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Immunology and Infection

आरएनए विश्लेषण के लिए बड़े जानवरों से लिम्फ नोड्स के संग्रह और प्रसंस्करण: बड़े पशु प्रजातियों के लिम्फ नोड Transcriptomic अध्ययन के लिए तैयारी

Published: May 19, 2018 doi: 10.3791/57195
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1National Animal Disease Center, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

Summary

इस प्रोटोकॉल की पहचान और पशुधन और वंय जीवन, नमूना दृष्टिकोण से लिम्फ नोड्स के उत्पाद में कदम सहित बड़े जानवरों से लिम्फ नोड के ऊतकों की transcriptomic रूपरेखा के लिए एक आरएनए के अलगाव के लिए प्रक्रियाओं का एक सिंहावलोकन प्रदान करता है एकाधिक पशुओं में एकरूपता प्रदान करने के लिए, और आरएनए विश्लेषण के लिए पोस्ट-संग्रह संरक्षण और संसाधन के लिए विचार प्लस प्रतिनिधि परिणाम ।

Abstract

बड़े जानवरों (दोनों पशुधन और वंय जीवन) पशुजन्य रोगजनकों के महत्वपूर्ण जलाशयों के रूप में सेवा करते हैं, जिनमें ब्रूसेला, माइकोबैक्टीरियम bovis, साल्मोनेलाऔर ई. कोलाई, और रोगजनन के अध्ययन के लिए उपयोगी हैं और/ प्राकृतिक मेजबान में बैक्टीरिया का प्रसार । मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में लिम्फ नोड्स के प्रमुख समारोह के साथ, लिम्फ नोड ऊतकों बहाव transcriptomic विश्लेषण के लिए आरएनए के एक संभावित स्रोत के रूप में सेवा, क्रम में एक संक्रमण के पाठ्यक्रम पर कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति में लौकिक परिवर्तन का आकलन करने के लिए. इस लेख में लिम्फ नोड संग्रह, ऊतक नमूना, और बहाव आरएनए प्रसंस्करण पशुधन की प्रक्रिया का एक सिंहावलोकन प्रस्तुत करता है, एक मॉडल के रूप में पशु (Bos taurus) का उपयोग कर, अतिरिक्त उदाहरण के साथ अमेरिकी बायसन (जंगली भैंसों की जंगली भैंसों से प्रदान की ). प्रोटोकॉल स्थान, पहचान, और शरीर में कई प्रमुख साइटों से लिम्फ नोड्स को हटाने के बारे में जानकारी शामिल है । इसके अतिरिक्त, एक बायोप्सी नमूना पद्धति प्रस्तुत की है कि कई जानवरों के पार नमूने की एक निरंतरता के लिए अनुमति देता है । नमूना संरक्षण के लिए कई विचार आरएनए-sequencing और आरटी-पीसीआर की तरह बहाव के तरीके के लिए उपयुक्त आरएनए की पीढ़ी सहित, चर्चा कर रहे हैं. लंबे समय से बड़े जानवर बनाम माउस समय पाठ्यक्रम अध्ययन में निहित देरी के कारण, जंगली भैंसों और गोजातीय लिम्फ नोड के ऊतकों से प्रतिनिधि परिणाम इस ऊतक प्रकार में गिरावट के समय पाठ्यक्रम का वर्णन करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं, की एक समीक्षा के संदर्भ में पिछला methodological अन्य ऊतकों में आरएनए क्षरण पर काम करते हैं । कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल दोनों पशु चिकित्सा बड़े जानवर के नमूनों पर transcriptome परियोजनाओं की शुरुआत और आणविक जीव में vivo ऊतक नमूने और इन विट्रो में प्रसंस्करण के लिए तकनीक सीखने में रुचि के शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो जाएगा ।

Introduction

आरएनए-sequencing विश्लेषण लिम्फ नोड्स के transcriptome के रोगजनकों की एक किस्म के लिए जानवरों की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को चिह्नित करने का अवसर प्रदान करता है । हालांकि इस पद्धति चूहों में बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है, विश्लेषण हाल ही में बड़ा स्तनधारी1,2में विस्तार किया गया है । पशुधन/बड़े पशु लिम्फ नोड्स के लिए एक संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिक्रियाओं की विशेषता इस्तेमाल किया जा सकता है, न केवल वैक्सीन या आनुवंशिक संवेदनशीलता के अध्ययन में उनके उपयोग के लिए और दवा के विकास के लिए लक्ष्य की पहचान के लिए, लेकिन यह भी मानव अध्ययन के लिए मॉडल सिस्टम के रूप में पशुजन्य रोगों पर । उदाहरण के लिए, brucellosis के मामले में (एक पशुजन्य जीवाणु रोग है कि प्रभावों दुनिया भर में हर साल आधा लाख लोगों), काफी बढ़ लागत के बावजूद, भेड़ या बकरी में अध्ययन मानव संक्रमण और मानव वैक्सीन के लिए अधिक प्रासंगिक हैं प्रयोगशाला पशु मॉडल से विकास । माउस संक्रमण मॉडल दोहराऊंगा reticuloendothelial प्रणाली संक्रमण नहीं बल्कि विशेषता नैदानिक लक्षण3।

प्रयोगशाला पशु अध्ययन की तुलना में बड़े पशु प्रयोगों में, आवश्यक रूप से ऊतक कटाई की प्रक्रिया इच्छामृत्यु और ऊतक संग्रह है, जो के संरक्षण के लिए एक संभावित चुनौती प्रस्तुत करता है के बीच अब देरी शामिल है उच्च गुणवत्ता आरएनए । अक्षुण्ण आरएनए जैविक रूप से प्रासंगिक transcriptomic डेटा की पीढ़ी के लिए आवश्यक है । ऊतक नमूनों से उच्च गुणवत्ता आरएनए की पीढ़ी विशेष रूप से बड़े पशु रोगजनक अध्ययन में शामिल सुविधाओं के लिए महत्वपूर्ण है । इस तरह के अध्ययनों के स्वाभाविक रूप से और अधिक प्रदर्शन के रूप में वे न केवल अनुमोदित सुविधाओं और उच्च प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता है, लेकिन यह भी महत्वपूर्ण वित्तीय लागत, जो, काम पर निर्भर करता है, दसियों डॉलर के हजारों की सैकड़ों को लेकर कर सकते है मुश्किल है । अध्ययन के इन प्रकार भी एक क्रॉस-अनुशासनात्मक सहयोग और पार उनके पूरा होने के लिए अनुशासनात्मक ज्ञान, उनकी जटिलता को जोड़ने शामिल है । इसलिए, के विकास पर प्रशिक्षण, और नमूना संग्रह और संरक्षण के लिए एक सुव्यवस्थित प्रणाली का पालन संक्रमित पशुओं से ऊतकों के बहाव आणविक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है ।

बड़ा लिम्फ नोड्स के संग्रह murine लिम्फ नोड्स के समान नमूना की तुलना में ऊतक संग्रह के लिए अतिरिक्त चुनौतियों प्रस्तुत करता है । नमूना उत्पाद के लिए तैयारी प्रासंगिक आंतरिक संरचनाओं सहित लिम्फ नोड के शरीर रचना विज्ञान की एक बुनियादी समझ आवश्यक । एक लिम्फ नोड की संरचना लसीकावत् खण्डों लिम्फ से भरा साइनस से घिरा हुआ शामिल है । इन संरचनाओं एक कठिन, रेशेदार कैप्सूल के भीतर संलग्न हैं । 4 एक लसीकावत् छोटि "लिम्फ नोड के बुनियादी संरचनात्मक और कार्यात्मक इकाई है" और कूप, एक गहरी cortical इकाई से बना है, और दिमाग़ी डोरियों और साइनस4 (आंकड़ा 1a) । बी और टी लिम्फोसाइटों क्रमशः रोम और गहरी cortical इकाइयों के लिए घर हैं । इन संरचनाओं एक 3 डी पाड़ प्रदान और लिम्फोसाइटों और प्रतिजन या प्रतिजन पेश कोशिकाओं के बीच बातचीत की सुविधा ।

मोटे तौर पर, रोम और गहरी cortical इकाइयों में कटौती की सतह पर पहचाना जा सकता है क्योंकि वे एक सघन जालीदार meshwork होते है और साइनस की तुलना में गहरा दिखाई देते हैं, जो एक अधिक नाजुक जालीदार meshwork के शामिल होते है और हल्का दिखाई देते है (चित्र 1b) । कंवेंशन के द्वारा, पैथोलॉजिस्ट लिम्फ नोड्स के क्षेत्रों को सतही प्रांतस्था (रोम), paracortex (डीप cortical यूनिट्स) और मज्जा (दिमाग़ी डोरियों और साइनस) के रूप में संदर्भित करते हैं । सभी तीन क्षेत्रों की एक उचित परीक्षा लिम्फ नोड्स के लिए नियमित रोग परीक्षा दिशा निर्देशों में सबसे अच्छा अभ्यास के रूप में माना गया है5. ध्यान दें कि वहां स्थिरता, आकार, और लिम्फ नोड्स के रंग में काफी भिंनता है, यहां तक कि एक जानवर के भीतर । जानवरों की उम्र के रूप में, उनके लिम्फ नोड्स आकार में कमी और छोटे जानवरों की तुलना में मजबूत हो जाते हैं, आम तौर पर उनके संयोजी ऊतक में वृद्धि और सामान्य लसीकावत् संरचना6,7की कमी की वजह से हो जाएगा ।

Figure 1
चित्र 1. लिम्फ नोड के एनाटॉमी। (क) इस कार्टून छवि लिम्फ नोड के एनाटॉमी से पता चलता है, कुंजी संरचनाओं का चित्रण. (ख) यह अभी भी छवि पार अनुभाग में एक गोजातीय लिम्फ नोड में कटौती से पता चलता है । नग्न आंखों को दिखाई दे रहे है कि प्रासंगिक संरचनाओं/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर, विभिन्न लिम्फ नोड्स संग्रह और विश्लेषण के लिए ब्याज की होगी । परिधीय लिम्फ नोड्स चमड़े के नीचे के ऊतकों में गहरे स्थित हैं । पशु, परिधीय या सतही लिम्फ नोड्स में अक्सर नैदानिक और प्रयोगात्मक अभ्यास में इस्तेमाल कर्णमूल, अवअधोहनुज, retropharyngeal, prescapular, prefemoral (precrural) और सतही वंक्षण (महिलाओं में supramammary, पुरुषों में अंडकोषीय) शामिल हैं ( चित्र 2) । तालिका 1में, कुंजी सतही लिम्फ नोड्स के गुण, पशु प्रणाली8में वर्णित के रूप में, उल्लिखित हैं । नीचे, मवेशियों के संक्रामक जीवाणु रोगों के लिए कुछ संभावित लिम्फ नोड संग्रह की योजना जांच के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं ।

