Summary
Hier berichten wir über eine einfache und kostengünstige Silber Färbeprotokoll erfordert nur drei Reagenzien und 7 min von Verarbeitung und eignet sich für schnelle Generierung von qualitativ hochwertigen SSR Daten in der genetischen Analyse.
Abstract
Einfache Sequenz wiederholen (SSR) ist eine der effektivsten Marker in pflanzlichen und tierischen Genforschung und molekulare Zuchtprogramme verwendet. Silberne Färbung ist eine weit verbreitete Methode zur Erkennung von SSR-Marker in einem Polyacrylamid-Gel. Konventionelle Protokolle für die silberne Färbung sind jedoch technisch anspruchsvoll und zeitaufwändig. Wie viele andere biologische Labor wurden Techniken, silberne Färbung Protokolle stetig optimiert, um nachweiseffizienz zu verbessern. Hier berichten wir über eine vereinfachte silberne Färbung Methode, die deutlich reduziert Reagenz Kosten und verbessert die Erkennung Auflösung und Bildqualität. Die neue Methode erfordert zwei wesentliche Schritte (Imprägnierung und Entwicklung) und drei Reagenzien (Silbernitrat, Natriumhydroxid und Formaldehyd) und nur 7 min Verarbeitung für ein nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel. Im Vergleich zu bereits gemeldeten Protokolle, diese neue Methode ist einfacher, schneller und verwendet weniger chemische Reagenzien für SSR-Erkennung. Somit profitieren diese einfache, kostengünstige und effektive Silber Färbeprotokoll genetische Zuordnung und markergestützte Züchtung durch eine schnelle Erzeugung von SSR-Marker-Daten.
Introduction
Die Entwicklung von PCR-basierten Markern revolutioniert die Wissenschaft der Pflanzengenetik und Zucht1. Einfach wiederholende (SSR) Sequenzmarken gehören zu den vielseitigsten und am häufigsten verwendeten DNA-Markern. Ihre breiten Genom Abdeckung, Fülle, Genom Spezifität und Reproduzierbarkeit sind nur einige von den Vorzügen des SSR-Marker neben ihrer Vererbung Vererbung für die Erkennung von heterozygote Genotypen2. Mehrere Studien haben SSR-Marker zu untersuchen genetischen Vielfalt, Abstammung zu verfolgen, genetische kopplungskarten zu konstruieren, und ordnen Sie Gene für wirtschaftlich wichtige Eigenschaften3,4verwendet.
PCR-Produkte von SSR-Marker werden häufig getrennt, mit Agarose oder Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und dann visualisiert mit silbernen Färbung oder unter UV-Licht nach der Färbung mit Interkalation Bromid. Silberne Färbung der DNA-Fragmente in den Polyacrylamid-Gelen ist empfindlicher als die anderen Färbung Methoden5,6 und wurde weithin verwendet, um DNA-Fragmente wie SSR Marker7erkennen.
Wie viele biologische Labor-Techniken verbesserte silberne Färbung Polyacrylamid-Gele kontinuierlich seit seiner zuerst als ein Fragment Visualisierungstechnik in 19798berichtet. Die Technik wurde ursprünglich zum Nachweis von DNA-Fragmenten von Bassam Et Al. geändert. 6 im Jahr 1991 und dann im Jahr 1994 von Sanguinetti und Kollegen9 verbessert. Die Methode wurde in den letzten paar Jahrzehnten6,7,9,10,11,12,13,14 weiter optimiert , 15. jedoch haben die meisten dieser aktualisierten Versionen der Protokolle noch einige Nachteile wie hohen technischen Anspruch und lange Bearbeitungszeit zur Befestigung und Montage6, die die Anwendung dieser Protokolle7zu beschränken, 11. Eine optimale Protokoll, die kostengünstige mit hohem Wirkungsgrad von DNA-Fragment Nachweis kombiniert ist für die routinemäßige Anwendung von Silber-Färbung in der biologischen Forschung dringend notwendig.
Darüber hinaus Polyacrylamid-Gel können Geruchsstoffen und nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gele unterteilt werden, und beide können zur Erkennung von SSR-Marker mit der Silber-Färbung Methode verwendet werden. Die Wirkung und die Auflösung von denen nicht unterscheiden sich erheblich, aber nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gele lassen sich besser verarbeiten und nehmen weniger Zeit16.
