Summary
כאן, אנו מדווחים על כסף ופשוט נמוכים מכתים פרוטוקול אשר דורש רק שלושה ריאגנטים, 7 דקות של עיבוד, מתאימה לדור מהירה של נתונים איכותיים הסובייטית בניתוח גנטי.
Abstract
חזור על הרצף פשוטה (הסובייטית) הוא אחד הסמנים היעיל ביותר בשימוש מחקר גנטי החי והצומח ותוכניות השבחה מולקולרית. צביעת כסף היא שיטה בשימוש נרחב עבור זיהוי סמני הסובייטית לזיהוי ג'ל. עם זאת, פרוטוקולים קונבנציונליים עבור צביעת כסף הם טכנית תובעניים ולגזול. כמו רבים אחרים מעבדה ביולוגית טכניקות, כסף מכתים פרוטוקולים מוטבו בהתמדה לשיפור יעילות הזיהוי. כאן, אנו מדווחים כסף פשוטה מכתים שיטת מפחית עלויות ריאגנט ומגבירה באופן משמעותי את הבהירות ברזולוציה ותמונה של זיהוי. השיטה החדשה דורש שני שלבים עיקריים (הספגה ופיתוח) שלושה ריאגנטים (חנקת הכסף נתרן הידרוקסידי, פורמלדהיד), ואת רק 7 דקות של עיבוד עבור ג'ל לזיהוי שאינם denaturing. לעומת פרוטוקולים שדווחה בעבר, שיטה חדשה תהיה קלה יותר, מהר יותר ומשתמש ריאקטיבים כימיים פחות לגילוי הסובייטית. לכן, זה כסף פשוטה, בעלות נמוכה ויעיל מכתים פרוטוקול ייהנו מיפוי גנטי והשבחה בסיוע סמן על ידי דור מהירה של נתונים סמן הסובייטית.
Introduction
הפיתוח של סמנים מבוססי ה-PCR יש מהפכה המדע של הצמח גנטיקה, רבייה1. סמנים (הסובייטית) אני חוזר פשוט רצף הם בין סמני DNA הנפוצות ביותר ואת הרב-גוניים ביותר. כיסוי רחב הגנום שלהם, לשפע, ירידה לפרטים הגנום, הדיר הם חלק היתרונות של סמנים הסובייטית בנוסף ירושה codominant שלהם עבור זיהוי אחרים משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים2. מספר מחקרים השתמשו הסובייטית סמנים כדי לחקור מגוון גנטי, לעקוב אחר שושלת, לבנות תאחיזה מפות, מיפוי גנים עבור תכונות כלכלית3,4.
מוצרי ה-PCR של סמני הסובייטית בדרך כלל מופרדים באמצעות agarose או לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה ולאחר מכן דמיינו עם צביעת כסף או תחת אור UV לאחר צביעת עם אתידיום ברומיד. צביעת כסף שברי DNA ב לזיהוי ג'לים רגיש יותר אחרים מכתימים שיטות5,6 , כבר בשימוש נרחב לאיתור שברי DNA כגון סמני הסובייטית7.
כמו רבים וטכניקות מעבדה ביולוגית, צביעת כסף של ג'ל לזיהוי בהתמדה השתפר מאז שלה קודם להיות כפי שדווח טכניקה ויזואליזציה שבר ב- 1979-8. השיטה שונתה בתחילה לזיהוי שברי DNA מאת בסאם. et al. 6 ב-1991, אז משופרת על ידי סאנגינטי ועמיתיו9 בשנת 1994. השיטה מוטבה עוד יותר האחרון כמה עשורים6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. עם זאת, רוב אלה הגירסאות המעודכנות של הפרוטוקולים עדיין יש מספר חסרונות כגון דרישה טכנית גבוהה, זמן עיבוד זמן קיבעון והרכבה6, המגבילות את היישום של פרוטוקולים אלה7, 11. פרוטוקול אופטימלית המשלב נמוכים עם יעילות גבוהה של זיהוי מקטע ה-DNA הוא צורך דחוף עבור יישום שגרתי של כסף מכתים במחקר הביולוגי.
