Summary
Wij rapporteren hier een eenvoudige en goedkope silver kleuring protocol dat vereist slechts drie reagentia en 7 min van verwerking, en is geschikt voor snelle generatie voor kwalitatief hoogwaardige SSR data in de genetische analyse.
Abstract
Eenvoudige opeenvolging herhaalt (SSR) is één van de meest effectieve markers in plantaardige en dierlijke genetische onderzoek en moleculaire veredeling programma's gebruikt. Zilveren kleuring is een veel gebruikte methode voor het detecteren van SSR merkers in een polyacrylamide-gel. Conventionele protocollen voor Zilveren kleuring zijn echter technisch veeleisende en tijdrovende. Net als veel andere biologische laboratorium zijn technieken, zilveren kleuring protocollen gestaag geoptimaliseerd om detectie efficiëntie te verbeteren. Wij rapporteren hier een vereenvoudigde silver kleuring methode die aanzienlijk vermindert reagens kosten en verbetert de opsporing resolutie en afbeelding duidelijkheid. De nieuwe methode vereist twee hoofdstappen (bevruchting en ontwikkeling) en drie reagentia (zilvernitraat, natriumhydroxide en formaldehyde) en slechts 7 min van verwerking voor een niet-denaturering polyacrylamide-gel. Vergeleken met de eerder gemelde protocollen, deze nieuwe methode is gemakkelijker, sneller en gebruikt minder chemische reagentia voor SSR detectie. Deze eenvoudige, goedkope en effectieve zilver kleuring protocol profiteert dus, genetische kartering en marker-assisted breeding door een snelle generatie van SSR marker gegevens.
Introduction
De ontwikkeling van PCR-gebaseerde markers heeft een revolutie teweeggebracht in de wetenschap van plantengenetica en fokken1. Eenvoudige opeenvolging herhaalt (SSR) markeringen behoren tot de meest gebruikte en meest veelzijdige DNA-merkers. Hun brede genoom dekking, overvloed, genoom specificiteit en herhaalbaarheid zijn enkele van de verdiensten van SSR markeringen naast hun codominant erfenis voor de detectie van heterozygoot genotypen2. Verschillende studies hebben SSR markeringen gebruikt om te onderzoeken van genetische diversiteit, bijhouden van afkomst, genetische koppeling kaarten bouwen, en genen voor economisch belangrijke traits3,4.
PCR producten van SSR markers worden vaak gescheiden met behulp van agarose of polyacrylamide-gel-elektroforese en vervolgens gevisualiseerd met zilveren kleuring of onder UV-licht na kleuring met ethidiumbromide. Zilveren kleuring van DNA fragmenten in polyacrylamide gels is gevoeliger dan het andere kleuring methoden5,6 en is wijd verbeid gebruikt om DNA-fragmenten zoals SSR markeringen7detecteren.
Zoals vele biologische laboratoriumtechnieken verbeterd zilveren kleuring van polyacrylamide gels gestaag is sinds haar eerste worden gerapporteerd als een fragment visualisatie techniek in 19798. De techniek werd in eerste instantie voor de opsporing van DNA-fragmenten gewijzigd door Bassam et al. 6 in 1991 en vervolgens verbeterd door Sanguinetti en collega's9 in 1994. De methode heeft verder geoptimaliseerd in de laatste paar decennia6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. de meeste van deze bijgewerkte versies van de protocollen hebben echter nog steeds enkele nadelen zoals hoge technische vraag en lange verwerkingstijd voor fixatie en montage6, die de toepassing van deze protocollen7beperken, 11. Een optimale protocol dat goedkope met een hoog rendement van DNA fragment detectie combineert is dringend nodig voor routinematige toepassing van zilver kleuring in biologisch onderzoek.
Daarnaast polyacrylamidegel kan worden onderverdeeld in denatureren en niet-denaturering polyacrylamide gels en allebei kunnen worden gebruikt voor het detecteren van merkers van de SSR met behulp van de methode kleuring zilver. Het effect en de resolutie die niet aanzienlijk van elkaar verschillen, maar niet-denaturering polyacrylamide gels zijn gemakkelijker te proces en nemen minder tijd16.
