أو حرس الحدود-11).
- ختم كل قارورة مع سداده رغوة نفاذية غاز وتغطي الرقبة سداده وقارورة الرغوة مع ورق ألمونيوم.
- التسمية والاوتوكلاف قوارير في 121 درجة مئوية و 100 كيلو باسكال للحد الأدنى 25 تسمح قوارير لتبرد بدرجة حرارة الغرفة.
- تحضير غطاء الاندفاق الصفحي تعقيم السطح بالكحول 70%.
- جمع حلقة تطعيم أسلاك وموقد بنسن وقارورة الوسائط السائلة المبردة 50 مل (من الخطوة 1.2.5) وثقافة التطعيم (من الخطوة 1، 1). وضع هذه العناصر في هود تدفق معقمة.
- تعقيم في حلقة التطعيم الأسلاك بإيجاز استخدام شعلة الموقد بنسن والسماح لتبرد.
- اسحب الحلقة باردة على طول سطح ثقافة التطعيم لجمع الخلايا سيانوباكتيريال.
- إزالة سداده الرغوة وإحباط عملية النداء الموحد من قارورة 250 مل (دون لمس سداده الرغوة) وتعقيم حافة قارورة Erlenmeyer بها مرورا بإيجاز مع الشعلة.
- إمالة قارورة حتى وسائل الإعلام بالقرب من الرقبة قارورة وإدراج حلقة التطعيم المغلفة مع الخلايا إلى قارورة. مرة واحدة هي مغمورة في الحلقة في وسائط الإعلام، ضجة في حلقة التطعيم لإزالة الخلايا.
- إزالة التكرار الحلقي التطعيم وإعادة تعقيم شفة قارورة استخدام لهب الموقد بنسن.
- استبدال سداده الرغوة وإحباط عملية النداءات الموحدة على قارورة Erlenmeyer (بدون لمس سداده الرغوة).
- تعقيم في حلقة التطعيم بإيجاز داخل لهب الموقد بنسن.
- إعداد غرفة نمو (المشار إليها كقاعة النمو) حيث تقيم درجة الحرارة على 30 درجة مئوية15،18 وكثافة الضوء 30 – 50 الفوتونات µmol m s-2 -1،،من1518 . الرطوبة لا يتم التحكم بنشاط.
- تسمح ثقافة الملقحين 50 مل لاحتضان اهتزاز عند 150 دورة في الدقيقة في دائرة النمو، مع الحفاظ على درجة حرارة 30 درجة مئوية. الاحتفاظ بفم قارورة تغطيتها أثناء الانفعالات لمراقبة الخسائر التبخر ومنع التلوث.
- السماح ثقافة سيانوباكتيريال أن تنمو على ح 96. ينبغي أن تظهر أخضر ساطع ثقافة نجاح ويكون بكثافة بصرية (OD) في 750 نيوتن متر من 0.4 – 0.6.
- بمجرد الثقافة نمت بما فيه الكفاية، مكان ثقافة 50 مل وقارورة 1 لتر تحتوي على 400 مل من سائل وسائط الإعلام (من الخطوة 1.2.5) في هود الاندفاق الصفحي. ضمان تدفق هود هو الخطوة التالية معقمة 1.2.6.
- كرر الخطوة 1.2.10 كلا قوارير داخل غطاء الاندفاق الصفحي.
- من أجل ثقافة 50 مل إلى 400 مل من وسائل الإعلام في قارورة 1 لتر وإعادة تعقيم شفة قارورة 1 لتر باستخدام لهب الموقد بنسن.
- مكان رغوة سداده وإحباط عملية النداءات الموحدة، إرفاق جهاز محتدما عقيمة تتكون سداده الرغوة، ماصة، وأنابيب بلاستيكية، ومرشح في خط، وإحباط غطاء لفم قارورة.
- تحرض قارورة 1 لتر في 150 دورة في الدقيقة عند 30 درجة مئوية مع الجهاز bubbler يعلق على مضخة الهواء، الذي يعمم خليط هواء هوميديفيد من خلال ال15،الحل18 في 300 مل/دقيقة.
- السماح ثقافة أن تنمو داخل قاعة النمو عند 30 درجة مئوية ح 120 – 168. ثقافة نجاح ينبغي أن تظهر خضراء زاهية ولها التطوير التنظيمي750 نانومتر من 0.4 – 0.6.
- كرر الخطوة 1، 2 لإنتاج ثقافة الرقابة، والتي سوف لا تكون مختلطة بالطين.