בנוסף, ניתן לחלק לזיהוי ג'ל ג'ל לזיהוי denaturing ו- denaturing, שניהם יכול לשמש עבור זיהוי סמנים הסובייטית באמצעות הכסף מכתים בשיטה. אפקט והרזולוציה של אשר לא משמעותית שונות, אך ללא denaturing לזיהוי ג'לים להקל על תהליך לקחת פחות זמן16.
הקודמת מחקר15, מטרת המחקר הנוכחי הוא הוא לתיאור של כסף ממוטבת מכתים פרוטוקול בפירוט לגילוי מהיר, קל וזה נמוכים של סמני הסובייטית ג'ל לזיהוי שאינם denaturing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מוצרי ה-PCR של סמני הסובייטית
- להכין כל כימיקלים, ריאגנטים עבור תגובות PCR כולל תבנית ה-DNA (30 ng/µL), מיקס מאסטר PCR × 2 (מכיל 2 × PCR מאגר, 0.4 מ מ כל dNTP, 3 מ מ של MgCl2, 0.1 U µL Taq DNA פולימראז ו צבע), 10 מיקרומטר של כל אחד קדימה ולהפוך תחל , ואת מזוקקים או יונים מים (dH2O).
הערה: סמני הסובייטית השתמשו במחקר הנוכחי היו PT51333 (להעביר רצף פריימר: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3', רצף פריימר הפוכה: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') ו PT50903 (להעביר רצף פריימר: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' ו הפוך רצף פריימר: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3') טבק, CX-43 (להעביר רצף פריימר: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' הפוכה פריימר רצף: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') ו- CX-157 (להעביר רצף פריימר: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' הפוכה רצף פריימר: 5 '- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3') עבור כרוב סיני פורח. - היכונו µL 10 של ה-PCR מיקס הגברה על-ידי הוספת 2 µL של תבנית ה-DNA, 5 µL של מיקס מאסטר PCR × 2, µL 0.2 של כל פריימר לפנים, לאחור פריימר µL 2.6 של dH2O.
- לבצע PCR הגברה התגובה thermocycler עם צעד ראשוני של 94 º C למשך 5 דקות, בעקבות 38 מחזורים של 45 s ב 94 ° C עבור דנטורציה, 45 s-55 ° C עבור חישול פריימר 1 דקות ב-72 מעלות עבור סיומת ו צעד סיומת הסופי של 10 דקות-72 מעלות C; אז לאחסן PCR מוצרים ב- 4 ° C לשימוש מאוחר יותר.
2. הכנה של פתרונות לזיהוי ג ' לים-יציקה
- להכנת 1 ליטר של מאגר TBE × 5 על ידי המסת 54 גר' טריס הבסיס ו- 27.5 g פנמיות dH2O, הוספת 20 מ של EDTA 0.5 M (pH 8.0) התאמת הפתרון הסופי נפח של 1, 000 מ ב- dH2O.
הערה: מאגר TBE ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר במשך חודשים. - להכין 2 ל' 0.5 × TBE מאגר על-ידי הוספת 200 מ ל 5 × TBE מאגר dH2O לאמצעי הסופי של 2 ליטר, לשמור בטמפרטורת החדר.
- להכין פתרון 6% שאינם denaturing ג'ל לזיהוי על ידי המסת 29 גרם של ביולוגיה מולקולרית אקרילאמיד כיתה ו- 1g של ביולוגיה מולקולרית כיתה N, N'-methylenebisacrylamide במאגר TBE × 0.5 לאמצעי הסופי של 500 מ"ל. מכסים את הבקבוק פתרון עם רדיד אלומיניום וחנות ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר.