Op basis van het vorige onderzoek15is het doel van de huidige studie om te beschrijven van een geoptimaliseerde zilver protocol in detail voor snelle, gemakkelijke en goedkope detecteren van SSR merkers in een niet-denaturering polyacrylamidegel kleuring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van PCR producten van SSR Markers
- Alle chemische stoffen en reagentia voorbereiden met PCR reacties, met inbegrip van sjabloon DNA (30 ng/µL), 2 × PCR master mix (met 2 × PCR buffer, 0,4 mM voor elke dNTP, 3 mM van MgCl2, 0.1 U/µL van de polymerase van DNA Taq en kleurstoffen), 10 µM van elk vooruit en achteruit inleidingen , en gedestilleerd of gedeïoniseerd water (dH2van O).
Opmerking: De markeringen van de SSR gebruikt in de huidige studie werden PT51333 (toekomen primer volgorde: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' en omgekeerde primer volgorde: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') en PT50903 (toekomen primer volgorde: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' en omkeren van de volgorde van de primer: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ') voor tabak en CX-43 (toekomen primer volgorde: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' en reverse primer volgorde: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') en CX-157 (toekomen primer volgorde: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' en het omkeren van de volgorde van de primer: 5 '- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3') voor bloeiende Chinese kool. - Versterking 10 µL van het PCR-mix voorbereiden door toevoeging van 2 µL van sjabloon DNA, 5 µL van 2 × PCR master mix, 0.2 µL van elke voorwaartse primer en omgekeerde primer en 2.6 µL dH2O.
- Uitvoeren van PCR versterking reactie in een thermocycler met een eerste stap van 94 ° C gedurende 5 minuten, te volgen door 38 cycli van 45 bij 94 ° C voor denaturatie, 45 s s bij 55 ° C voor primer gloeien en 1 min bij 72 ° C voor uitbreiding, en een stap van de uiteindelijke uitbreiding van 10 minuten bij 72 ° C; Sla PCR producten bij 4 ° C voor later gebruik.
2. voorbereiding van de oplossingen van Polyacrylamide Gels gieten
- 1 L 5 × TBE buffer bereiden door ontbinding van 54 g Tris basis en 27.5 g boorzuur in dH,2O, het toevoegen van 20 mL EDTA 0.5 M (pH 8.0) en het aanpassen van de oplossing voor een eindvolume van 1 000 mL met dH2O.
Opmerking: TBE buffer kan worden opgeslagen op kamertemperatuur voor maanden. - 2 L van 0,5 × TBE buffer door toevoeging van 200 mL 5 × TBE buffer dH2O tot een eindvolume van 2 L bereiden en bewaren bij kamertemperatuur.
- Bereid een 6% niet-denaturering polyacrylamidegel oplossing door ontbinding 29 g van moleculaire biologie rang acrylamide en 1 g van moleculaire biologie rang N, N'-methylenebisacrylamide in 0,5 × TBE buffer tot een eindvolume van 500 mL. Betrekking hebben op de fles van de oplossing met aluminiumfolie en bewaren bij 4 ° C voor later gebruik.
Let op: Acrylamide wordt beschouwd als een krachtig neurotoxine en moet met zorg worden behandeld. Draag altijd handschoenen wanneer wegend poeder en behandeling oplossingen bevatten. - Bereid een 20% ammoniumnitraat persulfate (APS)-oplossing door het oplossen van 2 g van APS met dH2O tot een eindvolume van 10 mL. Het kan worden opgeslagen bij-20 ° C voor maanden.
Opmerking: Voor het gemak, 10 mL 20% APS oplossing kan worden aliquoted in 1,5 mL of 2 mL centrifuge buizen voor opslag bij-20 ° C. Ontdooien en meng goed vóór gebruik. - Bereid een verdunde bind-silane-oplossing door het oplossen van 3 µL van bind-silane in 0.997 mL 95% ethanol bevattende 0,5 of meer gewichtspercenten azijnzuur. Het kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor weken.
Let op: Bind-silane is giftig, Draag handschoenen bij het verwerken van de oplossing en geventileerde kamer houden.
3. bereiding van Polyacrylamide Gels voor elektroforese
- Een set van glazen platen en afstandhouders met wasmiddel wassen in leidingwater, gevolgd door een volledige spoelen met dH2O. Air droog de platen door ze in een bord Droogrek.