ब्रूसेला abortus/ब्रूसेला melitensis: b. necropsiesके लिए मानक abortus-संक्रमित मवेशी और बी. melitensis-संक्रमित बकरी को राष्ट्रीय पशु रोग केंद्र में पुनर्प्राप्त supramammary, prescapular, और कर्णमूल लिम्फ नोड ऊतक , दोनों जीवाणु गणन के लिए पीसने के लिए और आरएनए तैयारी के लिए मेजबान आरएनए अभिव्यक्ति की रूपरेखा के लिए । B. abortus नियमित रूप से इन लिम्फ नोड्स में से प्रत्येक में प्रयोग किया जाता संक्रमित मवेशी9बरामद कर सकते हैं। इन लिम्फ नोड प्रकार में से प्रत्येक में बैक्टीरिया की उपस्थिति का पता लगाया जा सकता है B. melitensis-संक्रमित बकरियों में से कम नौ महीने के बाद, हमारी पढ़ाई (Boggiatto एट अल., अप्रकाशित) से आरएनए-आधारित तरीकों का उपयोग कर संक्रमण । साल्मोनेला एसपी.: prescapular, subiliac (prefemoral), और mesenteric लिम्फ नोड्स एक साल्मोनेला प्रसार के लिए10,11,12 और के लिए मवेशी लावे की रूपरेखा के दौरान उपयोगी हो गया है transcriptomic अध्ययन के लिए संभावित ब्याज की होगी । ई. कोलाई O157: H7: Mesenteric लिम्फ नोड्स (मध्य छोटी आंत और बाहर की छोटी आंत स्थानों पर) संक्रमित बछड़ों में जीवाणुओं की एक सामयिक वसूली की साइटों हो सकता है (लेकिन संक्रमित वयस्क मवेशियों में नहीं)13. लेप्टोस्पायरोसिस (Leptospira sp.): बैक्टीरिया की एक पुरानी दृढ़ता स्तन ग्रंथि14draining लिम्फ नोड्स में मनाया गया है । माइकोबैक्टीरियम bovis : मवेशियों में बैक्टीरिया mediastinal और बछड़ों के tracheobronchial लिम्फ नोड्स15से प्रायोगिक संक्रमण के बाद बरामद किया गया है । इसके अतिरिक्त, लिम्फ नोड आरएनए वायरस के लिए बड़े पशु मेजबान प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए उपयोग किया गया है, जैसे सुअर का प्रजनन और श्वसन सिंड्रोम वायरस 2. चित्रा 2 पशु शरीर में इन प्रमुख लिम्फ नोड्स के एक सबसेट के स्थान को दर्शाया गया है ।

Figure 2
चित्र 2: में चयनित लिम्फ नोड स्थानों चित्रण कार्टून Bos वृषभ . गिने लिम्फ नोड्स व्याख्या कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

इस पत्र में और संबंधित वीडियो, हम आरएनए अध्ययन के लिए बड़े जानवर लिम्फ नोड्स के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है, बड़े पशुओं के संक्रमण के transcriptomic अध्ययन में शामिल आणविक जीव के लिए जानकारीपूर्ण डिजाइन । सबसे पहले, हम लिम्फ नोड्स के लिए अलगाव प्रक्रिया का एक सिंहावलोकन प्रदान करते हैं, उदाहरण के रूप में गोजातीय और जंगली भैंसों के ऊतकों से नमूने का उपयोग । इस प्रदर्शन के साथ युग्मित, के रूप में वीडियो में प्रदर्शित, आरएनए अलगाव के लिए एक reproducible ऊतक नमूने के लिए एक कार्यप्रवाह है. अगला, हम एक संक्रमित लिम्फ नोड के प्रसंस्करण के लिए महत्वपूर्ण बातों का वर्णन, सुरक्षा पर ध्यान देने के साथ, निरंतरता, और आरएनए गुणवत्ता.

एक acidified phenol-guanidine isothiocyanate रिएजेंट के साथ ऊतक से आरएनए की तैयारी Chomczynski और Sacchi की मूल विधि पर आधारित है16,17, की उपस्थिति में सिलिका आधारित स्पिन स्तंभों पर एक शुद्धि के साथ chaotropic एजेंटों के मूल काम पर आधारित Vogelstein और गिलेस्पी18. हम भी transcriptomics के लिए पशु लिम्फ नोड्स वैकल्पिक तरीकों द्वारा संरक्षित से आरएनए की वसूली के लिए क्षमता की जांच । अंत में, हम बड़े पशु necropsies में आरएनए गुणवत्ता पर समय चर के प्रभाव का पता लगाने, एक प्रतिनिधि प्रयोग इच्छामृत्यु और जंगली भैंसों से बरामद आरएनए प्रोफ़ाइल पर नमूने के बीच समय में वृद्धि के प्रभाव को चित्रित करने सहित गोजातीय लिम्फ नोड्स । यह लेख न केवल आणविक जीव के लिए उपयोगी होगा, लेकिन यह भी पशु चिकित्सा शोधकर्ताओं को transcriptomic अध्ययन केसाथ ।

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Protocol

पशु necropsy प्रक्रियाओं यहां चित्रित राष्ट्रीय पशु रोग केंद्र, एंस, IA में अनुमोदित IACUC प्रोटोकॉल के तहत कवर कर रहे हैं । सभी प्रयोगों पशु देखभाल और कल्याण के लिए अनुमोदित दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया ।

1. पूर्व योजना Necropsy से पहले

  1. necropsy से पहले, necropsy सुइट के लिए परिवहन के लिए निम्न सामग्री तैयार करें:
    1. १.५ या 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब आरएनए संरक्षण समाधान के ~ १.० एमएल के साथ भरा, एक रैक या परिवहन कंटेनर में । ऊतक की मात्रा के संरक्षण के समाधान की मात्रा के अनुपात के लिए निर्माता के दिशा निर्देशों का पालन करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    2. डिस्पोजेबल नश्तर और स्वच्छ, autoclaved संदंश: त्वचा विदारक और लिम्फ नोड्स के लिए एक अलग सेट के लिए एक सेट (प्रत्येक लिम्फ नोड के लिए एक, प्रति पशु), इस प्रकार लिम्फ नोड के साथ त्वचा और पर्यावरण वनस्पति के एक पार संदूषण को रोकने ऊतकों.
    3. 3 मिमी पंच बायोप्सी उपकरण, necropsy चाकू, इस्तेमाल नश्तर और बायोप्सी उपकरणों के लिए एक sharps कंटेनर, और लिम्फ नोड विच्छेदन में उपयोग के लिए बोर्ड या डिस्पोजेबल ट्रे काटने.
    4. प्रणाली के लिए उपयुक्त बीएसएल स्तर पर काम के लिए आवश्यक पीपीई सहित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों का प्रयोग करें ।
    5. आटोक्लेव पुन: प्रयोज्य धातु उपकरण, संदंश सहित, धातु पंस में necropsy करने से पहले, बर्तन/सूखी वस्तुओं की स्थापना का उपयोग कर ।

2. पहचान और मवेशी और जंगली भैंसों में लिम्फ नोड्स के नमूने

Figure 3
चित्र 3 . गोजातीय सिर और गर्दन के लिम्फ नोड्स । (क) इस कार्टून छवि Bos वृषभके सिर और गर्दन के चयनित लिम्फ नोड्स से पता चलता है. (ख) इस छवि को पार खंड में कर्णमूल लिम्फ नोड से पता चलता है (बाएं) के रूप में कर्णमूल लार ग्रंथि की तुलना में पार खंड (दाएं) । दो ऊतक प्रकार के बीच textures में अंतर नोट करें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. पशु और जंगली भैंसों में prescapular लिम्फ नोड्स का अलगाव
    1. Euthanize जानवर (पशु या किसी भी उंर के जंगली भैंसों, प्रयोग के लिए उपयुक्त के रूप में) स्थानीय IACUC प्रोटोकॉल पर आधारित है । विशेष रूप से एक दिल की धड़कन की कमी, श्वसन की कमी, और एक corneal पलटा के अभाव सहित संस्थागत IACUC प्रोटोकॉल में वर्णित विधियों द्वारा मृत्यु की पुष्टि करें । पशु को necropsy मंजिल की ओर ले जाएं ।
      नोट: मानव इच्छामृत्यु के विभिंन तरीकों के बड़े पशुओं के प्रयोगशाला अभ्यास में इस्तेमाल कर रहे हैं । हालांकि, pentobarbital सोडियम और फ़िनाइटोइन सोडियम समाधान की नसों में प्रशासन सबसे अधिक अनुमोदित और उपयोग किया जाता है । पशुओं की इच्छामृत्यु के लिए AVMA दिशानिर्देशों का परामर्श लें । 19
      चेतावनी: एक पंचर प्रूफ कंटेनर में sharps के सुरक्षित निपटान के लिए दिशा निर्देशों सहित मेजबान संस्था में एक necropsy के लिए सभी प्रासंगिक सुरक्षा प्रोटोकॉल का पालन करें, और पुनः प्रयोज्य धातु चाकू और संदंश के संदूषण । इस प्रोटोकॉल प्रयोज्य नश्तर के उपयोग से sharps अपशिष्ट उत्पंन करता है । जूते, coveralls, दस्ताने, और आंख संरक्षण सहित संस्थागत दिशा निर्देशों, द्वारा तय के रूप में व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनते हैं ।
    2. जानवरों के ऊतकों पर काम करने के लिए 3 प्रतिभागियों को पहचानें ।
      नोट: यहां, विच्छेदन 1 वांछित पशुओं के ऊतकों के बड़े पैमाने पर अनुभाग के प्रभार में किया जाएगा, विखण्डित 2 अलग पशु वर्गों से लिम्फ नोड्स ठीक हो जाएगा, और एक अलग मेज पर काम करने के लिए प्रत्येक लिम्फ नोड से वर्गों अलग होगा और उंहें एक परिरक्षक समाधान के साथ ट्यूबों के लिए स्थानांतरण ।
    3. पार्श्व recumbency में पशु रखकर शुरू करो ।
    4. घुटने (कारप्स) के स्तर पर सामने अंग वापस चलती द्वारा कंधे का विस्तार; इस प्रस्ताव वापस कंधे लाने के लिए और लिम्फ नोड का एक आसान टटोलने का कार्य के लिए अनुमति देगा । लिम्फ नोड "गांठ" की उपस्थिति के लिए लग रहा है ।
      नोट: रोग की स्थिति के दौरान, lymphadenopathy मौजूद हो सकता है, जो लिम्फ नोड्स की पहचान आसान बनाता है, लेकिन इस प्रक्रिया में लिम्फ नोड की निरंतरता, संरचना और वास्तुकला को भी प्रभावित कर सकते हैं ।
    5. एक बार स्थित है, और कंधे के साथ अभी भी बढ़ाया, एक स्केलपेल या necropsy चाकू का उपयोग करने के लिए कंधे की रूपरेखा के साथ एक त्वचा चीरा बनाते हैं ।
      नोट: चीरा के आकार को सीमित नहीं है, भले ही लिम्फ नोड टटोलने का कार्य के माध्यम से स्थित किया गया है. एक बड़ा चीरा गहरी ऊतकों के लिए आसान पहुँच प्रदान करता है और लिम्फ नोड के उत्पाद उपक्षेत्र के लिए आसान बनाता है ।
    6. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, त्वचा को वापस लेने के लिए कंधे और गर्दन पेशियां की बात प्रकट करते हैं ।
      नोट: prescapular लिम्फ नोड अक्सर चमड़े के नीचे वसा में पाया जाता है, विशेष रूप से अधिक वातानुकूलित जानवरों में ।
    7. एक बार फिर, लिम्फ नोड (चित्रा 3) के स्थान टटोलना ।
      नोट: चमड़े के नीचे वसा के विपरीत, लिम्फ नोड अपने आकार पकड़ जब palpated होगा । इसके अतिरिक्त, लिम्फ नोड्स किसी भी आसपास के ऊतकों के साथ नहीं हैं, क्योंकि वे एक पतली रेशेदार कैप्सूल द्वारा संलग्न कर रहे हैं ।
    8. prescapular लिम्फ नोड का पता लगाने के बाद, ध्यान से चमड़े के नीचे वसा काटना, एक स्केलपेल और संदंश का उपयोग कर, और लिम्फ नोड को अलग ।
      1. एक पतली रेशेदार कैप्सूल की उपस्थिति के लिए देखो, के रूप में चित्र 1bमें चित्रित, लिम्फ नोड और वसा ऊतक के बीच भेद करने के लिए; लिम्फ नोड्स के आसपास के किसी भी ऊतक के साथ सटे नहीं हैं ।
    9. लिम्फ नोड विच्छेदन तालिका के लिए स्थानांतरण, ऊतक हस्तांतरण के लिए एक प्लास्टिक ट्रे का उपयोग कर, आगे के लिए अनुभाग ।
      नोट: बायसन में इन लिम्फ नोड्स की उपस्थिति के समान है । एसोसिएटेड वीडियो prescapular लिम्फ नोड की उपस्थिति के रूप में एक अमेरिकी बायसन के दाहिने कंधे से बाहर विच्छेदित दर्शाया गया है ।
  2. पशु और जंगली भैंसों में कर्णमूल लिम्फ नोड्स का अलगाव
    1. necropsy फर्श पर पार्श्व recumbency में पशु रखकर शुरू करो । temporomandibular संयुक्त (TMJ) की स्थिति जानें ।
      1. यदि यह पता लगाने के लिए मुश्किल है, mandible धीरे से ले जाएँ और जिस पर mandible खोपड़ी के लिए देता है उस स्थान का निर्धारण; यह TMJ है ।
    2. एक स्केलपेल या necropsy चाकू का प्रयोग, ध्यान से त्वचा में एक चीरा बनाते हैं । संयुक्त करने के लिए पृष्ठीय चीरा शुरू और यह विस्तार ventrally/jawline साथ खड़ी ।
    3. त्वचा काटना दूर चमड़े के नीचे ऊतक प्रकट करने के लिए । कर्णमूल लार ग्रंथि पहले दिखाई जाएगी, इसके बड़े आकार के कारण, lobulated सतह उपस्थिति, और लाल रंगाई ।
    4. संदंश और एक स्केलपेल का प्रयोग, कर्णमूल लार ग्रंथि एक तरफ ले जाने के लिए कर्णमूल लिम्फ नोड बस कपाल और लार ग्रंथि (चित्रा 3) के लिए औसत दर्जे का पता लगाने के लिए । आगे की प्रक्रिया से पहले बनावट के लिए कर्णमूल लिम्फ नोड ऊतक की जांच करें ।
      नोट: चेहरे की लिम्फ नोड्स (कर्णमूल और अवअधोहनुज) लार ग्रंथियों, जो लिम्फ नोड अलगाव पाया जा सकता है के साथ जुड़े रहे हैं । लिम्फ नोड्स की तुलना में, लार ग्रंथियों बहुत बड़ा कर रहे हैं और एक lobulated सतह उपस्थिति है । इसके अलावा, कट सतह पर, लार ग्रंथियों प्रकृति में समरूप और लिम्फ नोड्स के क्लासिक cortical और दिमाग़ी स्थापत्य पैटर्न का प्रदर्शन नहीं कर रहे हैं (चित्र बी).
    5. एक स्केलपेल के साथ ग्रंथि एक्साइज । यह लिम्फ नोड विच्छेदन तालिका के लिए स्थानांतरण, ऊतक हस्तांतरण के लिए एक प्लास्टिक ट्रे का उपयोग कर, आगे के लिए अनुभाग ।
  3. मादा पशु और बायसन में supramammary लिम्फ नोड्स का अलगाव
    1. पार्श्व recumbency में पशु प्लेस ।
    2. वंक्षण क्षेत्र को बेनकाब और थन का पता लगाने के लिए पिछले पैर तरक्की ।
      नोट: एक स्वस्थ, गैर स्तनपान कराने वाले जानवर में, इन लिम्फ नोड्स की टटोलने का कार्य संभव नहीं हो सकता है । एक स्तनपान कराने वाले जानवर में, इन लिम्फ नोड्स थन के आधार के caudal सीमा पर स्पष्ट किया जा सकता है ।
    3. एक स्केलपेल का उपयोग करना, एक चीरा सिर्फ थन के लिए पृष्ठीय, ऊपरी पैर के साथ चल रहा है, supramammary ग्रंथियों बेनकाब करने के लिए ।
    4. चमड़े के नीचे ऊतक काटना और supramammary लिम्फ नोड चमड़े के नीचे वसा की एक पतली परत में एंबेडेड लगता है । यदि नेत्रहीन नहीं भेद, चमड़े के नीचे वसा के भीतर एक फर्म संरचना की उपस्थिति के लिए उजागर ऊतक टटोलना ।
    5. संदंश और एक स्केलपेल का प्रयोग, ध्यान से बाहर वसा से लिम्फ नोड काटना । यह लिम्फ नोड विच्छेदन तालिका के लिए स्थानांतरण, ऊतक हस्तांतरण के लिए एक प्लास्टिक ट्रे का उपयोग कर, आगे के लिए अनुभाग ।