Das Ziel der aktuellen Studie soll auf der Grundlage der bisherigen Forschung15eine optimierte Silber Färbeprotokoll für schnelle, einfache und kostengünstige Erkennung von SSR-Marker in einem nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel im Detail zu beschreiben.
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Protocol
1. Vorbereitung der PCR-Produkte von SSR-Marker
- Bereiten Sie alle Chemikalien und Reagenzien für PCR-Reaktionen einschließlich Vorlage DNA (30 ng/µL), 2 × PCR-master-Mix (mit 2 × PCR Puffer, 0,4 mM jedes dNTP, 3 mM MgCl2, 0,1 U/µL Taq-DNA-Polymerase und Farbstoffe), 10 µM jedes weiterleiten und reverse Primer , und destilliertem oder entionisiertem Wasser (dH2O).
Hinweis: Die SSR-Marker verwendet, die in der vorliegenden Studie wurden PT51333 (Primer Sequenz vorwärts: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' und rückwärts-Primer Sequenz: 5 "- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3") und PT50903 (Primer Sequenz vorwärts: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' und Primer Sequenz umkehren: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ") für Tabak und CX-43 (Primer Sequenz vorwärts: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3" und reverse Primer Sequenz: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3 ") und CX-157 (Primer Sequenz vorwärts: 5"- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' und reverse Primer Sequenz: 5 "- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3") für blühende Chinakohl. - Verstärkung durch Zugabe von 2 µL der Schablone DNA, 5 µL 2 × PCR-master-Mix, 0,2 µL der einzelnen vorwärts Grundierung und rückwärts-Primer und 2,6 µL dH2O. bereiten Sie 10 µL des PCR-Mixes vor
- PCR-Amplifikation Reaktion in einem Thermocycler mit einem ersten Schritt von 94 ° C für 5 min durchführen, Folgen von 38 Zyklen 45 s bei 94 ° C Denaturierung, 45 s bei 55 ° C für Grundierung glühen und 1 min bei 72 ° C für Erweiterung und eine letzte Verlängerung Schritt von 10 min bei 72 ° C; Speichern Sie PCR-Produkte bei 4 ° C für die spätere Verwendung.
2. Vorbereitung der Lösungen für Polyacrylamid Gele Gießen
- Bereiten Sie 1 L 5 × TBE Puffer durch Auflösung 54 g Tris-base und 27,5 g Borsäure dH2O, 20 mL 0,5 M EDTA (pH 8,0) hinzufügen und anpassen die Lösung zu einem Endvolumen von 1 000 mL mit dH2O.
Hinweis: TBE Puffer kann für Monate bei Raumtemperatur gelagert werden. - 2 L 0,5 × TBE Puffer durch Zugabe von 200 mL 5 × TBE-Puffer, dH2O zu einem Endvolumen von 2 L zubereiten und bei Zimmertemperatur aufbewahren.
- Bereiten Sie eine 6 % nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel Lösung durch Auflösen von 29 g Molekulare Biologie Klasse Acrylamid und 1 g der molekularen Biologie Klasse N, N'-Methylenebisacrylamide in 0,5 × TBE-Puffer zu einem Endvolumen von 500 mL. Decken Sie die Lösung Flasche mit Aluminiumfolie und bei 4 ° C für die spätere Verwendung speichern.
Achtung: Acrylamid gilt ein starkes Nervengift und sollte mit Vorsicht behandelt werden. Tragen Sie immer Handschuhe beim Verwiegen von Pulver und Handling-Lösungen, die sie enthalten. - Bereiten Sie eine 20 % Ammonium Bleichen (APS) Lösung durch Auflösen von 2 g APS mit dH2O zu einem Endvolumen von 10 mL. Es kann für Monate bei-20 ° C gespeichert werden.
Hinweis: der Einfachheit halber können 10 mL APS-Lösung 20 % regelmäñig in 1,5 mL oder 2 mL der Zentrifuge Röhren für die Lagerung bei-20 ° c werden Auftauen und vor Gebrauch gut mischen. - Bereiten Sie eine verdünnte Bind-Silan-Lösung durch 3 µL der Bind-Silan in 0,997 mL 95 % Ethanol enthält 0,5 % Essigsäure auflösen. Es kann bei 4 ° C wochenlang gespeichert werden.
Achtung: Bind-Silan ist giftig, tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit der Lösung und Zimmer belüftet zu halten.