- 1 mL van bind-silane oplossing op de binnenzijde van een rechthoekige glasplaat, en droog zijn voor 5 min te verspreiden.
Opmerking: Als de bind-silane oplossing is niet gelijkmatig verspreid over het oppervlak van de plaat, de gel kan worden losgemaakt tijdens kleuring en leiden tot een onbevredigende verkleurende effect. - Verspreiden van 1 mL af te weren-silane op de binnenzijde van een ingekeepte glasplaat met een doekje, veeg overtollige afstoten-silane met papieren zakdoekje, en lucht droog voor 5 min.
Opmerking: Als het weer-silane doet de oppervlakte van de glasplaat niet uniform jas, het kan schade aan de gel door het gedeeltelijk strippen. - Monteren van de glazen platen met afstandhouders met de ingekeepte plaat op bovenkant en klem van beide zijden van de vergadering met het gieten van klemmen.
- Giet passende hoeveelheid (40 mL) 6% niet-denaturering polyacrylamidegel oplossing in een bekerglas voor de plaat set met 33 cm breedte × 10 cm hoogte en spacer dikte van 1,5 mm, Voeg 20 µL van tetramethylethylenediamine (TEMED) en 200 µLfresh 20% APS en meng voorzichtig.
Opmerking: De juiste hoeveelheid (40 mL) gel oplossing was berekend op basis van de binnenste omvang van de twee platen met een dikte van afstandhouders (30 cm x 8,5 cm × 0,15 cm). Wat betreft de hoeveelheid TEMED en APS voor gel polymerisatie is er een standaard verhouding van gel oplossing voor TEMED en APS gebaseerd op de referentie-17. De gel-oplossing hierboven beschreven wordt opgeslagen bij 4° C. Als gel oplossing is bewaard bij kamertemperatuur, 20 µL van TEMED en 100 µL van 20% APS moet worden gebruikt. Zachtjes roer het mengsel van gel oplossing met een glas stok om luchtbellen in de oplossing. - Giet de oplossing onmiddellijk en zorgvuldig in de gemonteerde glazen platen langs de rand van de ingekeepte plaat, vullen de ruimte bijna naar de top en voeg de kam. Voeg een kleine hoeveelheid gel oplossing over de kam.
Opmerking: Houd de glasplaten horizontale om te voorkomen dat de gel lekt. Verwijder alle bubbels met een zeepbel haak, indien nodig. - Laat de gel om in te stellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: De tijd voor de polymerisatie kan veranderen met temperaturen van gel oplossing en milieu. - Nadat de gel volledig polymerisatie is, verwijder de gieten-klemmen en positie van de collectie van de plaat in de elektroforese tank eenheid met de ingekeepte plaat naar de richting van het bovenste buffer reservoir, en gebruik grote klemmen te koppelen van de plaat ingesteld op de tank-eenheid.
- Giet 1 L van 0,5 × TBE buffer in elk van de bovenste en de onderste kamers. Verwijder de kam en al de putten, spoel met buffer met behulp van een pipet of injectiespuit.
Opmerking: Zorg ervoor dat de gel sandwich aan de onderkant van de plaat volledig is gedrenkt in buffer zonder alle bubbels.
4. running Gels
- Ongeveer 1 µL van het PCR-product in elk putje van de polyacrylamidegel laden. Het laden van een ladder grootte DNA aan beide zijden van de gel samen met monsters van PCR producten. De dekking van de veiligheid vast aan de bovenste buffer kamer.
- De leads verbinden met de voeding, de gekleurde bijpassende rood voor rood en zwart naar zwart. De gel wordt op een constante spanning van 110 V uitvoeren totdat de kleurstof een bepaald standpunt, gewoonlijk voor ~ 70 min bereikt.
Opmerking: De spanning en de lopende tijd kan worden aangepast volgens de grootte van de PCR producten.
5. silver kleuring voor het opsporen van SSR markeringen in een niet-Polyacrylamide-Gel
- Na elektroforese, afvoer van de buffer van de bovenste kamer in een groot bekerglas via het ventiel. Loskoppelen van de klemmen van de kant, de platen uit het apparaat verwijderen, zorgvuldig de ingekeepte glasplaat langs één kant te scheiden met een spatel en ervoor te zorgen dat de gel blijft gekoppeld aan de andere glasplaat bekleed met bind silane.