3. अनुभाग और लिम्फ नोड्स के भंडारण

  1. एक विच्छेदन तालिका में मुख्य necropsy स्थान से सटे अलग लिम्फ नोड्स को विखण्डित 2 से पृथक करें । एक काटने बोर्ड के एक ताजा अनुभाग पर प्रत्येक लिम्फ नोड प्लेस । पूर्व लेबल लिम्फ नोड द्वारा वर्गों में काटने बोर्डों, उत्तराधिकार में कई लिम्फ नोड्स की प्राप्ति की सुविधा के लिए. संक्रामक नमूनों के लिए, डिस्पोजेबल ट्रे का उपयोग करें ।
  2. संदंश और एक डिस्पोजेबल स्केलपेल या necropsy चाकू का उपयोग कर, लिम्फ नोड के एक खंड को हटा दें । एक तेज चाकू का उपयोग कर, एक sagittal कटौती करने के लिए लिम्फ नोड खोलने के लिए ।
  3. लिम्फ नोड के इंटीरियर की जांच करें, विशेष रूप से संक्रमित पशुओं से नमूनों में, विषमता, घावों, रंग मतभेदों के लिए देख रहे हैं, आदि टिप्पणियों को रिकॉर्ड करें ।
  4. (विकल्प 1) छोटे ऊतक वर्गों
    1. प्रत्येक लिम्फ नोड है कि मोटाई में 5 मिमी से कम कर रहे हैं और स्वच्छ संदंश के साथ एक आरएनए संरक्षण समाधान के साथ एक ट्यूब के लिए प्रत्येक टुकड़ा हस्तांतरण के उत्पाद बनाने के लिए डिस्पोजेबल नश्तर का प्रयोग करें ।
  5. (विकल्प 2) लिम्फ नोड बायोप्सी या सेक्शनिंग के तरीके
    नोट: बायोप्सी या खंड के तरीके, जब विभिंन नोड्स और पशुओं में समानांतर लिम्फ नोड वर्गों के लिए आवेदन किया, एक थोक आरएनए विश्लेषण के लिए नमूना ऊतक की निरंतरता प्रदान करते हैं ।
    1. कील खोदी विधि
      1. लिम्फ नोड के प्रोफ़ाइल भर में कोशिकाओं को पकड़ने के लिए sagittal अनुभाग की जांच करने के बाद, केंद्र से बाहरी कैप्सूल के लिए लिम्फ नोड से एक पाई के आकार का कील, उत्पाद । एक नोड के लिए चौड़ाई में 2 सेमी (मानक आकार, तालिका 1देखें), केंद्र है कि बाहरी चाप लंबाई में 4 मिमी और मोटाई में 5 मिमी है एक कील काट ~ १०० मिलीग्राम की एक गीला वजन होगा ।
      2. स्केलपेल का प्रयोग, छोटे टुकड़ों में कील काट, कोई 5 मिमी से मोटा, और लगभग ५०-१०० मिलीग्राम गीला ऊतक वजन में प्रत्येक ।
        नोट: स्थिरता के लिए, एक ही लिम्फ नोड से सभी कील टुकड़े प्रक्रिया या तो एक बैच में या अलग नलियों में एक प्रतिनिधि आरएनए प्रोफ़ाइल के लिए ब्याज की लिम्फ नोड से प्रदान करने के बाद ।
      3. संदंश के साथ ऊतक के टुकड़ों को आरएनए संरक्षण समाधान की मात्रा की तुलना में कम से 10 मात्रा वाली नलियों में रखें, जैसा कि ऊतक के आयतन में होता है ।
    2. पंच बायोप्सी विधि
      1. एक पंच बायोप्सी उपकरण का चयन करें यदि लक्ष्य विशिष्ट अनुभागों, जैसे विशिष्ट रोम नोड से एकत्रित करने के लिए है । संग्रह के लिए इच्छित नमूने के आकार के अनुरूप उपकरण का चयन करें । पंच बायोप्सी उपकरण आकार की एक श्रेणी में उपलब्ध हैं, व्यास में 1 से 8 मिमी ।
      2. नेत्रहीन लिम्फ नोड में नमूने के लिए ब्याज के क्षेत्रों का पता लगाने ।
      3. दबाव और ऊतक में उपकरण टर्निंग कोर बनाने के लिए, उत्पाद करने के लिए पंच बायोप्सी उपकरण का उपयोग करें । एक ट्यूब के लिए संदंश के साथ ऊतक टुकड़ा आरएनए संरक्षण समाधान के कम से 10 संस्करणों से युक्त स्थानांतरण । यदि मोटा से 5 मिमी, संदंश और एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए आगे ऊतक छोटे टुकड़ों में विभाजित ।
  6. एक बार नमूनों को संरक्षण समाधान (उदा., RNALater) में स्थानांतरित कर दिया गया है, उंहें कमरे के तापमान पर प्रयोगशाला में वापस परिवहन ।
  7. ऊतक प्रवेश के लिए अनुमति देने के लिए रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान ।
  8. अगले दिन, अतिरिक्त आरएनए परिरक्षक समाधान डालना और-८० डिग्री सेल्सियस पर ऊतक के नमूनों की दुकान. नमूनों को जमने से पहले जितना संभव हो उतना परिरक्षक निकालें । एक कुशल आरएनए परिरक्षक समाधान हटाने के लिए एक P1000 और/या P200 micropipette टिप का उपयोग करें ।
    चेतावनी: सुरक्षा डेटा पत्रक पर निर्दिष्ट के रूप में परिरक्षक समाधान के रासायनिक और पर्यावरणीय खतरों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उपयोग रोगज़नक़ के संक्रामक गुणों के आधार पर, उचित संरक्षण समाधान को त्यागें ।
    नोट: यहाँ प्रदान किए गए दिशा-निर्देश सामग्री की तालिकामें वर्णित आरएनए संरक्षण समाधान के लिए प्रदान किए गए हैं । वैकल्पिक संरक्षण समाधानों का उपयोग करते हुए निर्माता के दिशानिर्देशों से परामर्श करें ।

4. आरएनए लिम्फ नोड्स से प्रसंस्करण

चेतावनी: एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने पहनते हैं, और प्रसंस्करण कदम के लिए उचित आंख संरक्षण ।

नोट: यहां प्रयुक्त phenol-आधारित रिएजेंट सामग्री तालिका में वर्णन किया गया है (और प्रोटोकॉल निर्माता के दिशानिर्देशों पर आधारित है)20। वैकल्पिक phenol-आधारित रिएजेंट का उपयोग खरीदे गए विशिष्ट उत्पाद के लिए निर्माता की सिफारिशों के आधार पर, प्रक्रिया का एक संशोधन जरूरत हो सकता है ।