3. Vorbereitung der Polyacrylamid-Gele für Elektrophorese
- Waschen Sie einen Satz von Glasplatten und Spacer mit Reinigungsmittel in Leitungswasser, gefolgt von eine komplette Spülung mit dH2O. Luft trocknen die Platten in einem Wäscheständer Teller setzen.
- 1 mL der Bind-Silan-Lösung auf der inneren Oberfläche von einer rechteckigen Glasplatte und trocken für 5 min zu zerstreuen.
Hinweis: Wenn die Bind-Silan-Lösung auf der Oberfläche der Platte nicht gleichmäßig verteilt ist, das Gel kann abgenommen werden, während der Färbung und eine unbefriedigende Färbung Wirkung zur Folge. - 1 mL abstoßen-Silan auf der Innenfläche einer gekerbten Glasplatte mit einem Tupfer zu zerstreuen, wischen Sie überschüssiges abstoßen-Silan mit Seidenpapier und an der Luft trocknen für 5 Minuten.
Hinweis: Wenn das Abstoßen-Silan die Oberfläche der Glasplatte nicht gleichmäßig Beschichten, können sie das Gel beschädigen, durch teilweise entfernen. - Montieren Sie die Glasplatten mit Abstandshalter mit der gekerbte Platte an der Spitze, und Klemmen Sie beide Seiten der Baugruppe mit casting Klemmen.
- Gießen Sie entsprechende Menge (40 mL) 6 % nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel-Lösung in ein Becherglas auf die Platte 33 cm Breite × 10 cm Höhe und Abstandhalter Dicke von 1,5 mm, 20 µL Tetramethylethylenediamine (TEMED) und 200 µLfresh 20 % APS und vorsichtig mischen.
Hinweis: Der entsprechende Betrag (40 mL) Gel-Lösung wurde aus das innere Volumen der beiden Platten mit einer Dicke von Abstandshalter (30 cm × 8,5 cm × 0,15 cm) berechnet. Für die Menge an TEMED und APS für Gel-Polymerisation ist eine Standardverhältnis Gel Lösung TEMED und APS basierend auf dem Referenz-17. Die Gel-Lösung oben beschriebenen ist bei 4 ° c aufbewahrt. Gel-Lösung Lagerung bei Raumtemperatur 20 µL TEMED und 100 µL 20 % APS sollte verwendet werden. Rühren Sie vorsichtig die Mischung der Gel-Lösung mit einem Glas-Stock, Luftblasen in der Lösung zu vermeiden. - Gießen Sie die Lösung sofort und füllen Sie sorgfältig in die montierten Glasplatten entlang der Kante der gekerbte Platte, den Raum fast bis zum Gipfel, und legen Sie den Kamm. Fügen Sie eine kleine Menge Gel-Lösung über den Kamm.
Hinweis: Halten Sie die Glasplatten horizontal zu verhindern, dass das Gel undicht. Entfernen Sie alle Bläschen mit einer Blase Haken, ggf.. - Lassen Sie das Gel für 30 min bei Raumtemperatur festgelegt.
Hinweis: Die Zeit für die Polymerisation kann mit Temperaturen von Gel-Lösung und Umgebung ändern. - Nachdem das Gel vollständig Polymerisation ist, entfernen Sie die Casting-Klammern Positionieren des Platte Satzes in der Elektrophorese tankeinheit mit der gekerbte Platte mit Blick in Richtung des oberen Puffer-Stausees und mit großen Klemmen der Platte soll die Tank-Einheit befestigt.
- Gießen Sie 1 L 0,5 × TBE-Puffer in jede der oberen und unteren Kammern. Entfernen Sie den Kamm und spülen Sie alle Brunnen mit Puffer mit einer Pipette oder Spritze gründlich.
Hinweis: Sicherstellen Sie, dass das Gel-Sandwich an der Unterseite der Platte vollständig im Puffer blasenfrei getränkt ist.
4. Lauf Gele
- Laden Sie etwa 1 µL des PCR-Produktes in jede Vertiefung der Polyacrylamid-Gel. Laden Sie eine DNA-Größe Leiter beidseitig auf das Gel zusammen mit Proben von PCR-Produkten. Befestigen Sie die Sicherheitsabdeckung an der oberen Sperrkammer.
- Schließen Sie die Leitungen an die Stromversorgung, passend die farbcodierten rot an Rot und schwarz an schwarz. Führen Sie das Gel bei einer Konstanten Spannung von 110 V, bis der Farbstoff eine definierte Position, normalerweise für ~ 70 min erreicht.