- Vul 1 liter van verse impregnatie oplossing door ontbinding van 1.5 g van AgNO3 in 1 L dH2O. bereiden 1 L van verse ontwikkeling oplossing door ontbinding van 10 g NaOH in dH2O 900 mL, voeg 1 mL van 37% formaldehyde , en aan te passen aan een eindvolume van 1 L met behulp van dH2O.
Opmerking: Draag handschoenen en de bovenstaande chemicaliën en oplossingen met zorg behandelen. Het is niet nodig om te houden van de oplossingen en de bijbehorende stappen met de oplossingen in het donker. - Spoel zorgvuldig de gel en glas plaat met ruime dH2O te verwijderen van de elektroforese buffer, dan plaatst u de plaat met de gel naar boven op een kunststof dienblad en dompelen de gel in 1 L van bevruchting oplossing. De lade zetten in een shaker.
- Schud de lade voorzichtig op 60 r/min gedurende 3-4 minuten.
Opmerking: Schudden van de tijd kan worden aangepast volgens de dikte van de gel en de concentratie van zilvernitraat in de impregnatie-oplossing. - Verplaatsen van de plaat uit impregnatie oplossing en zet het op een andere lade. Spoel de oplossing van de resterende impregnatie af van het oppervlak van de plaat en de ruime dH2O tweemaal voor elke 3-5 s met gel.
- De plaat met de gel naar boven op een andere lade plaatsen, onderdompelen van de plaat in 1 liter oplossing van de gegevensbestandontwikkeling, dan schudden van de lade voorzichtig bij 50 r/min voor ~ 3 min. Monitor de vormgeving van DNA fragmenten en de hoogste verhouding van het signaal van DNA fragmenten ontwikkeling vastloopt aan het lawaai van de achtergrond wordt waargenomen (deze stap duurt ~ 3 min).
- Spoel de plaat en de gel met ruime dH2O tweemaal, en droog de gel-plaat met een papieren zakdoekje.
- Scan de gel met behulp van een geschikte scanner. Een resolutie van 300 dpi geeft een duidelijke visualisatie van DNA-fragmenten. De gel kan ook worden gefotografeerd met behulp van een camera.
- De banding patroon van SSR markers kan worden gescoord gebaseerd op de DNA-fragmenten in de afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De PCR waarbij werden geproduceerd met behulp van de bijbehorende SSR primerparen bloeiende Chinese kool en tabak. Na elektroforese, waren de gels van polyacrylamide gekleurd met behulp van de bovenstaande zilver kleuring protocol, dat ondubbelzinnig de banding patronen van SSR markers (Figuur 1 ontdekt).
Om te vergelijken de efficiëntie van de detectie van verschillende zilver kleuring van protocollen, PCR producten van SSR markers in tabak en bloeiende Chinese kool werden gescheiden met behulp van polyacrylamide gelelektroforese en gevisualiseerd met behulp van vijf gepubliceerde zilveren kleuring protocollen9,11,12,13,14 en het nieuwe protocol. Alle zes protocollen gedetecteerd SSR "banding" patronen voor tabak en bloeiende Chinese kool genotypen (Figuur 2), maar het huidige protocol had de laagste achtergrondgeluiden en hoogste contrast van DNA fragmenten, zodanig dat het de hoogste opname geproduceerd duidelijkheid voor de ondubbelzinnige screening van SSR polymorfismen. De speelduur en het aantal van de belangrijkste stappen en reagentia gebruikt bij het voltooien van de zilveren kleuring proces zijn vermeld in tabel 1 voor elk protocol, het nieuwe protocol neemt het minste tijd en vereist minder chemische reagentia en verwerken stappen.
Figuur 3 toont de gevoeligheid van het protocol, zoals gemeten door 50-2.000 bp DNA marker op een niet-denaturering polyacrylamide-gel.
