Summary
Detta protokoll ger en översikt över förfarandena för isolering av RNA för transcriptomic profilering av lymfkörtel vävnader från stora djur, inklusive steg i identifiering och excision av lymfkörtlar från boskap och vilda djur, provtagning metoder att tillhandahålla konsekvens över flera djur, och överväganden plus representativa resultat för efter samling bevarande och bearbetning för RNA analys.
Abstract
Stora djur (både boskap och vilda djur) fungera som viktiga reservoarer av zoonotiska patogener, inklusive Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonellaoch e.coli, och är användbara för att studera patogenes och/eller spridningen av bakterier i naturliga värdar. Med viktiga funktionen av lymfkörtlar i värd immunsvaret fungera lymfkörtel vävnader som en potentiell källa till RNA för nedströms transcriptomic analyser, för att bedöma de tidsmässiga förändringarna i genuttryck i celler under loppet av en infektion. I denna artikel presenteras en översikt över processen för lymfkörtel insamling, vävnad provtagning och nedströms RNA bearbetning i boskap, med nötkreatur (Bos taurus) som förebild, med ytterligare exempel från den amerikanska bison (Bison bison ). Protokollet innehåller information om plats, identifiering och avlägsnande av lymfkörtlar från flera viktiga platser i kroppen. Dessutom presenteras en biopsi provtagning-metodik som möjliggör en konsistens av provtagning över flera djur. Flera överväganden för provet bevarande diskuteras, med framtagning av RNA passar nedströms metoder som RNA-sekvensering och RT-PCR. På grund av de långa förseningarna inneboende i stora djur vs mus tid kursen studier presenteras representativa resultat från bison och bovin lymfkörtel vävnader för att beskriva tidsförloppet för nedbrytning i denna vävnadstyp, inom ramen för en översyn av tidigare metodarbete på RNA nedbrytning i andra vävnader. Sammantaget kommer detta protokoll vara användbart till både veterinärmedicinska forskare börjar transkriptom projekt på stora djur prover och molekylärbiologer som är intresserade av att lära sig tekniker för i vivo vävnad provtagning och in vitro- bearbetning.
Introduction
RNA-sekvensering analys av transkriptom lymfkörtlar ger möjlighet att karakterisera immunsvaret hos djur till en mängd olika patogener. Medan denna metod har använts flitigt i möss, har analyser nyligen expanderat in i större däggdjur1,2. Boskap/stora djur lymfkörtlar kan användas för att karaktärisera värd Svaren till en infektion, inte bara för deras användning i vaccin eller genetisk känslighet studier och identifiering av mål för läkemedelsutveckling, men också som modellsystem för studier på människa på zoonotiska sjukdomar. Till exempel i fråga om brucellos (en zoonotiska bakteriell sjukdom som konsekvenser en halv miljon människor runt om i världen varje år), trots kraftigt ökade kostnader, studier hos får eller getter är mer relevanta för mänskliga infektion och vaccin mot humant utveckling än laboratoriet djurmodeller. Infektion musmodeller recapitulate retikuloendoteliala systemet infektionen men inte de karakteristiska kliniska tecken3.
I stora djurförsök jämfört med laboratorium djurstudier omfattar processen för vävnad skörd nödvändigtvis en längre fördröjning mellan dödshjälpen och vävnad samlingen, som en potentiell utmaning för bevarandet av hög kvalitet RNA. Intakt RNA är viktigt för generering av biologiskt relevanta transcriptomic data. Generering av hög kvalitet RNA från vävnadsprover är särskilt kritiskt för stora djur patogen studier utfördes i inneslutning faciliteter. Sådana studier är till sin natur mer svårt att genomföra eftersom de inte bara kräver godkänd faciliteter och högt utbildad personal men utför också betydande finansiella kostnader, som, beroende på arbetet, kan variera från tiotals till hundratals tusen dollar. Dessa typer av studier också innebära en tvärvetenskaplig samverkan och tvärvetenskapliga kunskap för deras slutförande, lägga till deras komplexitet. Därför, utbildning, utveckling av och adherencen till ett förenklat system för provtagning och bevarande ger betydande fördelar för nedströms molekylära studier av vävnader från smittade djur.
Insamling av större lymfkörtlar presenterar ytterligare utmaningar för samlingen vävnad jämfört med liknande provtagning av murina lymfkörtlar. Förberedelserna för det provet excision nödvändiggör en grundläggande förståelse av anatomin i lymfkörteln, inklusive de relevanta interna strukturerna. En lymfkörtel struktur består av lymfoida lobules omgiven av bihålor fyllda med lymfan. Dessa strukturer är innesluten i en tuff, fibrösa kapsel. 4 en lymfoida lobule är ”grundläggande anatomiska och funktionella enhet lymfkörtel” och består av folliklar, en djupt kortikala enhet, och medullär sladdar och bihålorna4 (figur 1A). T och B-lymfocyter är hem till hårsäckarna och djupt kortikala enheter, respektive. Dessa strukturer ger en 3D klätterställning och underlätta interaktionen mellan lymfocyter och antigen eller antigenpresenterande celler.