Hinweis: Die Spannung und laufen Zeit kann je nach Größe der PCR Produkte eingestellt werden.
5. Silber-Färbung zum Nachweis von SSR-Marker in ein nicht-Polyacrylamid-Gel
- Nach Elektrophorese Ablassen des Puffers von der oberen Kammer in ein großes Becherglas über das Ventil. Lösen Sie die Spannpratzen, entfernen Sie die Platten aus dem Gerät, sorgfältig trennen Sie die eingekerbte Glasplatte entlang einer Seite mit einem Spatel und stellen Sie sicher, dass das Gel bleibt mit der anderen Glasplatte verbunden mit Bind Silan beschichtet.
- Machen Sie 1 L frische Imprägnierung Lösung durch Auflösen von 1,5 g von AgNO3 in 1 L dH2O. bereiten 1 L frische Entwicklung Lösung durch Auflösen von 10 g NaOH in 900 mL dH2O zu, fügen Sie 1 mL 37 % Formaldehyd , und passen Sie zu einem Endvolumen von 1 L mit dH2O.
Hinweis: Tragen Sie Handschuhe und behandeln Sie die oben genannten Chemikalien und Lösungen mit Sorgfalt zu. Es ist nicht notwendig, die Lösungen und die entsprechenden Schritte mit den Lösungen im Dunkeln zu halten. - Spülen Sie sorgfältig die Gel und Glas Platte mit reichlich dH2O zum Entfernen des Elektrophorese Puffers, dann die Platte mit dem Gel nach oben auf ein Kunststoff-Tablett und Tauchen Sie das Gel in 1 L Imprägnierung Lösung. Stellte das Tablett auf einem Boston-Shaker.
- Schütteln Sie das Fach bei 60 u/min für ca. 3-4 min leicht.
Hinweis: Schütteln Mal nach Gel Stärke und Konzentration von Silbernitrat in der Imprägnierung Lösung einstellbar. - Bewegen Sie die Platte aus der Imprägnierung Lösung und setzen Sie es auf einem anderen Fach. Spülen Sie die restliche Imprägnierung Lösung Weg von der Oberfläche der Platte und das Gel mit reichlich dH2O zweimal für 3-5 s.
- Legen Sie die Platte mit dem Gel nach oben auf einem anderen Fach, Tauchen Sie die Platte in 1 L Lösung für die Entwicklung, dann schütteln Sie das Fach vorsichtig bei 50 u/min für ~ 3 min. Monitor die Darstellung von DNA-Fragmenten und stoppen Sie Entwicklung zu, wenn das höchste Verhältnis des Signals von DNA-Fragmenten um den Lärm der Hintergrund beobachtet (dieser Schritt dauert ca. 3 min).
- Spülen Sie die Platte und das Gel mit reichlich dH2O zweimal, und trocknen Sie die Gelplatte mit einem Papiertuch.
- Das Gel mit einem geeigneten Scanner zu scannen. Eine Auflösung von 300 dpi bietet eine übersichtliche Visualisierung von DNA-Fragmenten. Das Gel kann auch mit einer Kamera fotografiert werden.
- Bandenmuster von SSR-Marker kann basierend auf der DNA-Fragmente im Bild bewertet werden.
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Representative Results
Der PCR-Amplifikate wurden mit den korrespondierenden SSR Grundierung Paare in Blüte Chinakohl und Tabak hergestellt. Nach Elektrophorese waren die Polyacrylamid-Gele befleckt mit dem oben genannten Silber Färbeprotokoll, die eindeutig die Streifenbildung Muster des SSR-Marker (Abbildung 1) entdeckt.
Um die nachweiseffizienz verschiedene Silber Färbung Protokolle vergleichen, PCR-Produkte von SSR-Marker im Tabak und blühenden Chinakohl mit Polyacrylamid Gelelektrophorese getrennt wurden und mit fünf veröffentlichten silberne Färbung visualisiert Protokolle9,11,12,13,14 , das neue Protokoll. Alle sechs Protokolle erkannt SSR Streifenbildung Muster für Tabak und der Blüte Chinakohl Genotypen (Abbildung 2), aber dieses Protokolls hatte den niedrigsten Geräuschpegel und höchsten Kontrast der DNA Fragmente, so dass es das höchste Bild produziert Klarheit für die eindeutige Screening von SSR-Polymorphismen. Die Laufzeit und die Anzahl der Hauptschritte und Reagenzien verwendet, um die silberne Färbung Prozess abzuschließen sind in Tabelle 1 aufgeführten, für jedes Protokoll, das neue Protokoll nimmt am wenigsten Zeit und erfordert weniger chemische Reagenzien und Prozessschritte.