  1. नमूनों तक पहुंचने से पहले, aliquot ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) phenol-आधारित rehomogenization ट्यूबों (१.५ मिलीलीटर/ट्यूब), एक पिपेट का उपयोग कर ।
    चेतावनी: Phenol विषाक्त, संक्षारक, और एक स्वास्थ्य खतरा है । क्लोरोफॉर्म विषाक्त और एक स्वास्थ्य खतरा है । एक रासायनिक धुएं हुड में पूरा प्रसंस्करण कदम ४.१-४.९, और रसायनों के साथ किसी भी संपर्क को रोकने के लिए दस्ताने पहनते हैं । संयुक्त राज्य अमेरिका में, क्लोरोफॉर्म एक खतरनाक अपशिष्ट है; स्थानीय और संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार खतरनाक अपशिष्ट युक्त ट्यूबों के निपटान । इसी बीएसएल-2, बीएसएल-3, या बीएसएल-4 दिशा निर्देशों के तहत रोगजनकों से संक्रमित पशुओं से ऊतक के नमूनों की प्रक्रिया ।
  2. एक बार एक नमूना साफ संदंश के साथ microcentrifuge ट्यूबों से ढीला किया जा सकता है, तुरंत स्थानांतरण लगभग ५०-१०० मिलीग्राम संरक्षित ऊतक के phenol-आधारित रिएजेंट युक्त homogenization ट्यूब करने के लिए.
    1. phenol-आधारित रिएजेंट करने के लिए जोड़ने से पहले गल को सीमित करें । एक से अधिक नमूने प्रसंस्करण के लिए फ्रीजर से निकाल दिए जाते हैं जब सूखी बर्फ पर भंडारण का उपयोग करें ।
  3. कसकर ट्यूब टोपी, यह homogenizer पर जगह है, और phenol-आधारित रिएजेंट में एक रोटर-stater ऊतक homogenizer के साथ नमूना homogenize । कमरे के तापमान पर प्रसंस्करण पूरा करें । जब पूरा हो, एक बादल उपस्थिति के लिए जांच सुनिश्चित करने के लिए नमूना सफलतापूर्वक homogenized था; ऊतक एक बादल निलंबन में फैलाया जाना चाहिए ।
    नोट: एक 2 मिन आरएनए निष्कर्षण सेटिंग का उपयोग किया जाता है (homogenizer के लिए पूर्व-सेट RNA_02_1 सेटिंग सामग्री की तालिकामें वर्णित है; जमे हुए ऊतकों के लिए डिज़ाइन किया गया) । इस प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट रोटर-stater ( सामग्री की तालिकादेखें) बड़ी दांतेदार है और रेशेदार सामग्री सहित ऊतक प्रकार की एक सीमा के homogenization के लिए अनुकूलित । RNA_02_01 सेटिंग विशेष रूप से जमे हुए के लिए डिज़ाइन किया गया है (के रूप में ताजा करने के लिए विरोध) ऊतकों । लिम्फ नोड्स के रूप में रेशेदार संयोजी ऊतक घटक है, एक इसी तरह अनुकूलित रोटर-stater homogenizer एक प्रभावी पृथक्करण प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है । राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान देखें21 homogenization अनुशंसाओं के बारे में अतिरिक्त जानकारी के लिए ।
    1. ऊतक का बड़ा हिस्सा homogenization के बाद रहते हैं, तो homogenization प्रक्रिया को दोहराएँ. आदेश में आरएनए ठीक करने के लिए, ऊतक अच्छी तरह से असंबद्ध होना चाहिए.
    2. अधिक रेशेदार लिम्फ नोड टुकड़ों के लिए, संदंश और कैंची का उपयोग करने के लिए homogenization ट्यूब को हस्तांतरण करने से पहले कई छोटे टुकड़ों में लिम्फ नोड टुकड़ा पूर्व काटना । परिचय में वर्णित के रूप में, पुराने जानवरों से लिम्फ नोड ऊतकों और अधिक रेशेदार हो सकता है ।
      नोट: यदि मेजबान और रोगज़नक़ आरएनए के एक दोहरे विश्लेषण वांछित है, अतिरिक्त उपचार (मनका homogenization के रूप में) बैक्टीरियल आरएनए की वसूली के लिए आवश्यक हो सकता है, खासकर अगर ग्राम-सकारात्मक रोगजनकों ऊतकों में मौजूद हैं ।
  4. तुरंत ट्यूबों से homogenized नमूना निकालें और यह RNase के लिए स्थानांतरण मुक्त microcentrifuge ट्यूबों (आकार में २.० मिलीलीटर) एक P1000 micropipette के साथ ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर १२,००० x g पर 5 मिनट के लिए नमूना केंद्रापसारक किसी भी नमूना मलबे को हटाने के लिए । एक P1000 micropipette टिप का प्रयोग, एक ताजा microcentrifuge ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण, पीछे गोली छोड़कर ।
  6. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए supernatant की मशीन । दो १.५ microcentrifuge ट्यूबों के बीच प्रत्येक नमूना विभाजित ।
  7. phenol-आधारित रिएजेंट (यानी, ०.३ एमएल एक १.५ मिलीलीटर नमूना के लिए) की 1 मिलीलीटर प्रति क्लोरोफॉर्म के ०.२ मिलीलीटर जोड़ें; यह 1-2 मिनट के लिए हाथ से पलटना चरणों मिश्रण करने के लिए, लेकिन नमूना भंवर नहीं है । यह कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए मशीन ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर १२,००० x g पर 15 मिनट के लिए यह केंद्रापसारक ।
  9. ध्यान से ऊपरी, एक micropipette टिप के साथ स्पष्ट जलीय चरण (P1000 या P200) जो ऊपरी परत फार्म का विघटन या लाल phenol-क्लोरोफॉर्म परत को बाधित किए बिना, हटा दें । यह एक नई microcentrifuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
  10. यह १००% इथेनॉल के बराबर मात्रा के साथ मिश्रण; यह ट्यूब 4-5 बार पलटने से अच्छी तरह से मिश्रण । ट्यूब अक्सर बादल दिखाई देगा ।
  11. एक micropipette टिप के साथ, एक सिलिका आधारित वाणिज्यिक स्पिन कॉलम के लिए तरल स्थानांतरण, आगे शुद्ध और आरएनए elute, निर्माता के निर्देश के बाद22। Elute आरएनए से उत्पन्न ~ ५० ऊतक के मिलीग्राम ५० में-१०० µ एल RNase मुक्त पानी की.
    नोट: phenol-आधारित रिएजेंट निष्कर्षण डीएनए qRT-पीसीआर और/या आरएनए-अनुक्रमण अनुप्रयोगों में आरएनए के बहाव के उपयोग के लिए, कार्बनिक चरण में निकालता है, DNase के साथ आरएनए के नमूनों की एक अतिरिक्त उपचार की सिफारिश की है ।
  12. Aliquot eluted आरएनए एक ठहराव और गुणवत्ता आकलन में उपयोग के लिए अलग ट्यूबों के लिए, मुख्य आरएनए नमूने के किसी भी फ्रीज-गल कम करने के लिए । भंडारण के लिए ट्यूबों-८० डिग्री सेल्सियस स्थानांतरण ।
  13. विशेष रूप से बीएसएल-3 रोकथाम स्तर पर, पशुजन्य रोगजनकों से संक्रमित पशुओं से व्युत्पंन लिम्फ नोड नमूने के मामले में, अगर नमूना एक कम से अधिक सुरक्षा स्तर में स्थानांतरित हो जाएगा रोगजनकों के अभाव के लिए परिणामी आरएनए नमूना सत्यापित गुणवत्ता विश्लेषण के लिए, आर टी-पीसीआर, और/या आरएनए-अनुक्रमण पुस्तकालय की तैयारी ।
    नोट: यह स्थानीय नियमों पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है, और सीडीसी के मामले में (रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र) चयन एजेंटों के साथ काम करने के लिए निष्क्रियता दिशानिर्देश, यह है शोधकर्ता स्थानीय साइट पर सभी निष्क्रियता प्रक्रियाओं को मांय करने के लिए आवश्यक है ।
    1. चरण ४.१२ (यानी, कुल आरएनए के ५० µ एल से 5 µ एल से प्रत्येक eluted आरएनए नमूना के 1/10वें मात्रा निकालें. एक बाँझ तकनीक का प्रयोग, एक बाँझ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में बैक्टीरियल विकास शोरबा के १०० µ एल के साथ नमूना मिश्रण. एक बाँझ प्लास्टिक प्रसारकर्ता का उपयोग करना, एक आगर प्लेट की सतह भर में आरएनए-शोरबा मिश्रण फैल गया ।
      नोट: एक शोरबा प्रकार का चयन करें और उस रोगज़नक़ के विकास के साथ सुसंगत प्लेट जिसके साथ जानवरों को चुनौती दी गई थी ।
    2. जानवरों को चुनौती दी गई रोगज़नक़ के विकास के लिए विशिष्ट शर्तों के तहत आगर प्लेट की मशीन । बीएसएल-3 समावेशन से नमूनों को हटाने से पहले बरामद बैक्टीरिया की अनुपस्थिति के लिए जांच करें ।
      नोट: परिणामस्वरूप eluted आरएनए, ठहराव और अखंडता के परीक्षणों के बाद, एक आरएनए-अनुक्रमण और आरटी-पीसीआर विश्लेषण सहित, बहाव अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है ।
  14. एक spectrophotometer का उपयोग कर आरएनए वसूली और पवित्रता का आकलन करें । आरएनए गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, एक विश्लेषण के लिए spectrophotometer के लिए eluted आरएनए नमूना के लोड 1-2 µ l. पराबैंगनी (यूवी) रेंज में नमूना के एक स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड.
    1. यूवी स्पेक्ट्रम से, एक२६०२८० अनुपात, एक२६०/२३० अनुपात, और नमूना (एक = अवशोषक) के लिए एक२६० मूल्य रिकॉर्ड ।
    2. ४० µ जी/एमएल की एकाग्रता पर एकल असहाय आरएनए के रूप में २६० एनएम में १.० का एक अवशोषक है, शुद्ध नमूनों के लिए एक२६० x ४० गुणा करके आरएनए एकाग्रता (µ g/एमएल) की गणना करें ।
  15. आरएनए अखंडता के आकलन की एक त्वरित विधि के रूप में, आगे विश्लेषण से किसी भी नीचा नमूनों को बाहर करने के लिए, 4 µ l के 1.5 x formamide लोडिंग डाई [९५% के साथ प्रत्येक आरएनए नमूना के 2 µ l को मिलाएं formamide, ०.०२५% (w/v) bromophenol नीला, ०.०२५% (w/v) xylene cyanol, 5 mM EDTA (pH ८.०), ०.०२५% (डब्ल्यू/वी) एसडीएस] में १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों23,24।
  16. हीट 1 मिनट के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों, और फिर बर्फ के लिए ट्यूबों 1 मिनट के लिए स्थानांतरण ।
  17. 1x TBE में तैयार 1% agarose जेल में नमूनों को लोड करें (आरएनए के लिए एक नेटिव agarose जेल ट्रो का पूर्ण विवरण के लिए, रियो, Ares जूनियर, Hannon, और Nilsen)24देखें । मानक जेल ट्रो तरीकों से नमूने अलग और 28S और 18S राइबोसोमल आरएनए बैंड की उपस्थिति की पुष्टि करें ।
  18. प्रतिनिधि परिणामों में और ंयूएलर, ओ. एट अल में वर्णित के रूप में आरएनए अखंडता निर्धारण [उदा., एक ट्रो और रिण (आरएनए अखंडता संख्या) विश्लेषण के लिए मात्रात्मक विश्लेषण विधियों के साथ जेल का पालन करें । २५ आणि श्रोएडर, ए. एट अल. 26.