התראה: אקרילאמיד נחשב רעלן עצבי חזק, צריך להיות מטופל לטיפול. תמיד ללבוש כפפות בעת שקילה אבקת ופתרונות טיפול המכילים אותו. - להכין 20% אמוניום persulfate (APS) פתרון על ידי המסת 2 גר' APS עם dH2O לאמצעי הסופי של 10 מ"ל. ניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס במשך חודשים.
הערה: לנוחיותכם, 10 מ של 20% APS פתרון יכולה להיות aliquoted לתוך 1.5 mL או 2 מ"ל של צינורות צנטריפוגה עבור אחסון ב-20 ° C. הפשרת ומערבבים היטב לפני השימוש. - להכין פתרון bind מדולל-silane על ידי המסת µL 3 של bind-silane ב 0.997 מ של 95% כוהל המכילה 0.5% של חומצה אצטית. ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך שבועות.
התראה: Bind-silane הוא רעיל, יש ללבוש כפפות בעת טיפול הפתרון ולשמור על חדר מאוורר.
3. הכנה של לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה
- סט אחד שטיפת צלחות זכוכית, מפרידי עם חומר ניקוי במי ברז, ולאחריה שטיפה מלאה עם dH2O. אוויר יבש את הצלחות על-ידי הגדרת אותם בצלחת מקלב.
- לפזר 1 מ"ל של bind-silane פתרון על גבי המשטח הפנימי של צלחת זכוכית מלבני, ויבש במשך 5 דקות.
הערה: אם זה הפתרון bind-silane אינם מתפשטים בצורה אחידה על פני השטח של הלוח, הג'ל עשוי להיות מנותק במהלך צביעת וגוררים אפקט ההגדלה משביעת רצון. - לפזר 1 מ"ל של להדוף-silane על גבי השטח הפנימי של צלחת זכוכית מחורצים עם מקלון לנגב את עודף להדוף-silane עם נייר טישו, אוויר יבש במשך 5 דקות.
הערה: אם repel-silane לא מעיל השטח של לוח הזכוכית בצורה אחידה, זה עלול לגרום נזק את הג'ל על ידי הפשטת חלקית. - להרכיב צלחות זכוכית עם מפרידי עם לוחית מחורץ למעלה, תהדק את שני הצדדים של ההרכבה עם השלכת מלחציים.
- יוצקים את הכמות המתאימה (40 מ ל) של 6%-denaturing ג'ל לזיהוי פתרון גביע עבור ערכת צלחת 33 ס מ רוחב × 10 ס מ גובה, מרווח עובי 1.5 מ מ, להוסיף 20 µL של tetramethylethylenediamine (TEMED) ו- 200 µLfresh 20% APS ומערבבים בעדינות.
הערה: הכמות המתאימה (40 מ ל) של ג'ל פתרון חושבה מאמצעי האחסון הפנימי של שתי צלחות עם עובי של מפרידי (30 ס"מ × 8.5 ס"מ × 0.15 ס מ). לגבי הסכום של TEMED APS עבור ג'ל פלמור, יש יחס הסטנדרטי של פתרון ג'ל TEMED ו APS בהתבסס על הפניית ה-17. הפתרון ג'ל שתוארו לעיל מאוחסן ב 4 º C. אם הפתרון ג'ל מאוחסן בטמפרטורת החדר, 20 µL של TEMED ו- µL 100 של 20% APS אמור לשמש. מערבבים בעדינות את התערובת של ג'ל פתרון עם מקל זכוכית כדי למנוע בועות אוויר בפתרון. - יוצקים את הפתרון מיד בזהירות לתוך הצלחות זכוכית שהורכב בשולי הצלחת מחורץ, למלא את החלל כמעט עד למעלה ו להוסיף את המסרק. להוסיף נפח קטן של פתרון ג'ל על המסרק.