Abbildung 3 zeigt die Sensitivität des Protokolls gemessen 50-2.000 bp DNA-Marker auf einem nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel.
Abbildung 1: Erkennung von SSR Muster Streifenbildung. Erkennung von SSR banding Muster für Genotypen der Blüte Chinakohl (A) und Tabak (B) die neue silberne Färbung mit Protokoll. Die PCR-Produkte wurden auf 6 % nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gele getrennt und gemäß den oben berichtet Silber Färbeprotokoll gebeizt. Lane M ist DNA Größe Marker, Bahnen 1 bis 62 repräsentieren die Amplifikate 62 Genotypen verstärkt von SSR-Primer-Paaren von "CX-157" (die vorwärts- und Primer-Sequenzen sind 5'-TCGACGCTGACTTCACTGAC-3' und 5'- GGACAGCTTCACACATTTGC-3', bzw.) in Blüte, Chinakohl (Abbildung 1A) und "PT51333" (die vorwärts- und Primer-Sequenzen sind 5'- GCACCTTTGGTTATCCGACA-3' und 5'- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3', bzw.) im Tabak (Abbildung 1 b). Die Pfeile zeigen auf die Ziel-SSR-Bands. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Vergleich der nachweiseffizienz für SSR-Marker im Tabak und blühenden Chinakohl Genotypen mit verschiedenen Silber Färbung Protokolle. Die PCR-Produkte wurden in 6 % der nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gele getrennt und gebeizt mit fünf veröffentlicht silberne Färbung Protokolle9,11,12,13,14 und der neuen Protokoll. Lane M ist DNA Größe Marker. Bahnen 1 bis 4 Stellen der Amplifikate der SSR-Primer von "PT50903" (die vorwärts- und Primer-Sequenzen sind 5'-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG-3 'und 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3', beziehungsweise) in vier Tabak Genotypen; Bahnen 5 bis 8 zeigen die Amplifikate der SSR Primer "CX-43" (die vorwärts- und Primer-Sequenzen sind 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3 'und 5'-AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3", beziehungsweise) in vier Blüte Chinakohl Genotypen. Die Ziel-SSR-Bänder sind mit Pfeilen gekennzeichnet. Diese Zahl wurde von der Abbildung 2 von Liu Et al.modifiziert. 8 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Empfindlichkeit des Protokolls gemessen an 50-2000 bp DNA-Marker auf einem nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel. Die erste Spur war beladen mit 1µL DNA-Marker mit Fragment Größen von 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 1000, 1500 und 2000 bp, jeweils 10 ng/µL. Die restlichen Proben wurden mit einer 1:2 serielle Verdünnung in vorhergehenden Gassen geladen. Die minimale nachweisbare Menge für das Protokoll war 9,8 Pg 11th Lane (2.2 Pg/mm2 in einem gut 4,5 mm-2 ). Diese Zahl wurde aus der Abbildung 1 von Liu Et Al. modifiziert 8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Artikel | Sanguinetti Et al. 9 | Qu Et al. 11 | Eine Et al. 12 | Byun Et al. 13 | Kumar Et al. 14 | Neues Protokoll |
| Laufzeit (min.) | 30 | 12-25 | 8 – 9 | 9 – 31 | 42 | 6 – 7 |
| Anzahl der Schritte | 5 | 4 | 3 | 3 | 3 | 2 |
| Anzahl der Reagenzien | 5 | 6 | 6 | 5 | 7 | 3 |
Tabelle 1: Laufzeit, Anzahl der Schlüsselschritte und Reagenzien in den verschiedenen Silber Färbung Protokolle.
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Discussion
Das Waschen von Gel nach der Imprägnierung ist ein entscheidender Schritt. Unzureichende Reinigung Zeit und Wasser Volumen kann dazu führen, dass die unvollständige Entfernung der Imprägnierung Lösung auf der Oberfläche der Platte und das Gel und führen zu einem dunklen Hintergrund. Die entsprechenden Entwicklungszeit ist ein weiterer wichtiger Schritt, übermäßige Entwicklung kann dazu führen, dass ein dunkel-braunen Hintergrund mit kontrastarmen Bild von DNA-Fragmenten. Darüber hinaus beeinflusst die Imprägnierung Schritt deutlich Färbung Effizienz von DNA-Fragmenten. Obwohl Imprägnierung über 5 min verlängert oder erhöht AgNO3 in der Imprägnierung Lösung nicht erheblich verbessern die Färbung Qualität, eine Verringerung der Imprägnierung Zeit auf weniger als 3 min oder Verringerung der Menge an AgNO3 ) < 1 g) kann dazu führen, dass die grauen oder flachen schwarzen DNA-Fragmente.