Figuur 1: detectie van SSR "banding" patronen. Detectie van SSR "banding" patronen voor genotypen van bloeiende Chinese kool (A) en (B) met behulp van de nieuwe zilveren kleuring tabak protocol. De PCR-producten werden gescheiden op 6% niet-denaturering polyacrylamide gels en gekleurd volgens de hierboven gemelde zilver kleuring protocol. Lane M is DNA grootte marker, rijstroken 1 tot en met 62 vertegenwoordigen de waarbij van 62 genotypen versterkt door SSR primerparen "CX-157" (de sequenties van de voorwaartse en omgekeerde inleidingen zijn 5'-TCGACGCTGACTTCACTGAC-3' en 5'- GGACAGCTTCACACATTTGC-3', respectievelijk) in bloei Chinese kool (figuur 1A) en "PT51333" (de sequenties van de voorwaartse en omgekeerde inleidingen zijn 5'- GCACCTTTGGTTATCCGACA-3' en 5'- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3', respectievelijk) tabak (figuur 1B). De pijlen wijzen naar de doelbandbreedtes SSR. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Afbeelding 2: vergelijking van de doeltreffendheid van de detectie van SSR markeringen in tabak en bloeiende Chinese kool genotypen met behulp van verschillende zilver kleuring protocollen. De PCR-producten werden gescheiden in 6% van de niet-denaturering polyacrylamide gels en gekleurd met vijf gepubliceerd zilveren kleuring protocollen9,11,12,13,14 en de nieuwe Protocol. Lane M is DNA grootte markering. 1 tot en met 4 rijstroken vertegenwoordigen de waarbij SSR inleidingen van "PT50903" (de sequenties van de voorwaartse en omgekeerde inleidingen zijn 5'-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG-3 'en 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3', respectievelijk) in vier tabak genotypen; rijstroken 5 tot en met 8 geven de waarbij SSR inleidingen van "CX-43" (de sequenties van de voorwaartse en omgekeerde inleidingen zijn 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3 'en 5'-AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3', respectievelijk) in vier bloeiende Chinese kool genotypen. Het SSR doelbandbreedtes worden aangegeven met pijlen. Dit cijfer is gewijzigd van de Figuur 2 van Liu et al.. 8 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: gevoeligheid van het protocol zoals gemeten door 50-2000 bp DNA markering op een niet-denaturering polyacrylamidegel. De eerste baan was geladen met 1µL van DNA markering met fragment grootte van 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 1000, 1500 en 2000 bp, elk op 10 ng/µL. De resterende monsters werden geladen met een verdunning 1:2 seriële in voorgaande rijstroken. Het detecteerbare minimumbedrag voor het protocol was 9,8 pg in de 11th lane (2.2 pg/mm2 in een 4.5 mm2 goed). Dit cijfer is gewijzigd van de Figuur 1 van Liu et al. 8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Item | Sanguinetti et al. 9 | Qu et al. 11 | Een et al. 12 | Byun et al. 13 | Kumar et al. 14 | Nieuw protocol |
| Running tijd (min) | 30 | 12-25 | 8 – 9 | 9 – 31 | 42 | 6-7 |
| Aantal stappen | 5 | 4 | 3 | 3 | 3 | 2 |
| Aantal reagentia | 5 | 6 | 6 | 5 | 7 | 3 |
Tabel 1: Speelduur, aantal belangrijke stappen en in de verschillende zilver kleuring protocollen gebruikte reagentia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het wassen van gel na bevruchting is een cruciale stap. Onvoldoende wassen tijd en water volume kan leiden tot de onvolledige verwijdering van bevruchting oplossing op het oppervlak van de plaat en de gel, en resulteren in een donkere achtergrond. De passende ontwikkeling tijd is een andere belangrijke stap, overmatige ontwikkeling kan resulteren in een donker-bruine achtergrond met laag contrast foto van DNA-fragmenten. Bovendien heeft de bevruchting stap aanzienlijk invloed op kleuring efficiëntie van DNA-fragmenten. Hoewel de uitbreiding van de impregnatie tijd meer dan 5 min of verhoging van AgNO3 bedrag in de impregnatie oplossing niet aanzienlijk verbetert de kleuring kwaliteit, een vermindering van de impregnering tijd tot minder dan 3 min of verminderen van de hoeveelheid (3 ) AgNO < 1 g) kan resulteren in grijs of ondiepe zwarte DNA-fragmenten.