- تجارب باستخدام الكتلة الحيوية الميت تتطلب خطوة إضافية. اﻷوتوكﻻف قارورة 1 لتر الثقافة لمدة 60 دقيقة في 121 درجة مئوية والسماح لها لتبرد بدرجة حرارة الغرفة.
2-التجريبية إعداد
- وضع خزان اكريليك مستطيلة (طولها 20 سم)، وعرض 5.1 سم، وارتفاعها 30 سم أمام أحد المصارف لمصابيح الفلورسنت (تسعة T8 المصابيح، لومن 2,600 على الأقل؛ الشكل 1) 19.
- ضع ورقة بلاستيكية شفافة، بيضاء بين بنك الأضواء وخزان لنشر الضوء، الذي يضيء طريق الدبابة. وكان هذا التشكيل مقتبسة من ساذرلاند et al. 19
- مارك الدبابة اﻷكريليك على ارتفاع 10 سم، تقاس رأسياً من القاعدة. وينبغي أن يتم كل القياسات في هذا الارتفاع في عمود الماء لضمان اتساق جميع العينات.
- وضع كاميرا على ترايبود، 1 متر أمام الدبابة لتسجيل كل تجربة. ويوصي بكاميرا فيديو كما يمكن استخراج الصور من ملفات الفيديو، ويمكن استخدام ملفات الفيديو باستخدام البرمجيات النمذجة الرياضية، نموذج تسوية ديناميات19ل.
- ضع قطعة من قماش أسود على البنك الخفيفة، والدبابات، وكاميرا درع التجربة من مصادر الضوء الخارجي (الشكل 1).
3-معقمات البروتوكول التجريبي
- جمع ثقافة 400 مل (الخطوة 1، 2) واسطوانه كبيرة و 600 مل من وسائط النمو الإضافي في قارورة ل 1 (الخطوة 1.2.5).
- تمييع ثقافة 400 مل (تركيز الخلية الأولى من 4 – 6 مغ/مل) مع وسائط النمو الإضافي (A + أو حرس الحدود-11) إلى الحجم النهائي ل 1 الاسطوانة باستخدام. إضافة هذا الحل إلى خزان اﻷكريليك.
- إعداد 2 مل [ميكروفوج] أنابيب بوضع العلامات ووضعها في موقع مناسب بالقرب من خزان اﻷكريليك. قياس 50 جرام طين للتجربة.
- بدء تسجيل الفيديو. وفي حالة تجارب متعددة، يمكن عقد علامة مع المعرف التجربة مؤقتاً أمام الكاميرا.
- استخدام ماصة، أخذ عينة 1 مل ووضعه في أنبوب مسمى [ميكروفوج]. استخدم هذا النموذج لتحديد عدد الخلايا سيانوباكتيريال الأولى بقياس التوجيه التشغيلي750 نانومتر القيم. تأخذ جميع العينات في ثلاث نسخ لضمان دقة النتائج.
- بسرعة صب الطين (50 غ) في الخزان مع الانفعالات قوية باستخدام عصا إثارة ل s 10 – 15.
- بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت وأخذ العينة الأولية 1 مل شيلي تحديد استخدام ماصة P1000 (نموذج الوقت0) .
- أخذ عينات إضافية في فترات زمنية مناسبة (مثلاً1 دقيقة، 2 دقيقة، 3 دقيقة، دقيقة 4، 5 دقيقة، 10 دقيقة، 15 دقيقة، 30 دقيقة، 60 دقيقة، 180 دقيقة ودقيقة 240).
- بمجرد الانتهاء من هذه التجربة، حفظ ملف الفيديو وإيقاف تشغيل كاميرا الفيديو، وتجهيز جميع العينات شيلي البت (الخطوة 4) .
- اﻷوتوكﻻف الحل الطين/سيانوباكتيريال المتبقية. تبعاً للأنواع سيانوباكتيريال واللوائح المحلية والسياسات مختبر، التخلص من الحل باستخدام الأساليب المناسبة. تنظيف الخزان بالماء، والصابون شطف مع الماء المقطر، والهواء الجاف لذلك.
- تعد تجربة التحكم بطين لا إضافة. أخذ العينات في نفس الوقت النقاط. ويمكن مقارنة هذه البيانات إلى بيانات تجريبية أخرى للتأكد من أن معدلات تسوية تتعزز بسبب معقمات مع الطين وليس نتيجة لتسوية الطبيعية.
- إذا تم استخدام الكتلة الأحيائية الميت أثناء التجربة، استخدم نفس الإجراء التجريبي. ومع ذلك، لا يتطلب إجراءات التخلص من الحل التعقيم.