Eine schnelle und einfache Bedienung für effiziente DNA-Nachweis ist wünschenswert, dass eine silberne Färbung Methode. Das neue Protokoll in dieser Studie entwickelten vermeidet die Festsetzung, stoppen und mehrere Waschschritte beschrieben in anderen Protokollen6,9,10,11,12,13 , 14 ohne die Färbung Qualität (Abbildung 1 und Abbildung 2), und erfordert nur zwei einfache Schritte der Imprägnierung und Entwicklung, die 7 Minuten dauern. Daher ist das neue Protokoll schneller als alle anderen Färbung Protokolle aktuelle verfügbar6,7,9,10,11,12, 13,14. Darüber hinaus erfordert das neue Protokoll nur drei Chemikalien, dh. AgNO3, Formaldehyd und NaOH in ähnlichen Mengen wie in anderen Protokollen6,7,9,10,11,12 13,14, daher das neue Protokoll ist sparsamer und erzeugt weniger chemische Gefahren, die nicht nur reduziert die chemische Kosten, sondern minimiert auch den gefährliche Material-Handling-Prozess von zusätzlichen Chemikalien in den Labor.
Das neue Protokoll produziert klare Bilder mit geringes Grundrauschen für den eindeutigen Nachweis von SSR Streifenbildung Mustern in Tabak und Blüte Chinakohl Genotypen (Abbildung 1). Im Vergleich mit anderen Protokollen, produziert das neue Protokoll das beste Färbung Wirkung mit der niedrigsten Hintergrundgeräusche und höchsten Bild Kontrast (Abbildung 2). Im Bereich von 50-500 bp, die Empfindlichkeit des neuen Protokolls für DNA-Nachweis war weniger als 19.5 Pg/µL (4.3 Pg / mm2) mit eine minimale Konzentration von 9,8 Pg/µL (2.2 Pg/mm2) (Abbildung 3), die ist höher als in anderen Protokollen 7 , 12 , 13.
Obwohl Fluoreszenz-Kennzeichnung Technologien hoher Durchsatz und Auflösung Nachweis von DNA-Amplifikate liefern können, benötigen sie spezialisierte Ausrüstung und teurer Reagenzien, die möglicherweise nicht zugänglich für viele biologische Laboratorien, insbesondere in den Entwicklungsländern. Das neue Färbung Protokoll ist einfach und schnell, die kann ~ 800 DNA-Proben pro Person pro Tag, also Bildschirm, ist eine gute Option für diese Labors zur routinemäßigen Untersuchungen durchführen.
Fazit: das neue Protokoll in dieser Studie entwickelten ist Prozess, einfacher zu implementieren, billiger, schneller und verwendet nur drei Reagenzien – ohne Kompromisse bei der Erkennung Effekt oder Bild Klarheit — als alle anderen vorhandenen Silber Färbetechniken. Das neue Silber Färbeprotokoll kann in Tabak und blühenden Chinakohl Forschung erfolgreich eingesetzt und ein wertvolles Instrument für die erfolgreiche SSR Genotypisierung bei anderen Spezies.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Guangdong Natural Science Foundation of China (2015A030313500), der provinziellen Key International Cooperative Forschungsplattform und der großen wissenschaftlichen Forschung Projekt von Guangdong Higher Education (2015KGJHZ015), die Wissenschaft finanziert und Technologieplan Guangdong Tobacco Monopoly Verwaltung (201403, 201705), der Wissenschaft und Technologieplan von Guangdong China (2016B020201001), der nationalen Innovationssysteme Ausbildungsprojekt für Studierende (201711078001). Erwähnung von Handelsnamen oder kommerzielle Produkte in dieser Publikation ist ausschließlich zum Zweck der Bereitstellung von spezifischen Informationen und bedeutet keine Empfehlung oder Billigung durch das US Department of Agriculture. USDA ist eine Chancengleichheit Anbieter und Arbeitgeber.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | - | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | - | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | - | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | - | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | - |
References
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