הערה: לשמור את צלחות זכוכית אופקי כדי למנוע את הג'ל דולף. להסיר את כל הבועות עם קרס בועה, במידת הצורך. - לאפשר את הג'ל להגדיר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: הזמן הפילמור עשויים להשתנות עם טמפרטורות של ג'ל פתרון והסביבה. - לאחר הג'ל באופן מלא פלמור, להסיר את התפסים הליהוק, הצב ערכת צלחת ביחידה אלקטרופורזה טנק עם לוחית מחורץ הפונה לעבר המאגר מאגר העליון ולאחר השתמש מלחציים גדולים כדי לחבר את הצלחת להגדיר את יחידת טנקים.
- שופכים 1 ליטר של 0.5 × TBE מאגר לתוך כל אחד העליון ואת התאים נמוך יותר. הסר את המסרק, לשטוף כל הבארות ביסודיות עם מאגר באמצעות פיפטה או מזרק.
הערה: ודא כי הכריך ג'ל בתחתית הצלחת לחלוטין מהול במאגר ללא בועות.
4. הפעלת ג ' לים
- לטעון µL בערך של מוצר ה-PCR לבאר כל של הג'ל לזיהוי. לטעון סולם גודל ה-DNA על שני הצדדים של הג'ל יחד עם דוגמאות של מוצרי ה-PCR. לתקן את מכסה בטיחות לתא העליון מאגר.
- לחבר את ההפניות אספקת החשמל, התאמת את המסומן בצבע אדום כדי אדום שחור על שחור. להפעיל את הג'ל על מתח קבוע של 110 וולט עד לצבוע מגיע עמדה מוגדרת, בדרך כלל עבור ~ 70 דקות.
הערה: זמן ריצה של מתח חשמלי יכול להיות מותאם לפי הגודל של מוצרי ה-PCR.
5. כסף מכתים לזיהוי סמנים הסובייטית בשאינם-לזיהוי ג'ל
- לאחר אלקטרופורזה, נשפכים המאגר מהתא העליון גביע גדול דרך המסתם. לנתק את התפסים בצד להסיר את הלוחות של המנגנון, בזהירות להפריד בין לוח הזכוכית מחורץ לאורך צד אחד עם מרית, ודא כי השרידים ג'ל מצורף לוח הזכוכית אחרים מצופים איגוד silane.
- להפוך 1 ליטר של הספגה טריים פתרון על ידי המסת 1.5 גר' AgNO3 ב- 1 ליטר של dH2O. להכין 1 L של פיתוח טריים פתרון על ידי המסת 10 גרם של NaOH ב 900 מל של dH2O, להוסיף 1 מ"ל של 37% פורמלדהיד , ולהתאים את נפח סופי של 1 ליטר באמצעות dH2O.
הערה: ללבוש כפפות וטפל את כימיקלים והפתרונות לעיל בזהירות. . זה לא הכרחי לשמור על השלבים המתאימים עם הפתרונות והפתרונות בחושך... - בזהירות לשטוף את הצלחת ג'ל וזכוכית עם שפע dH2O כדי להסיר את מאגר אלקטרופורזה, ולאחר מכן למקם את הצלחת עם הג'ל פונה כלפי מעלה על גבי מגש פלסטיק ויציפו את הג'ל ב- 1 ליטר של הספגה פתרון. תניח את המגש על מטרף.
- לנער בעדינות את המגש ב 60 r/min למשך 3-4 דקות.
הערה: טלטול הזמן יכול להיות מותאם על פי עובי ג'ל ריכוז של כסף חנקתי בפתרון הספגה. - להעביר את הצלחת לצאת הספגה פתרון ושם אותה על מגש נוסף. יש לשטוף את הפתרון הספגה שיורית ביטול מפני השטח של הלוח, הג'ל באמצעות בשפע dH2O פעמיים עבור כל 3-5 s.