4-عينة من المعالجة والتقييم
- تحديد شيلي تركيز في كل عينة الخلية باستخدام إجراء تعديل لمن أووتريم16. وبمجرد جمع، بيليه الخلايا من كل عينة لمدة 3 دقائق في 13,000 س ز باستخدام ميكروسينتريفوجي في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة الوسائط الزائدة باستخدام ماصة P1000 وإضافة 1 مل من 100 ٪ الميثانول (20 درجة مئوية). دوامة العينة بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة ريسوسبيند بيليه الخلية.
تنبيه: الميثانول السامة والقابلة للاشتعال. ارتداء القفازات ونظارات السلامة، والحفاظ على الميثانول بعيداً عن مصادر الاشتعال. - العينات من-20 درجة مئوية ح 24 لتيسير استخراج شيلي احتضانها.
- بعد الحضانة، بيليه الحطام الخلوية كما هو موضح في 4.1 ونقل الأخضر طافية إلى ومبومو استخدام ماصة ومكان ومبومو في إلى جهاز المطياف الضوئي. السماح عينة للراحة في جهاز المطياف الضوئي لمدة 1 دقيقة لضمان أن أي طين المتبقية ضمن العينة يستقر ولا تتداخل مع القياس.
- تحديد شيلي تركيز سبيكتروفوتوميتريكالي عن طريق قياس امتصاص في 665 شمال البحر الأبيض المتوسط وشمال البحر الأبيض المتوسط 652، والتطوير التنظيمي في 750 نانومتر. يتحدد في شيلي تركيز استخدام الصيغة شيلي = 16.29 x (665 -التطوير التنظيمي750)-8.54 x (652 -التطوير التنظيمي750) 20. شيلي تركيز كوكيل لتركيز الخلية. بالإضافة إلى ذلك، عامل التحويل من 7.4 × 1010 خلايا/L = 10 غرام/لتر21 يمكن استخدامها لحساب تركيز الخلية في غرام بعض الأنواع سيانوباكتيريال.
- حساب الأرض شيلي القيم مقابل الوقت .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عندما تتعرض للطين، تعرض الخلايا سيانوباكتيريال من تعليق22. ويتضح ذلك في نتائج ممثلة هنا. لتحديد أثر الطين على السكان سيانوباكتيريال ومراقبة الترسيب معدلات، تجربتين أجريت خلالها تعرضت سينيتشوكوككوس و سينيتشوسيستيس بطين الكاولين 50 غرام/لتر (الجدول 5-6، الشكل 2–3). وقد نمت الثقافات سيانوباكتيريال كما هو موضح في الخطوة 1. في وقت لاحق، تدفقت الدبابات بعد إقامة الخزان (الخطوة 2)، ثقافة سينيتشوكوككوس المخفف ومختلطة مع 50 جرام طين الكاولين بعد الخطوة 3. وتكررت هذه الثقافة سينيتشوسيستيس . جميع العينات التي جمعت من نفس الموضع في الدبابة. تم تجهيز العينات والقياسات OD652 والتطوير التنظيمي665 ، فضلا عن شيلي القيمة المحسوبة سينيتشوكوككوس (الجدول 5) سينيتشوسيستيس (الجدول 6). كانت هذه النتائج المرسومة بيانيا في قطع خط ومقارنة بنتائج المعايير تحديد ما إذا كان معدل الترسيب خلائط سيانوباكتيريال/الطين أعلى من معدل الترسيب الطبيعية من البكتيريا الزرقاء فقط. وتبين هذه النتائج أن سكان سيانوباكتيريال قد أخرجت من تعليق داخل 10 دقيقة من الطين التعرض (الشكل 2–3). البحرية سينيتشوكوككوس أظهر معدل ترسيب سريع أكثر من المياه العذبة التي سينيتشوسيستيس، وما يتسق مع الفرضية القائلة بأن الاتصالات تمكنت (سائدة في المتوسطة النمو، الذي يحاكي ملوحة المياه المالحة) تتصرف كوكيل لسد الثغرات بين جزيئات الطين والخلايا البكتيرية، وتيسير ومعقمات، ولذلك، الترسيب1.
من المهم ملاحظة أنه في الشكل 3، هناك بعض النتائج طولية عالية، وعلى وجه التحديد في بيانات النقطة 2. هذا مثال لتجهيز العينة أثناء الخطوة التي 4.4 لا بما فيه الكفاية وأعقب وأصبح عكر العينة أثناء أخذ القياس. وهذا ينتج نتيجة ارتفاع مصطنع (الشكل 2، بيانات النقطة 2). يتم توفير مثال عن الصور في السلاسل الزمنية، المستخرجة من شريط فيديو في الشكل 4، مقتبس من بلايتير وآخرون. 22-من المهم ملاحظة أن كاولين (لا الكاولين) استخدمت في بلايتير وآخرون. 22.