5. Formalin से वैकल्पिक निष्कर्षण विधि-फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड (FFPE) ऊतकों

नोट: हालांकि FFPE ऊतक संरक्षण न्यूक्लिक एसिड संरक्षण की सबसे मजबूत विधि का प्रतिनिधित्व नहीं करता है, नीचे प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक तरह से कुछ transcriptional परिवर्तन का अध्ययन जब अंय संरक्षित ऊतकों अनुपलब्ध है हो सकता है ।

  1. प्लास्टिक कंटेनरों में formalin का वितरण करके ऊतक के संरक्षण के लिए formalin रिएजेंट तैयार करें । ऊतकों formalin में 20:1 formalin के अनुपात के साथ संरक्षित किया जाना चाहिए: ऊतक मात्रा/
    चेतावनी: Formalin एक ज्ञात मानव यलो है और हालांकि तीव्रता से विषाक्त नहीं, जीर्ण जोखिम (आमतौर पर सांस धुएं के माध्यम से) एक महत्वपूर्ण स्वास्थ्य खतरा प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । उचित वेंटिलेशन और पीपीई (यानी, nitrile दस्ताने का उपयोग, प्रारंभिक जोखिम के बाद 15 मिनट के भीतर बदल सकता है) के लिए स्वास्थ्य जोखिम को कम करने के लिए आवश्यक हैं । एक्सपोज़र मॉनिटरिंग और जोखिम मूल्यांकन पर अतिरिक्त जानकारी के लिए OSHA Formaldehyde Standard (29 CFR १९१०.१०४८) को देखें ।
    नोट: बहुत कम formalin का उपयोग ऊतक की क्षमता को पूरी तरह से संरक्षित जब परिरक्षक में डूबे बनने के लिए प्रभावित कर सकते हैं ।
  2. ब्याज की ऊतक के अलगाव के बाद, ध्यान से मोटाई में 5 मिमी से कम करने के लिए ऊतक ट्रिम कर दीजिए ।
    1. संदंश का उपयोग करना, ध्यान से formalin में छंटनी की ऊतक डूब किसी भी दिखावा कम करने के लिए ।
      नोट: पूरी तरह से निर्धारण के लिए अनुमति देने के लिए formalin में ऊतकों को पूरी तरह से जलमग्न होना चाहिए । यह महत्वपूर्ण है कि ऊतक के सभी सतहों पूरी तरह से formalin के साथ कवर कर रहे हैं ।
  3. एक बार formalin में ऊतकों को जलमग्न कर दिया गया है, ऊतक निर्धारण के लिए अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर कम से कम 24 घंटे के लिए हो ।
    नोट: Formalin ऊतकों धीरे प्रवेश, सभी सतहों से 1 मिमी प्रति घंटे की दर से27,28। इसलिए, ऊतक वर्गों की मोटाई से कम 5 मिमी करने के लिए पूरे ऊतक के एक तेजी से निर्धारण में परिणाम रखते हुए.
  4. निर्धारण के बाद, तेल embedding के लिए एक उपयुक्त एजेंट के ऊतकों स्थानांतरण ।
    नोट: उदाहरण के लिए, इस पांडुलिपि में जांच की ऊतकों embedding से पहले ७०% इथेनॉल को हस्तांतरित किया गया ।
  5. तेल में ऊतक एंबेड । 29
  6. धारा ऊतक मोटाई में 10-80 µm करने के लिए (उपयोग 10-20 µm अगर miRNA को निकाला जा वांछित है)29 ।
  7. स्केलपेल और संदंश का प्रयोग, प्रत्येक नमूने से एक ४० मिलीग्राम ऊतक टुकड़ा हटाने के लिए संसाधित किया जा करने के लिए और यह एक बाँझ में जगह, nuclease मुक्त microfuge ट्यूब.
  8. संरक्षित नमूनों से आरएनए निकालने के लिए FFPE ऊतक नमूनों की deparaffinization और न्यूक्लिक एसिड वसूली के लिए डिज़ाइन किया गया एक वाणिज्यिक किट का उपयोग.
    नोट: सामग्री की तालिका में संदर्भित किट xylene और इथेनॉल बहाकर तेल, एक चिढ़ाने के उपचार के कदम को दूर करने के लिए इस्तेमाल करता है, और एक ग्लास-फाइबर फिल्टर आरएनए को शुद्ध करने के लिए ।

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Representative Results

इस लेख में प्रस्तुत विचार का उपयोग (प्रोटोकॉल के 1-4 कदम) बड़े पशु नमूनों कि मेजबान जीन अभिव्यक्ति अध्ययन में एक बहाव के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है से आरएनए की वसूली में सहायता करेगा । बहाव अनुप्रयोगों के लिए आरएनए गुणवत्ता कई मानक उपायों द्वारा मूल्यांकन किया गया है । spectrophotometry के लिए, एक२६०/२८० अनुपात प्रोटीन संदूषण का एक उपाय प्रदान करता है, और एक२६०/२३० अनुपात शुद्धता आकलन है कि ऐसे phenol के रूप में रासायनिक पदार्थों का पता लगाने जाएगा का एक और साधन प्रदान करता है । प्रत्येक मामले में, के अनुपात ~ २.० उच्च गुणवत्ता आरएनए के सबूत हैं, और कम अनुपात संदूषण के सबूत हैं. महत्वपूर्ण बात यह है कि ये अनुपात आरएनए क्षरण के बारे में कोई जानकारी प्रदान नहीं करते हैं, जिसका मूल्यांकन गुणात्मक रूप से किया जा सकता है (चरण ४.१५-४.१७) और मात्रात्मक रूप से (चरण ४.१८, जैसे एक आरएनए अखंडता संख्या या रिण स्कोर).

यह महत्वपूर्ण है कि आरएनए के अपेक्षित गुणवत्ता स्तर लिम्फ नोड ऊतक वर्गों से बरामद किया है, औसत पर, आरएनए सफेद रक्त कोशिका के नमूनों से बरामद की तुलना में कम है । गोजातीय ऊतकों और सेल लाइनों से आरएनए निकालने की एक व्यापक श्रृंखला में, Fleige और Pfaffl30 पाते हैं कि औसत रिण (आरएनए अखंडता संख्या एक पर मापा जाता है) jejunum और रुमेन ऊतक और > 9 के लिए सफेद रक्त के लिए < 5 के बीच भिन्न होता है कोशिकाओं और कोष पिण्ड, लिम्फ नोड के साथ रिण स्कोर ६.९ के एक औसत पर बीच में गिरने. सामांय में, Fleige और Pfaffl30 ध्यान दें कि ठोस ऊतकों 6-8 से लेकर रिण स्कोर का उत्पादन, और संयोजी ऊतक के उच्च सांद्रता के साथ कि ऊतकों एक उच्च मतलब क्षरण का प्रदर्शन । लिम्फ नोड में संयोजी ऊतक का घनत्व, इसके अलावा इस ऊतक प्रकार में RNases के आंतरिक स्तर, लगातार रिण स्कोर के साथ आरएनए ठीक करने के लिए अक्षमता के लिए जिम्मेदार हो सकता है > 9 लिम्फ नोड्स से.

हालांकि, एक आरएनए supramammary लिम्फ नोड यहां प्रस्तुत की पद्धति का उपयोग कर से बरामद करने के लिए एक के लिए एक का एक उदाहरण के विश्लेषक प्रोफाइल में प्रदर्शित किया जाता है चित्रा 4a, ८.६ के एक रिण स्कोर के साथ आरएनए की वसूली का प्रदर्शन (मुख्य रूप से बरकरार है और उपयुक्त अनिवार्य रूप से सभी बहाव अनुप्रयोगों के लिए) । इस प्रक्रिया से उत्पन्न आरएनए सफलतापूर्वक आरएनए-अनुक्रमण में उपयोग के लिए पुस्तकालयों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है; इस प्रोटोकॉल का नियमित रूप से अलगाव की अनुमति देता है आरएनए के नमूने के साथ जंगली भैंसों और गोजातीय लिम्फ नोड्स के साथ रिण मूल्यों > 8 (और अक्सर > 9). आठ निकाले आरएनए नमूनों का एक नमूना सेट के लिए, २६० एनएम/280 एनएम पर औसत अवशोषक अनुपात २.१ था और २६० एनएम/230 एनएम था २.१, एक कम प्रोटीन संदूषण और phenol जैसे रसायनों के साथ एक कम संक्रमण का संकेत, क्रमशः । प्रत्येक निष्कर्षण से औसत न्यूक्लिक एसिड वसूली था ९७ ± 10 µ g प्रति ~ १०० mg या की एक उपज ~ 1 µ g आरएनए/मिलीग्राम लिम्फ नोड ऊतक

Figure 4
चित्र 4 . निकासी के तरीके से आरएनए गुणवत्ता चित्रण प्रतिनिधि गुणवत्ता निशान. (क) यह पैनल इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग कर, एक जंगली भैंसों की लिम्फ नोड से उत्पन्न उच्च गुणवत्ता आरएनए का एक कुल आरएनए ट्रेस दिखाता है । (B) यह पैनल तालिका 4से चयनित गोजातीय FFPE-नमूना का पता दिखाता है, जो बहुत नीचा आरएनए का चित्रण करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

बड़े लावे से ऊतकों की तेजी से अलगाव के साथ जुड़े चुनौतियों के कारण, विशेष रूप से वन्यजीव प्रजातियों से नमूने के मामले में, इच्छामृत्यु और एक आरएनए संरक्षण में ऊतक टुकड़े की नियुक्ति के बीच समय देरी का प्रभाव समाधान विश्लेषण में संभावित चिंता का विषय है । विशेष रूप से, लिम्फ नोड ऊतकों में आरएनए की स्थिरता के बारे में साहित्य में जानकारी सीमित है । इसलिए, ऊतक संग्रह के लिए स्वीकार्य मापदंडों के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए, जंगली भैंसों की लिम्फ नोड के बाद इच्छामृत्यु में आरएनए की स्थिरता की विशेषता थी ।

इस प्रयोग के लिए, समय 0 जानवर एक दिल की धड़कन की कमी और एक corneal पलटा की अनुपस्थिति से मृत घोषित किया गया था के रूप में माना जाता था । लोथ और necropsy की शुरुआत के परिवहन के बाद, ~ 15 मिनट पहले लिम्फ नोड नमूना की पुनर्प्राप्ति से पहले बीता था (15-20 मिनट के क्षेत्र जानवरों की वसूली के लिए हमारी टिप्पणियों में मानक था; समय पाठ्यक्रम स्थान के आधार पर भिन्न हो जाएगा ). supramammary लिम्फ नोड की पहचान की थी, और ऊतक के एक छोटे से अनुभाग हटा दिया गया था और कमरे के तापमान पर बनाए रखा । वर्गों के बाद लगभग 15 मिनट के अंतराल पर लिया और आरएनए परिरक्षक को हस्तांतरित किया गया; समय पाठ्यक्रम के बीच में, लिम्फ नोड का एक दूसरा नमूना श्रृंखला में 4 समय अंक के दूसरे सेट के लिए पशु से प्राप्त किया गया था (चित्रा 5; बंद हलकों, चित्रा 5C) । आरएनए ऊपर वर्णित विधि का उपयोग कर लिम्फ नोड टुकड़ों से समानांतर में निकाला गया था । इस 1 एच प्रयोग से पता चलता है कि लिम्फ नोड आरएनए समय पाठ्यक्रम भर में अपनी अखंडता के बहुमत को बनाए रखा, समय पाठ्यक्रम के अंत तक रिण स्कोर की केवल मामूली कटौती के साथ (चित्रा 5B और 5C). इसी प्रकार, गोजातीय prescapular और कर्णमूल लिम्फ नोड्स से आरएनए ने अपनी अखंडता को बरकरार रखा है ~ 1 h समय पाठ्यक्रमों के पोस्टमार्टम से अधिक रिण स्कोर द्वारा मापा (चित्रा 5C; पशु की जानकारी तालिका 2) में प्रदान की गई है । इसके अतिरिक्त, आरएनए supramammary लिम्फ नोड वर्गों है कि मौत के बाद 8 ज एकत्र किया गया था से निकाला गया था, या तो कमरे के तापमान पर या ३७ डिग्री सेल्सियस में एक जानवर लोथ में पकड़े समय अनुकरण करने के लिए सेल संस्कृति मीडिया में पूरे वर्गों पकड़ । राइबोसोमल आरएनए 8 एच होल्डिंग टाइम्स (चित्रा 5d) के बाद भी चौकसी थी ।

Figure 5
चित्र 5 . में आरएनए गुणवत्ता बायसन लिम्फ नोड समय पाठ्यक्रमों में एकत्र नमूनों के बाद मौत । (a) यह पैनल एक 1 h समय पाठ्यक्रम प्रक्रिया के एक प्रयोगात्मक सिंहावलोकन दिखाता है । (ख, ग) इन पैनलों एक अमेरिकी बायसन से पृथक एक supramammary लिम्फ नोड से एक 1 एच समय पाठ्यक्रम भर में लिए गए नमूनों के लिए आरएनए गुणवत्ता की एक परीक्षा दिखा. जेल आरएनए formamide में विकृत नमूनों को दर्शाता है और एक 1% गैर denaturing जेल पर अलग कर दिया । पैनल (सी) प्रत्येक नमूने के लिए रिण स्कोर में परिवर्तन को दर्शाया गया है । गोजातीय prescapular और कर्णमूल लिम्फ नोड्स पर अतिरिक्त प्रयोगों से डेटा संकेत के रूप में मढ़ा जाता है. (D) यह पैनल आरएनए जेल का एक उदाहरण दिखाता है, पैनल (बी) में इस्तेमाल जेल के लिए वर्णित के रूप में, या तो कमरे के तापमान (लेन 1) में या ३७ डिग्री सेल्सियस (लेन 2) सेल संस्कृति मीडिया में पर मशीन के 8 एच के बाद संसाधित supramammary लिम्फ नोड नमूनों के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