- למקם את הצלחת עם הג'ל פונה כלפי מעלה על גבי מגש נוסף, להטביע את הצלחת ב- 1 ליטר של פיתוח פתרון, אז לנער בעדינות את המגש ב r/min 50 עבור ~ 3 מינימלית צג המראה של ה-DNA קטעים ולהפסיק פיתוח כאשר היחס הגבוה של אות ה-DNA שברים הרעש של הרקע הוא ציין (שלב זה לוקח ~ 3 דקות).
- יש לשטוף את הצלחת, את הג'ל עם שפע dH2O פעמיים, יבש ג'ל לצלחת עם נייר טישו.
- סרוק את הג'ל באמצעות סורק מתאים. ברזולוציה של 300 dpi נותן פריט חזותי ברור שברי DNA. הג'ל יכול גם להיות צולם בעזרת מצלמה.
- הדפוס סימון של סמנים הסובייטית יכול להיות הבקיע מבוסס על שברי DNA בתמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Amplicons ה-PCR הופקו באמצעות המתאימים הסובייטית פריימר זוגות כרוב סיני פורח וטבק. לאחר אלקטרופורזה, ג'לים לזיהוי היו מוכתמים באמצעות הכסף לעיל מכתים פרוטוקול, אשר זוהה חד משמעית את הדפוסים סימון של סמנים הסובייטית (איור 1).
כדי להשוות את יעילות הזיהוי של שונים כסף מכתים פרוטוקולים, מוצרי ה-PCR הסובייטית סמני טבק, פריחה כרוב סיני הופרדו באמצעות אלקטרופורזה בג'ל לזיהוי, visualized באמצעות חמש שפורסמו צביעת כסף פרוטוקולים9,11,12,13,14 , פרוטוקול חדש. כל הפרוטוקולים 6 אותר הסובייטית פסים דפוסי בטבק ו פורחים אחרים כרוב סיני (איור 2), אבל בפרוטוקול הנוכחי היו רעשי הרקע הנמוך ואת הניגודיות הגבוהה של ה-DNA שברים, כך שייצרה את התמונה הגבוהה ביותר בהירות להקרנה ברורה וחד משמעית של פולימורפיזמים הסובייטית. זמן הפעולה ואת מספר שלבים עיקריים, ריאגנטים להשתמש כדי להשלים את הכסף מכתים תהליך המפורטים בטבלה 1 עבור כל פרוטוקול, פרוטוקול חדש לוקח הפחות זמן ודורש פחות ריאקטיבים כימיים ולעבד את השלבים.
איור 3 מראה את הרגישות של הפרוטוקול כפי שנמדד על ידי bp 50-2,000 סמן הדנ א על ג'ל לזיהוי שאינם denaturing.
איור 1: זיהוי של הסובייטית פסים דפוסי. זיהוי של פסים הסובייטית תבניות עבור אחרים של כרוב סיני פורח (א) , פרוטוקול טבק (B) באמצעות צביעת כסף חדש. המוצרים PCR היו מופרדים על 6% שאינם denaturing לזיהוי ג'לים, צבעונית לפי הכסף דיווח מעל מכתים פרוטוקול. ליין M הוא סמן הדנ א. גודל, מסלולים 1-62 מייצגים amplicons של אחרים 62 מוגבר על ידי זוגות פריימר הסובייטית של "CX-157" (מסדרות תחל ואחורה הם 5'-TCGACGCTGACTTCACTGAC-3' ו- 5'- GGACAGCTTCACACATTTGC-3', פריחה בהתאמה), כרוב סיני (איור 1 א') ו- "PT51333" (מסדרות תחל ואחורה הם 5'- GCACCTTTGGTTATCCGACA-3' ו- 5'- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3', בהתאמה) טבק (איור 1B). החצים הצבע הלהקות הסובייטית היעד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: השוואה של יעילות הזיהוי עבור סמני הסובייטית פריחה כרוב סיני אחרים באמצעות כסף שונים מכתים פרוטוקולים וטבק. המוצרים PCR הופרדו 6% של ג'לים לזיהוי שאינם denaturing, ויטראז'ים באמצעות חמש לאור כסף מכתימים פרוטוקולים9,11,12,13,14 ו החדשה פרוטוקול. ליין מ' הוא סמן הדנ א. גודל. מסלולים 1 עד 4 מייצג את amplicons של תחל