الشكل 1 : مخطط تفسيرية توضح الإعداد التجريبية. يتم إعداد كاميرا فيديو 1 متر على الأقل من الجهاز للدبابات. الخزان مليء 1 لتر من البكتيريا الزرقاء ووسائل الإعلام السائلة. أضواء تضيء الدبابة من الخلف وينتشر الضوء بفيلم شفافة. هو رايات هذا كله إعداد مع قطعة من قماش أسود للقضاء على مصادر الضوء إضافية. وقد تم تعديل هذا الرقم من ساذرلاند وآخرون. 19- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : شيلي تركيزات محسوبة من قيم التطوير التنظيمي الوارد في الجدول 1- هذه القيم من سينيتشوكوككوس/الكاولين الخليط (أصفر). مقارنة مع شيلي تركيزات سينيتشوكوككوس فقط (أزرق) يبين معدل ترسيب المتزايد الخليط سيانوباكتيريال/الطين. وقد تم تعديل هذا الرقم من بلايتير et al. 22- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: شيلي تركيزات محسوبة من قيم التطوير التنظيمي الوارد في الجدول 2- هذه القيم من سينيتشوسيستيس/الكاولين الخليط (أصفر). مقارنة مع شيلي تركيزات سينيتشوسيستيس فقط (أزرق) يبين معدل ترسيب المتزايد الخليط سيانوباكتيريال/الطين. وقد تم تعديل هذا الرقم من بلايتير et al. 22- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : دورة الوقت الممثل من سينيتشوكوككوس--كاولين ترسب. يتم استخراج هذه اللقطات من الفيديو المسجل في فترات زمنية منفصلة (1 دقيقة). وقد تم تعديل هذا الرقم من بلايتير et al. 22- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| للأم 1 |
| 18 جرام كلوريد الصوديوم |
| غ 0.6 بوكل |
| ز 1 نانو3 |
| 5 ز مجسو ∙4 7 ح2س |
| 1 مل خ2ص4 |
| 7.2 مل كاكل2 |
| يدتا ميكروليتر 161 نا2 |
| 1 مل فيكل ∙3 6 ح2س |
| 10 مل HCl تريس pH 8.2 |
| المعادن 1 مل P1 الأوراق المالية * |
الجدول 1: وصفه لوسائل الإعلام + 14 . الرجوع إلى الجدول 2 لتكوين مخزون المعادن P1. وتنتج هذه الوصفة ل 1 من وسائط الإعلام.
| 1 ل P1 مخزون المعادن |
| بو 34.26 ز ح33 |
| ز 4.32 الحركة ∙2 ح2س |
| ز 0.315 زنكل |
| ز 0.03 مو3 (85%) |
| ز 0.003 CuSO ∙4 ح 52س |
| ز 0.01215 كوكل ∙2 6 س2س |
الجدول 2: وصفه ل P1 المعادن الأسهم المطلوبة لوسائل الإعلام +.
| للأم 1 |
| مل 10 نانو3 |
| 1 مل ك2هبو4 |
| 1 مل مجسو47 ح2س |
| 1 مل كاكل2 ح 22س |
| 1 مل حامض الستريك ح2س |
| سترات الأمونيوم الحديديك 1 مل |
| 1 مل دينايدتا |
| 1 مل Na2CO3 |
| 1 مل A5 النزرة * |
الجدول 3: وصفه لحرس الحدود-11 وسائل الإعلام 16 . الرجوع إلى الجدول 4 لتكوين النزرة A5. وتنتج هذه الوصفة ل 1 من وسائط الإعلام.
| ل 1 لتر حل الأسهم |
| بو 2.86 ز ح33 |
| ز 1.81 الحركة2 4 ح2س |
| ز 0.222 زنسو4 7 ح2س |
| ز 0.390 نا2مو4 2 ح2س |
| ز 0.079 CuSO4 ح 52س |
| ز 0.40 كوكل2 6 س2س |
الجدول 4: وصفه للأسهم المثرى A5 المطلوبة لوسائل الإعلام جي-11.