ये प्रतिनिधि निष्कर्षों अन्य ऊतक प्रकार और स्रोतों के लिए आरएनए स्थिरता परिणामों के अनुरूप हैं. तालिका 3 प्रकाशित पत्रों के नमूने के परिणामों का सारांश प्रदान करता है जिसने पूर्व-संरक्षण समय पाठ्यक्रमों पर आरएनए स्थिरता की जांच की है । ध्यान दें कि केवल रिण स्कोर और/या rRNA जेल अवलोकन (कुल आरएनए) से प्रवृत्तियों तालिका में शामिल हैं, हालांकि कुछ कागजात mRNA अखंडता का एक अतिरिक्त विश्लेषण प्रदान करते हैं, इस तरह के अनुपात के निर्धारण के माध्यम से के रूप में 5 ' बनाम 3 ' के वर्गों के चयनित RNAs (उदा, Fajardy एट अल.) 31. हालांकि, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि मौत और नमूना संरक्षण के बीच लंबे समय से आरएनए अभिव्यक्ति प्रोफाइल में परिवर्तन में परिणाम कर सकते हैं, के रूप में प्रदर्शन किया, उदाहरण के लिए, अपरा ऊतक के लिए31. स्थिर टेप की तुलना में, और अधिक अस्थिर RNAs समाप्त किया जा सकता है । इसलिए, यह महत्वपूर्ण है एक तेजी से, ऊतक वसूली के लिए सुव्यवस्थित कार्यप्रवाह का उपयोग करने के लिए किसी भी देरी को कम करने के लिए एक बार पशु necropsy के लिए उपलब्ध है, ताकि सबसे अधिक जैविक रूप से वैध आरएनए प्रोफाइल हासिल करने के लिए. यह मान लेना एक गलती होगी कि अक्षुण्ण राइबोसोमल आरएनए की उपस्थिति transcriptome प्रोफ़ाइल में किसी भी परिवर्तन के अभाव को इंगित करती है. फिर भी, प्रतिनिधि परिणाम सुझाव है कि बड़े जानवर नमूने के लिए आवश्यक वृद्धि प्रसंस्करण समय के साथ, यह आरएनए कि लिम्फ नोड नमूनों से एक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए उपयुक्त है तैयार करने के लिए संभव है.

साथ ही, पश्चात् गल टाइम चर के प्रभाव की जांच की गई; इस समय के दौरान, आरएनए ऊतक में मौजूद nucleases से क्षरण की संभावना है । आरएनए के नमूने की गुणवत्ता या तो 0 या ६४ मिनट के कमरे के तापमान पर पकड़ के समय के साथ इस प्रोटोकॉल का उपयोग संसाधित ४.१ एक रिण स्कोर द्वारा मापा गया था । यह प्रयोग दर्शाता है कि प्रोटोकॉल गल टाइम के प्रति काफी असंवेदनशील है, जिससे कई नमूनों की प्रोसेसिंग (फिगर 6A) के लिए मजबूत होती है ।

Figure 6
चित्रा 6. आरएनए गुणवत्ता मापदंडों का अतिरिक्त विश्लेषण। (क) इस पैनल के लिए आरएनए गुणवत्ता के परिणाम से पता चलता है शाही सेना के लिए या तो तुरंत गल (0 मिनट) के बाद या प्रसंस्करण के लिए पहले कमरे के तापमान पर ६४ मिनट के लिए पकड़ के बाद शुद्ध । सलाखों के प्रत्येक शर्त के लिए 3 ऊतक टुकड़े के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं, मानक विचलन ± । सभी ऊतकों को एक आरएनए परिरक्षक समाधान गल से पहले में संग्रहीत किया गया, जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है । (ख) यह पैनल संयोजी ऊतक के बड़े वर्गों से युक्त एक खराब homogenized लिम्फ नोड टुकड़ा से एक नमूना का पता लगाने के एक विश्लेषक पता चलता है । 5 एस रेंज में चोटियों की तुलना में, 28S और 18S चोटियों के छोटे आकार, स्पष्ट है । यह भी आरएनए के क्षरण के कारण हो सकता है, हालांकि 5 एस रेंज के बीच अपेक्षाकृत सपाट आधार रेखा और 18S चोटी वैकल्पिक रूप से गरीब निष्कर्षण का सुझाव है; देखें Avraham, आर एट अल. ४८ अतिरिक्त विवरण के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

लिम्फ नोड्स से आरएनए के अलगाव की तुलना के एक बिंदु के रूप में, पशु से FFPE mesenteric लिम्फ नोड टुकड़े से आरएनए के एक परीक्षण वसूली आयोजित किया गया था । के रूप में ऊपर वर्णित है, नमूने formalin में 1 सप्ताह के लिए तेल embedding से पहले तय किए गए, तेल में भंडारण के 4 महीने के कमरे के तापमान पर पीछा किया । ऊतकों ५ १० µm वर्गों में खोदी गई थी, और FFPE निष्कर्षण प्रक्रिया का उपयोग कर, लगभग ६२ प्रति आरएनए के एनजी/µ एल (± 14 एनजी/µ एल) बरामद किया गया था । २६० एनएम/280 एनएम में अवशोषक अनुपात १.९ औसत, प्रोटीन संदूषण के निंन स्तर के साथ एक उत्पाद का संकेत है, हालांकि एक२६०/२३० अनुपात प्रतिकूल (तालिका 4) थे । ध्यान दें कि इन नमूनों के लिए स्वीकार्य रिण स्कोर बहुत कम थे (< 2), आरएनए उत्पादों के क्षरण का संकेत (तालिका 4; चित्रा 4B), Srinivasan एट अलके विवरण के अनुरूप । ४५. qPCR का उपयोग परख में, आरएनए के आम तौर पर छोटे वर्गों, या अधिक विशेष रूप से सीडीएनए (< २०० bp), परिलक्षित होते हैं । इसलिए, छोटे उत्पादों के प्रवर्धन अभी भी अपमानित नमूनों से हो सकता है, और qPCR विश्लेषण किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, यह qPCR द्वारा इन FFPE से बरामद नमूनों से राइबोसोमल प्रोटीन S9 (RPS9) प्रतिलिपि के एक खंड बढ़ाना संभव था । CT मान नमूने और औसत १९.२ ± १.८ के बीच संगत थे । FFPE-तैयार नमूनों का उपयोग करते समय मौजूद सीमाओं को ध्यान में रखें, तथापि, के रूप में बड़े उत्पादों जरूरी मौजूद नहीं हैं, और क्षरण सभी नमूनों में एक समान दर पर नहीं हुई हो सकता है । इसलिए, इस सामग्री निरंतर के साथ अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन महत्वपूर्ण सीमाओं आरएनए-अनुक्रमण की तरह किसी भी बहाव अनुप्रयोगों के लिए मौजूद हैं ।

लिम्फ नोड प्रकार स्थान लंबाई चौड़ाई नोड्स द्वारा सूखा क्षेत्र
Prescapular बस कंधे संयुक्त करने के लिए औसत दर्जे का; चमड़े के नीचे वसा में एंबेडेड और मांसपेशियों की एक परत के नीचे 1-10 सेमी 1.5-2 सेमी गर्दन की त्वचा; कंधे; और त्वचा, मांसपेशियों, और निचले वक्ष अंग के जोड़ों (ref. 8)
Prefemoral (जिसे precrural भी कहा जाता है) दबाना बस पृष्ठीय और औसत दर्जे का, लगभग वुटने ऊपर 12-15 सेमी 8-10 सेमी २.५ सेमी श्रोणि अंग, पेट, और छाती के caudal भागों की त्वचा (ref. 8)
Retropharyngeal ग्रसनी midline पृष्ठीय में पाया 4-5 सेमी 2-3.5 सेमी जीभ, मौखिक गुहा की श्लेष्मा झिल्ली, मसूड़ों, होंठ, हार्ड तालु, लार ग्रंथियों, गर्दन की मांसपेशियों के अधिकांश
कर्णमूल temporomandibular संयुक्त करने के लिए चमड़े के नीचे स्थित ventral, caudal masseter मांसपेशी (रेफरी .8) 6-9 सेमी 2-3 सेमी त्वचा, subcutis, सिर की मांसपेशियों के अधिकांश, आंख और कान की मांसपेशियों, पलकें, अश्रु ग्रंथि, नाक गुहा के rostral भाग
अवअधोहनुज (हो सकता है 1-3 वर्तमान) mandible के कोण के औसत दर्जे का पहलू पर चमड़े के नीचे स्थित, लार ग्रंथियों के साथ जुड़े 3-4 सेमी 2-3 सेमी थूथन, होंठ, गाल, हार्ड तालु, नाक गुहा के rostral भाग, जीभ की नोक, त्वचा और सिर की मांसपेशी (ref. 8)
Supramammary (स्त्री सतही वंक्षण, सामान्यतया २ उपस्थित) पाया caudally और पृष्ठीय स्तन ग्रंथियों के सापेक्ष 6-10 सेमी थन, योनी, योनि के बरोठा, जांघ के औसत दर्जे का और caudal पहलुओं पर त्वचा, पैर की औसत सतह
अंडकोषीय (सतही वंक्षण के पुरुष संस्करण) अंडकोश की थैली की गर्दन के आसपास वसा की एक परत के भीतर सार्वजनिक पट्टा नीचे पाया 3-6 सेमी अंडकोश की थैली, चमड़ी, और लिंग

तालिका 1. गोजातीय सतही लिम्फ नोड्स का अवलोकन।

पशु विवरण पांडुलिपि में स्थान उम्र लिंग स्वास्थ्य की स्थिति
वीडियो बायसी बायस न वीडियो में बायसन-लिम्फ नोड वसूली 5-6 यो महिला स्वस्थ
वीडियो Bos वृषभ वीडियो में गोजातीय-लिम्फ नोड वसूली 7-8 यो Castrated नर स्वस्थ
आरएनए स्थिरता अध्ययन के लिए बायसी बायस न चित्र 5 ए-सी 5-6 यो महिला स्वस्थ
Bos वृषभ आरएनए स्थिरता अध्ययन के लिए एक अंजीर. 5C, अंजीर. 6A 7-8 यो Castrated नर स्वस्थ
Bos वृषभ आरएनए स्थिरता अध्ययन के लिए बी अंजीर. 5C 7-8 यो Castrated नर स्वस्थ
FFPE गुणवत्ता अध्ययन के लिए Bos वृष तालिका 4, अंजीर. 4B ०.५ यो Castrated नर स्वस्थ (O157 से नियंत्रण: H7 संक्रमण अध्ययन)
ध्यान दें कि इस पद्धति के कई अतिरिक्त पशु, जंगली भैंसों पर इस्तेमाल किया गया है, और बकरी लिम्फ नोड नमूने, उन है कि यहां पर प्रकाश डाला जाता है परे ।
इसके अतिरिक्त, हम लिम्फ नोड पर एक ही पद्धति का इस्तेमाल एक १.५ मो.-बूढ़ी महिला बछड़ ा से एकत्र ।