הסובייטית של "PT50903" (מסדרות תחל ואחורה הם 5'-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG-3 'ו 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3', בהתאמה) ב 4 טבק אחרים; מסלולים 5-8 מציינים את amplicons של תחל הסובייטית של "CX-43" (מסדרות תחל ואחורה הם 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3 'ו 5'-AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3', בהתאמה) ב 4 אחרים כרוב סיני פורח. הלהקות הסובייטית היעד מצוינים עם החצים. דמות זו שונתה איור 2 של ליו ואח. 8 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: רגישות של הפרוטוקול כפי שנמדד על-ידי סמן הדנ א. לחץ דם 50-2000 על ג'ל לזיהוי הלא denaturing. הסמטה הראשונה הייתה עמוסה 1µL של סמן הדנ א. עם שבר בגדלים 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 1000, 1500, 2000 bp, כל אחד ב- 10 ng/µL. הדגימות הנותרים היו מפוצצות לדילול טורי 1:2 במסלולים הקודמת. הסכום המינימלי לזיהוי עבור הפרוטוקול היה 9.8 pg בנתיבה 11 (2.2 מ"מ2 ב- 4.5 מ מ2 טוב). דמות זו שונתה מ איור 1 של ליו. et al. 8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| פריט | סאנגינטי et al. 9 | Qu ואח 11 | Et al. 12 | Byun et al. 13 | קומאר ואח 14 | פרוטוקול חדש |
| זמן הפעולה (דקות) | 30 | 12-25 | 8 – 9 | 9 – 31 | 42 | 6-7 |
| מספר הצעדים | 5 | 4 | 3 | 3 | 3 | 2 |
| מספר ריאגנטים | 5 | 6 | 6 | 5 | 7 | 3 |
טבלה 1: פועל הזמן, מספר השלבים החשובים, ריאגנטים להשתמש בכסף שונים מכתים פרוטוקולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הכביסה של ג'ל לאחר העיבור הוא שלב קריטי. זמן הכביסה לא מספיק וכרך מים עשוי לגרום להסרת לא שלם של הספגה פתרון על פני השטח של הלוח ואת הג'ל, לגרום רקע כהה. הזמן המתאים לפתח עוד צעד מפתח, פיתוח יתר עלולה לגרום רקע בצבע חום כהה עם ניגודיות נמוכה התמונה שברי DNA. בנוסף, הצעד הספגה באופן משמעותי משפיע על יעילות מכתימים שברי DNA. למרות הארכת הזמן הספגה מעל 5 דקות או הגדלת כמות3 AgNO בפתרון הספגה ולשפר את איכות מוכתמים, הפחתת ההפריה זמן על פחות מ 3 דקות או להקטין את הכמות AgNO3 ( < 1 g) יכול לגרום אפור או רדוד שברי DNA שחור.
פעולה מהירה וקלה עבור זיהוי ה-DNA יעילים רצוי עבור כסף מכתימה את השיטה. פרוטוקול חדשים שפותחו במחקר זה מונע את תיקון, עצירה במספר שלבים כביסה תיאר אחרים פרוטוקולים6,9,10,11,12,13 , 14 מבלי להשפיע על איכות מכתימים (איור 1 & איור 2), ודורש רק שני צעדים פשוטים של הספגה ופיתוח לקחת 7 דקות. לכן, פרוטוקול חדש הוא מהר יותר מאשר כל האחרים מכתימים פרוטוקולים הנוכחי זמין6,7,9,10,11,12, 13,14. בנוסף, פרוטוקול חדש דורש רק שלושה כימיקלים, כלומר. AgNO3, פורמלדהיד, NaOH, על כמויות דומות כמו זה המשמש אחרים פרוטוקולים6,7,9,10,11,12, 13,14, לכן, פרוטוקול חדש הוא חסכוני יותר, יוצר סיכונים כימיים פחות, אשר לא רק מפחית את עלות כימיים אלא אף ממזערת את התהליך ושנוע מסוכנים של חומרים כימיים נוספים מעבדה.