| نموذج الوقت (دقيقة) | OD 665 شمال البحر الأبيض المتوسط | OD 652 شمال البحر الأبيض المتوسط | شيلي (mg/mL) |
| -1 | 0.563 | 0.373 | 5.986 |
| 0 | 0.428 | 0.33 | 4.154 |
| 5 | 0.112 | 0.046 | 1.432 |
| 10 | 0.024 | 0.036 | 0.084 |
| 15 | 0.027 | 0.025 | 0.226 |
| 30 | 0.007 | 0.002 | 0.097 |
| 60 | 0 | 0.061 | 0.000 |
| 120 | 0.007 | 0.061 | 0.000 |
| 180 | 0.005 | 0.012 | 0.000 |
| 240 | 0.005 | 0.012 | 0.000 |
الجدول 5: OD 665 والتطوير التنظيمي 652 قياسات سينيتشوكوككوس حضور طين الكاولين 50 غرام/لتر. شيلي القيم يتم حسابها باستخدام الصيغة في الخطوة 4، 4. علما أن عينات t6 و t7 مفقودة. وهذا مثال على عدم الاحتفاظ بفاصل زمني عينة متسق وفقا لبروتوكول أخذ العينات في الخلية. البيانات للمعيار مأخوذ من بلايتير، وآخرون. (2017) 2.
| نموذج الوقت (دقيقة) | OD 665 شمال البحر الأبيض المتوسط | OD 652 شمال البحر الأبيض المتوسط | شيلي (mg/mL) |
| -1 | 0.384 | 0.345 | 3.309 |
| 0 | 1.863 | 1.739 | 15.497 |
| 5 | 0.64 | 0.528 | 5.916 |
| 10 | 0.217 | 0.216 | 1.690 |
| 15 | 0.104 | 0.089 | 0.934 |
| 30 | 0.126 | 0.169 | 0.609 |
| 60 | 0.424 | 0.402 | 3.474 |
| 90 | 0.115 | 0.048 | 1.463 |
| 120 | 0.016 | 0.007 | 0، 201 |
| 180 | 0.012 | 0.004 | 0.161 |
| 240 | 0.011 | 0.005 | 0.136 |
الجدول 6: OD 665 والتطوير التنظيمي 652 قياسات سينيتشوسيستيس حضور طين الكاولين 50 غرام/لتر. شيلي قيم تحسب باستخدام الصيغة الواردة في الخطوة 4، 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
معقمات تحفزها التفاعل سيانوباكتيريال من الفخار الخلية قد جذبت الكثير من الاهتمام في مجالات البيئة والهندسة2،،من34،،من56،7 ،8،9،10،11،12، إلا أن التحقيق في هذه التفاعلات مع القصد من وضع نماذج ترسب الرسوبية الودائع لأجل (مثل تتعلق) جديدة نسبيا. التصور من هذه العملية، وفي هذه الحالة للتطبيقات الترسب، لا أبلغ. في الدراسات السابقة معقمات، حققت هذه التفاعلات بخلط الطين والبكتيريا الزرقاء في الجرار وأنابيب الاختبار، أو قنينة، وأخذ العينات في الوقت منفصلة فترات9،11،12، 26 لتحديد التغيرات في تركيز الخلية عبر الزمن. هذه الدراسات قد قياس تركيز خلايا سيانوباكتيريال بطرق مختلفة. على سبيل المثال، تم قياس السكان خلية سيانوباكتيريال أخذ عينات عن طريق العد باستخدام مجهر9،11،،من1226. بالمقارنة مع تركيز الخلية الأولى، يمكن أن تكون كفاءة إزالة المحسوبة9،11،،من1226. في دراسة منفصلة، بعد السماح لخليط الطين/خلية لتسوية، السوائل المتبقية فوق الرواسب استقر خلية/الطين عينات وتحليلها للأسفار لتقدير عدد الخلايا المتبقية في تعليق3. كما استخدمت القياسات من شيلي مباشرة من عينات عمود المياه لحساب الخلية تركيز8،10.