तालिका 2. पायलट अध्ययन में प्रयुक्त जानवरों के लक्षण।

ऊतक प्रकार संरक्षण विधि होल्डिंग शर्तें क्षरण निष्कर्ष संदर्भ
गोजातीय वसा, कंकाल की मांसपेशी, जिगर स्नैप जमने (लिक्विड एन2) 4 ° c, वैक्यूम पैक ऊतक मांसपेशी आरएनए अधिक स्थिर (भंडारण के 8 दिनों के लिए बाहर भी); वसा और जिगर मुख्य रूप से स्थिर 24 घंटे के रूप में rRNA बैंड की उपस्थिति द्वारा मूल्यांकन बहार एट अल. (२००७)३२
मानव बृहदांत्र, कोलोरेक्टल कैंसर आरएनए संरक्षण समाधान कमरे में अस्थाई । 2 एच के लिए संरक्षित रिण, लेकिन जीन के सबसेट 0.5 से अभिव्यक्ति में परिवर्तन दिखाने-2 एच । Yamagishi एट अल. (२०१४)३३
माउस जिगर, तिल्ली आरएनए संरक्षण समाधान, या स्नैप ठंड (सूखी बर्फ का घोल) माउस लोथ के अंदर (३७ ° c) तिल्ली के नमूनों १.५ एच के लिए बाहर स्थिर थे; जिगर के नमूनों पहले गिरावट का प्रदर्शन (१०५ मिनट पर रिण में 24% कमी.) चोई एट अल. (२०१६)३४
माउस जिगर तुमचे (Homogenized फ्रेश इन guanidinium thiocyanate-phenol-क्लोरोफॉर्म) 25 ° c, ३७ ° c 25 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए बाहर सीमित गिरावट, लेकिन 4 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर व्यापक गिरावट (के रूप में रिण स्कोर का उपयोग कर मनाया) । Almeida एट अल. (२००४)३५
ह्यूमन लघ्वान्त्र आरएनए संरक्षण समाधान, या स्नैप ठंड 4 ° c, ३७ ° c आम तौर पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर १.५ ज. में स्थिर; 4 डिग्री सेल्सियस से कम 6 घंटे के लिए बाहर स्थिर (के रूप में रिण स्कोर का उपयोग कर मनाया) ।  ध्यान दें कि लेखकों को भी तालिका एस में चयनित आरएनए स्थिरता संसाधनों का एक सारांश प्रदान करते है कि ऊतक आरएनए अखंडता साहित्य की आगे की समीक्षा में रुचि रखने वालों के लिए एक अतिरिक्त संदर्भ के रूप में सेवा कर सकते हैं । ली एट अल. (२०१५)३६
मानव जिगर स्नैप जमने (लिक्विड एन2 या isopentane) कमरे में अस्थाई । गिरावट 1 घंटे में मनाया (०.८५ ΔRIN तक); बड़े नमूनों की तुलना में जिगर के छोटे नमूनों में अधिक गिरावट. Kap एट अल. (२०१५)३७
मानव कोलोरेक्टल कैंसर स्नैप जमने (liquid N2/isopentane) 4 ° c ह्रास 1 ज.; ९० मिनट के बाद केवल ४.२ का रिण स्कोर समय ठंड में देरी का हांग एट अल. (२०१०)३८
मानव जिगर आरएनए संरक्षण समाधान भी फ्लैश ठंड (तरल एन2) कक्ष temp, 4 ° c नमूने भी स्थिर थे बाहर बर्फ पर 1 डी के लिए; गिरावट कमरे में अस्थायी 1 डी. के बाद मनाया । (लेकिन नहीं के बाद 3 ज.; के रूप में मनाया रिण स्कोर का उपयोग) ली एट अल. (२०१३)३९
घोड़ा वसा, कंकाल की मांसपेशी स्नैप जमने (लिक्विड एन2) 13 डिग्री सेल्सियस लेखक की सिफारिश है कि मांसपेशियों के लिए सबसे अच्छा अखंडता 2 घंटे के भीतर था; ०.५ एच के भीतर वसा संरक्षण (rRNA जेल उपस्थिति द्वारा मनाया के रूप में) लेखकों द्वारा अनुशंसित मॉरिसन एट अल. (२०१४)४०
सामन मस्तिष्क, गुर्दे, जिगर, मांसपेशी आरएनए संरक्षण समाधान कमरे में अस्थाई । मस्तिष्क आरएनए स्थिर करने के लिए 4-8 एच., गुर्दे और मांसपेशी exhbiit कुछ क्षरण द्वारा 8 h. (जेल, रिण स्कोर दोनों का इस्तेमाल किया) सीईआे व Sweeney (२००८)४१
खरगोश संयोजी ऊतक (बंधन, पट्टा, उपास्थि) स्नैप जमने (लिक्विड एन2) 4 ° c, कमरे में अस्थायी । नहीं "प्रकट" गिरावट बाहर ९६ h. गुजाइश, के रूप में rRNA जेल उपस्थिति द्वारा मनाया Marchuk एट अल. (१९९८)४२
चूहा मस्तिष्क, फेफड़े, दिल, जिगर निकाली हुई दिखती है ताजा अंदर चूहे लोथ 20 डिग्री सेल्सियस में आयोजित की मशीन उच्चतम आरएनए स्थिरता मस्तिष्क में मनाया (7 दिन गुजाइश करने के लिए बाहर rRNA बैंड का पालन कर सकता है, हालांकि गिरावट मौजूद था), फेफड़े और दिल में उदारवादी स्थिरता, जिगर में कम स्थिरता; के रूप में rRNA जेल उपस्थिति द्वारा मनाया Inoue एट अल. (२००२)४३
मानव tonsil, बृहदांत्र साथ और आरएनए संरक्षण समाधान के बिना, तो स्नैप-जमे हुए कमरे में अस्थाई । (22 डिग्री सेल्सियस), 4 ° c आरएनए संरक्षण समाधान, ठंडा खारा, या बर्फ (0 डिग्री सेल्सियस) बर्फ पर या आरएनए संरक्षण समाधान में 16 एच. के लिए स्थिर; थोड़ी सी गिरावट पर 6 या 16 ज. ठंड खारा में या RT पर (रिण स्कोर से मापा) मिक एट अल. (२००६)४४

तालिका 3. पोस्टमार्टम ऊतक के नमूनों में आरएनए स्थिरता पर पिछले निष्कर्षों का नमूना। प्रविष्टियों murine, मानव बायोप्सी, और पशु चिकित्सा उदाहरणों सहित प्रतिनिधित्व किया है, ऊतक प्रकार की एक सीमा के साथ, आरएनए स्थिरता पर साहित्य से चयनित पांडुलिपियों का प्रतिनिधित्व करते हैं । संरक्षण के लिए तरीके, भंडारण पूर्व निष्कर्षण के मोड, और परिणाम का एक संक्षिप्त सारांश प्रत्येक उदाहरण के लिए प्रदान की जाती हैं । अंयथा संकेत दिया जब तक, नमूनों बर्फ से ३७ डिग्री सेल्सियस से लेकर शर्तों पर संग्रहीत किया गया, स्नैप ठंड के बाद या आरएनए संरक्षण समाधान के साथ एक अर्क, बाद के समय पाठ्यक्रम (दूसरे शब्दों में, स्थिरता एक आरएनए की उपस्थिति में मापा नहीं जा रहा था संरक्षण समाधान के दौरान, जब तक संकेत) ।

नमूना आईडी 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
a२६०/२८० १.९६ १.९८ १.९८ १.९१ १.९८ १.८९ १.८९ १.९१ १.९ १.८४ १.८४ १.९७
a२६०/२३० ०.६७ ०.१४ ०.१९ ०.२६ ०.६१ ०.६९ १.३३ ०.११ ०.२१ ०.३९ ०.१ ०.४४
Rin  १.६ १.१ १.३ १.२ 1 १.३ 2 १.१ १.२ 1 1 1

तालिका 4. आरएनए से प्रतिनिधि परिणाम गोजातीय FFPE mesenteric लिम्फ नोड्स से पृथक। तालिका इस पांडुलिपि में वर्णित विधि का उपयोग संसाधित FFPE गोजातीय लिम्फ नोड नमूनों की एक श्रृंखला से स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक और गुणवत्ता विश्लेषण से परिणामों को दर्शाया गया है । प्रत्येक मामले में, परिणाम उच्च आरएनए नीचा दिखा ।

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Discussion

transcriptomic अध्ययन के बहुमत और संबद्ध प्रोटोकॉल माउस, चूहा, या पोस्टमार्टम मानव नमूने पर ध्यान केंद्रित । हालांकि, पशुधन और वंय जीवन में जांच रोग के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लक्षण वर्णन के लिए अवसरों की एक विस्तृत श्रृंखला उपलब्ध कराने, दोनों के रूप में पशु चिकित्सा के लिए लागू है और, पशुजन्य रोगों के संबंध में, मानव जन स्वास्थ्य के लिए । इस प्रोटोकॉल इस तरह के पशु, जंगली भैंसों, बकरियों, और भेड़ के रूप में बड़े पशुओं, से ऊतकों से उच्च अखंडता आरएनए निष्कर्षण के लिए महत्वपूर्ण बातों की एक रूपरेखा प्रदान की । जानवरों के आकार, साथ ही नमूना संग्रह के लिए शर्तों, वसूली एक और अधिक व्यापक प्रक्रिया करने के लिए, माउस लिम्फ नोड वसूली के लिए की तुलना में अब पोस्टमार्टम प्रसंस्करण समय के साथ । इसी तरह, इन लिम्फ नोड्स के बड़े आकार आवश्यक प्रोटोकॉल है कि विभिन्न जानवरों से समानांतर नमूने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नमूने है कि प्रतिरक्षा/लिम्फ नोड के भीतर रोग परिवर्तन के प्रतिनिधि हैं. इस प्रोटोकॉल में नमूना संग्रह के लिए सुझाव बरकरार आरएनए के साथ ही लिम्फ नोड की धारा के आधार पर प्रतिनिधि प्रोफाइल के लिए वसूली के लिए प्रदान करते हैं ।

एक मानकीकृत नमूना रणनीति और प्रोटोकॉल के महत्व के एक प्रदर्शन के रूप में, के रूप में यहां प्रस्तुत, हम PubMed केंद्रीय डेटाबेस है कि पशुधन लिम्फ नोड्स के transcriptomes विशेषता से 25 कागजात का सर्वेक्षण किया । एक कागज एक समय में एक बड़ी लिम्फ नोड अनुभाग के प्रसंस्करण संकेत दिया, एक विशिष्ट लेजर पर कब्जा microdissection तरीकों पर चर्चा की, एक उल्लेख किया है कि एक "प्रतिनिधि नमूना" लिम्फ नोड से एकत्र किया गया था, और केवल एक कागज४६ संकेत कि लिम्फ नोड का टुकड़ा (आकार में 10 मिमी3 ) एकत्र) दोनों प्रांतस्था और मज्जा क्षेत्रों में शामिल थे । जबकि अंय कागजात नोट किया है कि छोटे नमूने (आम तौर पर 30-100 मिलीग्राम) आरएनए विश्लेषण के लिए संसाधित किए गए, कागज के ८४% इन ऊतक टुकड़े के संग्रह के लिए एक नमूना रणनीति का उल्लेख नहीं था । आरएनए-अनुक्रमण के रूप में अभी भी अपेक्षाकृत महंगा है, लिम्फ नोड प्रति कई वर्गों के विश्लेषण के अधिकांश मामलों में आर्थिक रूप से व्यवहार्य होने की संभावना नहीं है, खासकर के बाद से जैविक दोहराने नमूने आम तौर पर सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए प्राथमिकता है । एक sagittally खोदी लिम्फ नोड के एक कील भर में एक नमूना इकट्ठा करके, आरएनए लिम्फ नोड क्षेत्रों से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न प्रकारों में अमीर सभी नमूनों में कब्जा कर लिया है । इस प्रोटोकॉल, इसलिए, लिम्फ नोड transcriptomics के लिए एक दस्तावेज और reproducible नमूना रणनीति के लिए एक संदर्भ के रूप में सेवा कर सकते हैं ।