פרוטוקול חדש המיוצר תמונות ברורות עם רעשי רקע נמוך איתור ברורה וחד משמעית של הסובייטית פסים דפוסי טבק ו פורחים אחרים כרוב סיני (איור 1). לעומת פרוטוקולים אחרים, פרוטוקול חדש יצר הטוב ביותר מכתים אפקט עם רעש רקע הנמוך, חדות התמונה הגבוהה ביותר (איור 2). טווח 50-500 bp, הרגישות של פרוטוקול חדש עבור זיהוי ה-DNA היה פחות מ 19.5 pg/µL (4.3 pg / מ מ2) עם ריכוז מינימלי של 9.8 pg/µL (2.2 מ"מ2) (איור 3), שהוא גבוה יותר מאשר שדיווח על פרוטוקולים אחרים 7 , 12 , 13.
למרות טכנולוגיות תיוג פלורסצנטיות יכול לספק תפוקה גבוהה וזיהוי ברזולוציה של ה-DNA amplicons, הם דורשים ציוד מיוחד, ריאגנטים יקר יותר עשוי להיות לא נגיש עבור מעבדות ביולוגיות רבות, במיוחד אלה במדינות מתפתחות. פרוטוקול מכתימים החדש הוא פשוט וזה מהר באפשרותך לסנן דגימות די אן איי ~ 800 לאדם ליום, ובכך, הוא אפשרות טובה עבור אלה מעבדות לבצע מחקר שגרתית.
לסיכום, פרוטוקול חדשים שפותחו במחקר זה יותר מהיר לתהליך, קל יותר ליישם, זול יותר, ומשתמש רק שלושה ריאגנטים — מבלי להתפשר על גילוי אפקט או התמונות בהירות — מכסף כל אחרים הקיימים מכתים טכניקות. הכסף החדש מכתים פרוטוקול שימש בהצלחה טבק ומחקר כרוב סיני פורח, יכול להיות כלי רב ערך עבור genotyping הסובייטית מוצלחת של מינים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו מומן על ידי את גואנגדונג מדעי הטבע קרן של סין (2015A030313500), המחוז הבינלאומי המפתח פלטפורמה שיתופית המחקר המדעי המחקר פרוייקט של גואנג-דונג ההשכלה הגבוהה (2015KGJHZ015), המדע, תכנית טכנולוגיה של גואנג-דונג הניהול של מונופול טבק (201403, 201705), מדע, טכנולוגיה תוכנית של גואנג-דונג בסין (2016B020201001), הפרויקט הכשרה חדשנות לאומי עבור סטודנטים לתואר ראשון (201711078001). איזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים בפרסום זה אך ורק לצורך אספקת מידע ספציפי, לא משתמע המלצה או אישור מאת לנו משרד החקלאות. משרד החקלאות הוא הזדמנות שווה ספק המעסיק.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | - | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | - | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | - | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | - | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | - |
References
- Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).
- Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae). Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).
- Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).
- Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).
- Liang, Q., et al. A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).
- Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques. 17, PMID:7840973 915-919 (1994).
- Ji, Y., Qu, C., Cao, B. An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).
- Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).
- An, Z., et al. A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment. Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).
- Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).
- Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants. Genome Data. 5, 218-222 (2015).
- Liu, W., et al. Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments. Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).
- Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers. Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).
- Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome. 39, PMID: 8983182 1102-1108 (1996).