وفي المقابل، تدابير منهجيتنا الخلايا في تعليق على مر الزمن، بناء على منهجية سينجكو, et al. 4 قبل أخذ القياسات في تحديد الأوقات طوال العملية، وإقران هذه الفواصل الزمنية مع تصوير الفيديو في الوقت الحقيقي. بالمقارنة مع البروتوكولات التجريبية الأخرى التي تنطوي على تسوية الطين حضور المرسب أنيونى، استخدام البيولوجية (الطحالب أو البكتيريا الزرقاء) أو منتجات غير البيولوجية (وكلاء ندفا الاصطناعية)، أما تحليلنا يختلف في العديد التهم الموجهة إليه. أولاً، دراستنا ينطوي على استخدام الأنواع البحرية كوككويد من البكتيريا الزرقاء، في حين أن العديد من الدراسات الأخرى التي تنطوي على أنواع المياه العذبة أو الأنواع التي تنتج خارج الخلية السكاريد المواد5،،من2324 , 25-بالإضافة إلى ذلك، لدينا دراسة ينطوي على استخدام خزان القياسية، والذي ما زال الحل ثابتة. وهذا يتناقض مع الدراسات التي أجريت باستخدام أنابيب الاختبار أو اسطوانات3،12،14 أو المسايل الدبابات، حيث تدفق السائل متغير لفائدة6،7. تسمح طبيعة ثابتة لدينا طريقة تجريبية لقياس معدلات الترسب الأساس، حيث فلوككوليس لا تحتفظ في وقف تدفق المضطرب. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام خزان بدلاً من أنبوب اختبار، جرة، أو الكأس، يسمح للتصور أفضل من الرواسب الناتجة بسبب الدبابات مسطحة الجانبين؛ إظهار صور الفيديو أي تشويه بسبب التقويس والضوء موزعة بالتساوي. ثالثا، المنهجية المبينة في هذا التقرير التدابير معدلات معقمات على مدى قصير (الفواصل 2 دقيقة) وطويلة الأجل (فترات ساعة)؛ بالإضافة إلى ذلك، يمكن تجميع الصور في جداول ثانية إلى دقائق، السماح لكل من التصور عملية، وقياس معدل تسوية إضافية. معظم الدراسات قياس أشعة أسعار ما يزيد على نصف ساعة كاملة فترات5،6،،من2325 أو مجرد تدبير العدد النهائي للخلايا اليسار في تعليق بعد وقت واحد نقطة (2 – 2.5 ح)24من9،، على الرغم من أن بعض الدراسات9 بقياس التغيرات في الخلية أو شيلي تركيز على مدى فترات زمنية دقيقة 2. الفاصل الزمني للعينة المختارة أمر بالغ الأهمية، كما يمكن أن يحدث معقمات سريعاً (في غضون 5-10 دقيقة)22. أخيرا، قوة رئيسية لأعمالنا المنهجية أنها تنتج الصور في الوقت الحقيقي من عملية معقمات، لا مجرد المجاميع المنتجة (مثلاً., أفنيميليتش et al., 1982)24. وبعد سطرين من البيانات، وتركيز خلية من الأدلة المرئية وأخذ العينات، يعزز موثوقية النتائج وتؤيد استنتاجات قوية.
بينما مناسبة لقياس معدلات معقمات من الطين والبكتيريا الزرقاء، ولدينا البروتوكول يتطلب الحرص فيما يتعلق بموقع أخذ العينات داخل الصهريج. يجب أخذ عينات في نفس منطقة الخزان (x, y, z) في كل مرة، أو يمكن أن تصبح منحرفة نتائج العينة. كما يجب الحرص على السماح لجميع الجسيمات تسوية قبل أن يتم إجراء قياسات OD. وتشمل الخطوات الحاسمة: ط) استخدام الفاصل زمني أخذ عينات مناسبة التي تظل متسقة لجميع التجارب، وثانيا) ضمان أن بيليه الطين/سيانوباكتيريال مكسورة بما فيه الكفاية بعد إضافة الميثانول لضمان استخراج كافية الكلوروفيل من الخلايا.
الأسلوب الموصوفة هنا أيضا محدودة لنمذجة أشعة تحت ظروف اﻷوكسيجين تماما. جهاز تجريبي والإجراء الذي سوف تحتاج إلى تعديل لنموذج عمود مياه طبقية مع مياه القاع وصول.