ऊतकों से आरएनए की तैयारी में, प्रक्रियात्मक निर्णय लेने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम हैं । सबसे पहले, methodological साहित्य संरक्षण समाधान के उपयोग के मामले में मिश्रित है फ्लैश-जमे हुए ऊतक नमूनों के उपयोग बनाम (और बाद में ठंड तापमान पीस) । विशेष रूप से बड़े पशु necropsies के मामले में, वहां एक संरक्षण समाधान के उपयोग के लिए कई संभावित प्रक्रियात्मक लाभ, के रूप में इस प्रोटोकॉल में शामिल कर रहे हैं । सबसे पहले, ऊतक के नमूनों को तुरंत तरल नाइट्रोजन के लिए ट्यूबों के हस्तांतरण की आवश्यकता के बिना संरक्षण समाधान में necropsy के दौरान संग्रहीत किया जा सकता है । दूसरा, एक संरक्षण समाधान के उपयोग के लिए आरएनए निष्कर्षण के लिए नमूना प्रसंस्करण से पहले अतिरिक्त सुरक्षा प्रदान करता है, विशेष रूप से यदि नमूना आंशिक रूप से या संक्षेप में homogenization से पहले गल. चित्रा 6A में परिणाम संकेत मिलता है कि इस सुरक्षात्मक प्रभाव लिम्फ नोड ऊतक तक फैली हुई है । इसके विपरीत, फ्लैश जमी नमूनों जमे हुए राज्य में एक phenol-बफर युक्त में homogenization के क्षण तक बनाए रखा जाना चाहिए । अंत में, बड़े जानवरों के क्षेत्र necropsies के लिए, जहां तरल नाइट्रोजन आसानी से उपलब्ध नहीं है, नमूनों को संरक्षण समाधान में संग्रहित किया जा सकता है जब तक कि वे प्रयोगशाला को लौटाया जा सकता है ।

यहां प्रस्तुत प्रक्रिया के आणविक घटकों के अतिरिक्त लाभ प्रारंभिक ऊतक प्रसंस्करण, जो से नमूने के लिए homogenization के एयरोसोल पैदा करने की प्रक्रिया के दौरान एक विसंक्रमित के रूप में कार्य करता है के दौरान phenol की उपस्थिति शामिल संक्रमित पशुओं, और स्पिन कॉलम प्रक्रिया के उपयोग के नमूने से अवशिष्ट phenol और guanidine isothiocyanate को दूर करने के लिए । प्रतिनिधि परिणाम प्रदर्शित करता है कि प्रक्रिया के रूप में एक२६०२८० और एक२६०/२३० अनुपात, जेल ट्रो, और रिण स्कोर द्वारा मूल्यांकन उच्च गुणवत्ता आरएनए उत्पंन करता है, और समय पाठ्यक्रम चुनौतियों का सामना में मजबूत है पशुधन और वंय जीवन का नमूना । ऊतक संरक्षण के बाँधना (जैसे, RNALater में), homogenization में phenol-आधारित रिएजेंट (जैसे, TRIzol), और सिलिका स्तंभ शुद्धिकरण सफलतापूर्वक ovine में प्रोफ़ाइल जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के लिए साहित्य में उपयोग किया गया है abomasal लिम्फ नोड्स जठरांत्र सूत्रकृमि के साथ संक्रमित४६ और पशु लिम्फ नोड्स में एक herpesvirus४७के साथ संक्रमित, 8 से अधिक और सभी नमूनों भर में 7 से अधिक बड़ा स्कोर के साथ, क्रमशः ।

बहाव विश्लेषण के लिए अस्वीकार्य रिण स्कोर के साथ एक परिणामी आरएनए के मामले में, आरएनए प्रोसेसिंग के लिए मानक हैं, जो निम्नलिखित चर, मूल्यांकन किया जाना चाहिए: कुल प्रसंस्करण समय पोस्टमार्टम, ऊतकों की हालत, प्रसंस्करण समय देरी/ बाद गल, आरएनए निष्कर्षण के दौरान तकनीक, और आरएनए हैंडलिंग के बाद निष्कर्षण । कुल प्रसंस्करण समय पोस्टमार्टम का मूल्यांकन किया जाना चाहिए विशेष रूप से जानवरों से मृत पाए गए पशुओं से बरामद ऊतकों के मामले में, euthanized जानवरों के विरोध के रूप में । के रूप में ऊपर वर्णित है, आरएनए लिम्फ नोड्स में अपेक्षाकृत स्थिर है, लेकिन प्रसंस्करण में लंबे समय देरी अस्थिर टेप के लिए विशेष रूप से गिरावट के लिए नेतृत्व कर सकता है । यदि नमूने समय की असमान मात्रा के लिए क्षेत्र में बने हुए हैं कि शवों के बीच तुलना कर रहे हैं एक को प्राप्त समय चर उपस्थित हो सकता है. ऊतकों की स्थिति का आकलन किया जाना चाहिए, क्योंकि ऊतक अखंडता के क्षरण, संक्रमण के साथ जुड़े रोग परिवर्तन के कारण, आरएनए स्थिरता को कम कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, निचली आरएनए गुणवत्ता placentome में ब्रूसेला-संक्रमित पशुओं के बाद गर्भपात (Boggiatto एट अल., सबमिट किया गया) में देखा गया है । इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में प्रसंस्करण समय/देरी पोस्ट-गल संरक्षण समाधान के उपयोग द्वारा कम है । कुछ है कि ऊतक टुकड़े की मोटाई काफी कम है ऊतक में परिरक्षक समाधान के एक उचित और तेजी से प्रवेश की अनुमति देने के लिए (< 5 mm मोटाई सामग्री की तालिकामें उल्लेख किया परिरक्षक का उपयोग कर) । आरएनए निष्कर्षण के दौरान, बफ़र्स RNase-मुक्त होना चाहिए और दस्ताने और अन्य दूषित वस्तुओं के साथ संपर्क (RNases त्वचा पर मौजूद हैं) से बचना चाहिए. लिम्फ नोड ऊतक के पीसने के लिए, संभावित RNases का सबसे बड़ा स्रोत ऊतक में ही होगा, लेकिन यह प्रक्रिया के सभी चरणों में दूषित पदार्थों की शुरूआत को कम करने के लिए फायदेमंद है । को शाही सेना के बाद निष्कर्षण को संभालने, प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में, aliquot ठंड और भंडारण से पहले ट्यूब में आरएनए नमूने-८० डिग्री सेल्सियस, फ्रीज-गल एक गुणवत्ता और मात्रा विश्लेषण के लिए नमूनों की जरूरत को खत्म करने के लिए ।

प्रक्रिया में कम पैदावार, आरएनए के नमूनों की गिरावट से उत्पन्न होने के अलावा, प्रोटोकॉल में कदम ४.३ पर लिम्फ नोड ऊतक के एक अक्षम homogenization के कारण हो सकता है । ध्यान दें कि एक आरएनए संरक्षण समाधान में गर्मी ऊतक की बनावट को बदल सकते हैं (मजबूती में वृद्धि), हालांकि सबसे लिम्फ नोड ऊतकों असंबद्ध प्रभावी रूप से पायलट में बड़े दांतेदार रोटर के साथ चलाता है-stater dissociator यहां वर्णित है । चरण 4.3.1 में नोट किया गया है, तो पृथक्करण अपूर्ण है, तो phenol-आधारित एजेंट में homogenization दोहराया जाना चाहिए । मोर्टार और मूसल पीस, एक phenol में जमीन के नमूने के एक resuspension-आधारित रिएजेंट के बाद, इन विनिर्देशों के साथ एक homogenizer के लिए उपयोग के बिना प्रयोगशालाओं के लिए एक और विकल्प है । हालांकि, डिस्पोजेबल ट्यूबों में एक homogenization एक मोर्टार और मूसल में जमे हुए ऊतक के पीसने पर एकाधिक संभावित लाभ प्रस्तुत करता है, एकाधिक नमूनों प्रसंस्करण के लिए एक अधिक व्यवहार्य और छोटे कार्यप्रवाह सहित, नमूना नुकसान की अनुपस्थिति जब पीसने , कोई सफाई, और संचालित नमूनों के साथ कोई संभावित संपर्क, संक्रमित पशुओं से ऊतकों के मामले में.

Avraham एट अल. ४८ का वर्णन करें कि अंतिम आरएनए उत्पाद में एक बड़ी 5 एस आरएनए चोटी, 28S और 18S राइबोसोमल RNAs की एक कम वसूली के साथ जोड़ा, कोशिकाओं की एक अपूर्ण lysis का संकेत हो सकता है (जो बारी में, लिम्फ नोड प्रसंस्करण के लिए, पृथक्करण के एक अधूरा tiss के कारण हो सकता है यत) । चित्रा घमण्ड एक आरएनए कर्णमूल लिम्फ नोड है कि संयोजी ऊतक में बहुत अधिक था और प्रभावी ढंग से homogenize नहीं था के एक टुकड़े से उत्पन्न एक शाही सेना के प्रोफ़ाइल का एक उदाहरण प्रदान करता है । आरएनए पैदावार की गणना की जानी चाहिए और विश्लेषण के लिए एक सेट में नमूनों पर नजर रखी है कि समान वसूली ऊतक के प्रति मिलीग्राम प्राप्त कर रहे हैं की पुष्टि करने के लिए, और आरएनए-sequencing द्वारा प्रत्यक्ष तुलना के लिए नमूने एक ही homogenization का उपयोग कर बैच में संसाधित किया जाना चाहिए सभी नमूनों के लिए रणनीति । ध्यान दें कि कील नमूना दृष्टिकोण भी एक नमूना है कि विशेष रूप से व्यापक संयोजी ऊतक के एक क्षेत्र है का एक संग्रह से बचने में एड्स ।

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Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है. सभी अनुसंधान अमेरिका के कृषि विभाग, कृषि अनुसंधान सेवा से अंदर धन के साथ वित्त पोषित है । विशिष्ट उत्पादों के सभी संदर्भों प्रयोगात्मक reproducibility के प्रयोजन के लिए प्रदान की जाती है और संघीय सरकार द्वारा इन उत्पादों के किसी भी समर्थन का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

लेखक सभी वीडियोग्राफी और वीडियो प्रसंस्करण पर अपने उत्कृष्ट काम के लिए जेंस फॉस शुक्रिया अदा करना चाहते हैं; माइकल डिजीटल पशु छवियों की पीढ़ी में अपने उत्कृष्ट काम के लिए मारति; आरएनए निष्कर्षण और विश्लेषक रन के साथ उसकी मदद के लिए लिलिया वाल्थर; मिच पामर और Carly Kanipe उनके उपयोगी समीक्षा और लिम्फ नोड छवियों पर प्रतिक्रिया के लिए; और पशु देखभाल और उनकी कड़ी मेहनत और पशुपालन और necropsies के लिए तैयार करने के साथ सहायता के सभी के लिए राष्ट्रीय पशु रोग केंद्र में पशु चिकित्सा स्टाफ ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments) ThermoFisher AM7020
1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes  Fisher Scientific 05-408-129
Disposable scalpels Daigger Scientific EF7281
Tissue forceps, rat tooth Fisher Scientific 12-460-117 Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference
3 mm punch biopsy needles Fisher Scientific NC9949469
Sharps container (small and transportable for necropsy) Stericycle 8900SA 1 qt. size shown here
Cutting boards or disposable trays Fisher Scientific 09-002-24A Available in a variety of sizes, depends on user preference
Personal protective equipment Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)
Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments) ThermoFisher 15596026
Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments) ThermoFisher 12183018A Designed for up to 100 mg tissue
100% Ethanol (200 proof for molecular biology) Sigma-Aldrich E7023
Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments) Miltenyi Biotec 130-093-235
Agarose (General, for gel electrophoresis) Sigma-Aldrich A9539
1X TBE Fisher Scientific BP24301 Can also make from scratch in the laboratory
Deionized formamide EMD Millipore S4117
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Bromophenol blue Sigma-Aldrich 114391
Xylene cyanol  Sigma-Aldrich X4126
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-Aldrich EDS
UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer) ThermoFisher ND-2000
Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols) Agilent G2939BA
FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue) ThermoFisher AM1975
Plastic spreader (L-shaped spreader) Fisher Scientific 14-665-231 Only needed for sterility testing for samples from infected animals
Necropsy knives Livestock Concepts WI-0009209

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Vrentas, C. E., Boggiatto, P. M., Schaut, R. G., Olsen, S. C. Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species. J. Vis. Exp. (135), e57195, doi:10.3791/57195 (2018).

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