Een snelle en eenvoudige werking voor de efficiënte opsporing van DNA is wenselijk voor een silver kleuring methode. Het nieuwe protocol ontwikkeld in deze studie vermijdt de vaststelling, stoppen en verschillende wassen stappen beschreven in andere protocollen6,9,10,11,,12,13 , 14 zonder de kleuring kwaliteit (Figuur 1 en Figuur 2), en vereist slechts twee stappen van bevruchting en ontwikkeling, die 7 min nemen. Dus, het nieuwe protocol is sneller dan alle andere kleuring protocollen huidige beschikbaar6,7,9,10,11,12, 13,14. Bovendien vereist het nieuwe protocol slechts drie chemicaliën, dwz. AgNO3, formaldehyde en NaOH, op vergelijkbare bedragen als die gebruikt in andere protocollen6,7,9,10,11,,12, 13,14, dus het nieuwe protocol is zuiniger en genereert minder chemische risico's, die niet alleen vermindert de chemische kosten maar ook minimaliseert het gevaarlijke materiële behandeling proces van extra chemicaliën in de laboratorium.
Het nieuwe protocol geproduceerd en heldere beelden met lage achtergrondgeluiden voor de ondubbelzinnige detectie van SSR "banding" patronen in tabak en bloeiende Chinese kool genotypen (Figuur 1). Vergeleken met andere protocollen, het nieuwe protocol geproduceerd van de beste kleuring effect met de laagste achtergrondgeluiden en de hoogste contrast van de foto (Figuur 2). Op het bereik van 50-500 bp, de gevoeligheid van het nieuwe protocol voor de detectie van DNA was minder dan 19.5 pg/µL (4.3 pg / mm2) met een minimumconcentratie van 9,8 pg/µL (2.2 pg/mm2) (Figuur 3), die is hoger dan dat gemeld in andere protocollen 7 , 12 , 13.
Hoewel de fluorescentie-labeling technologieën kunnen bieden hoge doorvoer en resolutie detectie van DNA waarbij, vereisen ze gespecialiseerde apparatuur en duurder reagentia die niet toegankelijk zijn voor vele biologische laboratoria, met name die ontwikkelingslan den. Het nieuwe protocol van de kleuring is eenvoudig en snel dat ~ 800 DNA-monsters per persoon per dag, dus kan het scherm, is een goede optie voor deze laboratoria voor het uitvoeren van routine onderzoek.
Kortom, het nieuwe protocol ontwikkeld in deze studie is het proces gemakkelijker te implementeren, goedkoper, sneller en gebruikt slechts drie reagentia — zonder detectie effect of afbeelding duidelijkheid — dan alle andere bestaande zilver kleuring technieken. Het nieuwe zilver kleuring protocol kan heeft met succes gebruikt in tabak en bloeiende Chinese kool onderzoek en een waardevol instrument voor succesvolle SSR genotypering in andere soorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Guangdong Natural Science Foundation van China (2015A030313500), de provinciale sleutel International Cooperative onderzoeksplatform en de grote wetenschappelijke onderzoek Project van Guangdong hoger onderwijs (2015KGJHZ015), de wetenschap en Plan van de technologie van Guangdong tabak monopolie beheer (201403, 201705), de wetenschap en de technologie Plan van Guangdong van China (2016B020201001), het nationale innovatie opleidingsproject voor Voorgraadse studente (201711078001). Vermelding van handelsnamen of commerciële producten in deze publicatie is uitsluitend met het oog op het verstrekken van specifieke informatie en houdt geen aanbeveling of bekrachtiging door het Amerikaanse ministerie van landbouw. USDA is een aanbieder van gelijke kansen en de werkgever.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | - | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | - | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | - | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | - | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | - |
References
- Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).
- Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae). Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).
- Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).
- Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).
- Liang, Q., et al. A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).
- Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques. 17, PMID:7840973 915-919 (1994).
- Ji, Y., Qu, C., Cao, B. An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).
- Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).
- An, Z., et al. A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment. Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).
- Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).
- Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants. Genome Data. 5, 218-222 (2015).
- Liu, W., et al. Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments. Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).
- Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers. Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).
- Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome. 39, PMID: 8983182 1102-1108 (1996).