وفي سياق الترسب، يحتوي هذا الأسلوب يمكن أن تطبق على ودائع النمذجة من نسب مختلفة من الطين أو المواد البيولوجية من أجل فهم الجوانب مثل التغييرات في المواد العضوية والملوحة من مدخلات النهرية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الرواسب تنتج باستخدام هذا الأسلوب التحقق من أثر العاصفة إمكانية استئناف العمل على تماسك نويفوليون بالتعديل أو بالتحريض. بالأقران قياس مباشر لتركيز خلية سيانوباكتيريال مع الصور المرئية، هذا البروتوكول تتجاوز التطبيقات التقليدية من البكتيريا الزرقاء/طين معقمات العمليات ويسمح لهذه العمليات ليتم تطبيقها على الترسب نماذج من سجل روك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب الاعتراف بامتنان التمويل من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث الكندي (05448 و 165831 و 213411).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cyanobacteria (in this study: Synechococcus sp. PCC 7002 and Synechocystis sp. PCC 6803) | Pasteur Culture Collection | PCC 7002 or PCC 6803 | used to inoculate the plates |
| agar | Thermo Scientific | CM0003 | used to fill two petri dishes |
| Petri plates (standard bacteriology, 100 x 15 mm) | Sarstedt | 82.1473.001 | 2 required |
| 1 L heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-125 | 1 required |
| 250 mL heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-250 | 1 required |
| Nichrome inoculating loop with handle | Fisher Scientific | 14-956-103 | 1 required |
| tinfoil | Reynolds Wrap Aluminum Foil | 89079-067 | 50 cm required; used to cover foam stopper and neck of erlenmeyer flasks |
| growth media (e.g. A+) | 1050 mL required; produced using composition described in tables 1-4 | ||
| Bunsen Burner | Fisher Scientific | S95941 | 1 required |
| plastic tubing | Fisher Scientific | S504591 | 1 m required; used to create the bubbling apparatus |
| sponge stopper | Jaece Industries Inc | 14-127-40E | 1 required; hole made in center for pipette; used for constructin the bubbling apparatus |
| acrylic sheet | Home Depot | Optix clear acrylic sheet model # MC-102S | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| clear waterproof silicone adhesive | Home Depot | Loctite clear silicone model # 908570 | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| camera or video recorder | Panasonic | HC-V770 HD camcorder | 1 required |
| tripod | Magnus | VT-300 | 1 required |
| black cloth | primomart | EAN 0726670162199; Part number 680254blacknappedfr | 1 required; duvetyne light block-out cloth; approximatly 152 x 213 cm to cover tank experiment |
| heat resistant serological pipet | corning incorporated C708510 | 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus |
| sample vials | Dynalon | S30467 | at least 12 (will vary with time interval chosen) |
| heat resistant glass pipette | Fisher Scientific | Corning Incorporated C708510, 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus; Polystyrene serological pipet would also work, but should be connected to the tubing and stopper after the rest of the apparatus is autoclaved. |
| microcentrifuge | Eppendorf | 22 62 120-3 | 1 required;Comparable products may be used if capable of centrifuging 1.5 -2 mL microfuge tubes at 13,000 x g |
| vortex machine (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries, Inc | SI-0236 | 1 required |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-500 SDS | at least 12 mL (1mL per sample) required; Caution: Flammable, toxic. Wear gloves and safety glasses. Do not use or store near ignition source. Alternate sources may be used. |
| cuvettes (1.6 mL, polystyrene) | Sarstedt | 67.742 | at least 12 required |
| spectrophotometer | Fisher Scientific | 222-271600 | 1 required; Pharmacia Biotech Novaspec ll could also be used. |
| light bulbs | Home Depot | model # 451807; internet #205477895; store SKU #1001061538 | 6-8 bulbs required to provide light for the tank experiments |
| pipette (Pipetman Classic P1000 | Gilson | F123602 | used to collect samples |
| 37 % Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Caution: Corrosive and toxic. Wear lab coat, safety glasses and acid-resistant gloves while using. Prepared to 4 N before use by dilution into deionized water in a chemical fumehood. |
| Foam stopper (small) | Canlab | T 1385 | |
| Foam stopper (large) | Canlab | T 1387 | Requires some intact stoppers and some with a single hole through the centre |
| 30 °C incubator/growth room with continuous illumination | 1 required | ||
| 70 % Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 30 mL required;Caution: Toxic and flammable. Wear lab coat and safety glasses |
| hydrophobic air filter (Midisart 2000, 0.2 µm) | Sartorius | 17805 | 1 required |
| clay (e.g. kaolin) | Fisher Scientific | MFCD00062311 | at least 50 g required |
| microfuge tubes (2 mL, polypropylene) | Sarstedt | 72.695.500 | Comparable products may be used. At least 12 (will vary with time interval chosen) |
| 1000 µL pipet tips | Sarstedt | 70.762 | 1 required |
References
- Macquaker, H. S., Keller, M. A., Davies, S. J. Algal blooms and "marine snow": mechanisms that enhance preservation of organic carbon in ancient fine-grained sediments. J. Sediment. Res. 80, 934-942 (2010).
- Tyson, R. V. Sedimentation rate, dilution, preservation and total organic carbon: some results of a modeling study. Org. Geochem. 32, 333-339 (2001).
- Piper, D. Z., Calvert, S. E. A marine biogeochemical perspective on black shale deposition. Earth-Sci. Rev. 95, 63-96 (2009).
- Sengco, M. R., Li, A. S., Tugend, K., Kulis, D., Anderson, D. M. Removal of red- and brown-tide cells using clay flocculation I. Laboratory culture experiments with Gymnodiniumbreve and Aureococcus anophagefferens. Mar. Ecol. Prog. Ser. 210, 41-53 (2001).
- Guenther, M., Bozelli, R. Factors influencing algae-clay aggregation. Hydrobiologia. 523, 217-223 (2004).
- Archambault, M. -C., Grant, J., Bricelj, V. M. Removal efficiency of the dinoflagellate Heterocapsa triquetra by phosphatic clay and implications for the mitigation of harmful algal blooms. Mar. Ecol. Prog. Ser. 253, 97-109 (2003).
- Beaulieu, S. E., Sengco, M. R., Anderson, D. M. Using clay to control harmful algal blooms: deposition and resuspension of clay/algal flocs. Harmful Algae. 4, 123-138 (2005).
- de Magalhães, L., Noyma, N., Furtado, L., Mucci, M., van Oosterhout, F., Husza, V., Marinho, M., Lürling, M. Efficacy of coagulants and ballast compounds in removal of cyanobacteria (Microcystis) from water of the tropical lagoon Jacarepaguá (Rio de Janeiro, Brazil). Estuaries and Coasts. 40, 121-133 (2017).
- Li, L., Pan, G. A universal method for flocculating harmful algal blooms in marine and fresh waters using modified sand. Environ. Sci. Tech. 47, 4555-4562 (2013).
- Miranda, M., Noyma, N., Pacheco, F. S., de Magalhães, L., Pinto, E., Santos, S., Soares, M., Huszar, V., Lürling, M., Marinho, M. The efficiency of combined coagulant and ballast to remove harmful cyanobacterial blooms in a tropical shallow system. Harmful Algae. 65, 27-39 (2017).
- Pan, G., Chen, J., Anderson, D. Modified local sands for the mitigation of harmful algal blooms. Harmful Algae. 10, 381-387 (2011).
- Shi, W., Tan, W., Wang, L., Pan, G. Removal of Microcystis aeruginosa using cationic starch modified soils. Water Research. 97, 19-25 (2016).
- Du, J., Pushkarova, R. A., Smart, R. A cryo-SEM study of aggregate and floc structure changes during clay settling and raking processes. Int. J. Miner. Process. 93, 66-72 (2009).
- A+ Medium Recipe, 2017. UTEX Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin. , Available from: http://web.biosci.utexas.edu/utex/Media%20PDF/a%20plus%20medium.pdf (2017).
- Stevens, S. E., Porter, R. D. Transformation in Agmenellum quadruplicatum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 6052-6056 (1980).
- Owttrim, G. W. RNA helicases in cyanobacteria: biochemical and molecular approaches. Methods Enzymol. 511, 385-403 (2012).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. Microbiology. 111, 1-61 (1979).
- Chamot, D., Owttrim, G. W. Regulation of cold shock-induced RNA helicase gene expression in the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol. 182, 1251-1256 (2000).
- Sutherland, B. R., Barrett, K. J., Gingras, M. K. Clay settling in fresh and salt water. Environ. Fluid Mech. 15, 147-160 (2014).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 975, 384-394 (1989).
- Liu, Y. X., Alessi, D. S., Owttrim, G. W., Petrash, D. E., Mloszewska, A. M., Lalonde, S. V., Martinez, R. E., Zhou, Q. X., Konhauser, K. O. Cell surface reactivity of Synechococcus sp. PCC 7002: implications for metal sorption from seawater. Geochim. Cosmochim. Acta. 169, 30-44 (2015).
- Playter, T., Konhauser, K., Owttrim, G., Hodgson, C., Warchola, T., Mloszewska, A. M., Sutherland, B., Bekker, A., Zonneveld, J. -P., Pemberton, S. G., Gingras, M. Microbe-clay interactions as a mechanism for the preservation of organic matter and trace metal biosignatures in black shales. Chem Geol. 459, 75-90 (2017).
- Verspagen, J. M. H., Visser, P. M., Huisman, J. Aggregation with clay causes sedimentation of the buoyant cyanobacteria Microcystis spp. Aquat. Microb. Ecol. 44, 165-174 (2006).
- Avnimelech, Y., Troeger, B. W., Reed, L. W. Mutual flocculation of algae and clay: evidence and implications. Science. 216, 63-65 (1982).
- Chen, L., Men, X., Ma, M., Li, P., Jiao, Q., Lu, S. Polysaccharide release by Aphanothece halophytica inhibits cyanobacteria/clay flocculation. J. Phycol. 46, 417-423 (2010).
- Pan, G., Zhang, M. -M., Chen, H., Zou, H., Yan, H. Removal of cyanobacterial blooms in Taihu Lake using local soils. I. Equilibrium and kinetic screening on the flocculation of Microcystis aeruginosa using commercially available clays and minerals. Environ. Poll. 141, 195-200 (2006).