Grovt, folliklar och djupt kortikala enheter kan identifieras på snittytan som de innehåller en tätare retikulära meshwork och blir mörkare än bihålorna, som består av en mer delikat retikulära meshwork och ljusare (figur 1B). Konventionen hänvisa patologer till regioner i lymfkörtlarna som ytliga cortex (folliklar), paracortex (djupt kortikala enheter) och medulla (medullär sladdar och bihålorna). En ordentlig undersökning av alla tre regionerna har bedömts som bästa praxis i patologiska rutinundersökning riktlinjer för lymfkörtlar5. Observera att det finns en betydande variation i konsistens, storlek och färg av lymfkörtlar, även inom ett enda djur. Som djur ålder, deras lymfkörtlar tenderar att minska i storlek och blir fastare än hos yngre djur, vanligtvis på grund av en ökning av deras bindväv och en minskning av normalt lymfoida struktur6,7.
Figur 1. Anatomi av lymfkörteln. (A) den här tecknade bilden visar anatomin av lymfkörteln, som skildrar viktiga strukturer. (B) denna fortfarande bild visar en nötkreatur lymfkörtel som skär i tvärsnitt. De relevanta strukturer/lager som är synliga för blotta ögat markeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Beroende på den experimentella frågan, kommer att olika lymfkörtlar vara av intresse för insamling och analys. Perifera lymfkörtlar är de som ligger djupt i den subkutana vävnaden. Hos nötkreatur, perifer eller ytliga lymfkörtlar som ofta används i klinisk och experimentell praktiken inkluderar parotis, submandibular, retrofaryngeal, lymfknutor, prefemorala (precrural) och ytliga ljumsk (juvret hos kvinnor, testikelcancer hos hanar) () (Se figur 2). I tabell 1beskrivs egenskaperna för nyckel ytliga lymfkörtlar, som beskrivs i den boskap system8. Nedan presenteras några potentiella lymfkörtel samling planer för bakteriella infektionssjukdomar av nötkreatur som utgångspunkt för utredningen.
Brucella abortus/Brucella melitensis: Standard necropsies för B. abortus-smittade nötkreatur och B. melitensis-infekterade getter vid National Animal sjukdom Center återställa juvret, prescapular och parotis lymfkörteln vävnad , både för malning för bakteriell uppräkningen och för RNA beredning för värd RNA uttryck profilering. B. abortus kan återvinnas regelbundet i varje av dessa lymfkörtlar i experimentellt infekterade nötkreatur9. Förekomsten av bakterier i varje av dessa lymfkörtel typer kan upptäckas i B. melitensis-infekterade getter upp till minst nio månader efter infektion med RNA-baserade metoderna från våra studier (Boggiatto et al., opublicerad). Salmonella sp.: prescapular, subiliac (prefemorala), och mesenteriala lymfkörtlar har varit användbart under profilering av slaktkroppar av nötkreatur för en Salmonella prevalensen10,11,12 och skulle vara potentiellt intresse för transcriptomic studier. E. coli O157: H7: mesenteriala lymfkörtlar (vid mellersta tunntarmen och distala tunntarmen platser) kan vara en tillfällig återhämtning av bakterier i infekterade kalvar (men inte i infekterade vuxna nötkreatur)13webbplatser. Leptospiros (Leptospira sp.): en kronisk persistens av bakterier har observerats i lymfkörtlarna dränering bröstkörteln14. Mycobacterium bovis : Hos nötkreatur varit bakterierna återställda efter experimentell infektion från lymfkörtlarna mediastinum och tracheobronchial kalvar15. Dessutom har lymfkörtel RNA använts för att undersöka stora djurens värd Svaren till virus, till exempel de svin porcine respiratory syndrome virus2. Figur 2 visar platsen för en delmängd av dessa stora lymfkörtlar i nötkreatur kroppen.
Figur 2: Tecknad som skildrar valda lymfkörtel platser i Bos taurus . Numrerade lymfkörtlarna är kommenterad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
I detta papper och tillhörande videon presenterar vi ett protokoll för isolering av stora djur lymfkörtlar för RNA studier, utformad för att vara informativa för molekylärbiologer inblandade i transcriptomic studier av stora djur infektioner. Först, vi ger en översikt över förfarandet isolering för lymfkörtlarna, med provtagning från nötkreatur och bison vävnader som exempel. Parat med denna demonstration, som visas i videon, är ett arbetsflöde för en reproducerbar vävnad provtagning för RNA isolering. Därefter beskriver vi viktiga överväganden för bearbetning av en infekterad lymfkörteln, med fokus på säkerhet, konsekvens och RNA kvalitet.
Beredning av RNA från vävnaden med en surgjord fenol-guanidin isotiocyanat reagens är baserad på den ursprungliga metoden Chomczynski och Sacchi16,17, med en rening över kiselbaserade spin kolumner i närvaro av chaotropic agenter baserat på det ursprungliga arbetet Vogelstein och Gillespie18. Vi också undersöka potentialen för återvinning av RNA för transkriptomik från nötkreatur lymfkörtlar konserverade med alternativa metoder. Slutligen, vi utforskar effekten av variabeln tid på RNA kvaliteten i stora djur necropsies, inklusive ett representativt experiment som skildrar effekten av en ökning av tid mellan dödshjälpen och provtagning på återvunna RNA profil från bison och bovin lymfkörtlar. Denna artikel kommer att vara användbart inte bara molekylärbiologer utan också till veterinärmedicinska forskare påbörjas transcriptomic studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De animaliska obduktion förfaranden skildras här omfattas av godkända IACUC protokoll vid National Animal sjukdom Center, Ames, IA. Alla experiment genomfördes i enlighet med de godkända riktlinjerna för djurens vård och välfärd.
1. Planering innan obduktion
- Innan en obduktion, förbereda följande material för transport till obduktion suite:
- 1,5 eller 2 mL mikrocentrifugrör fyllda med ~ 1,0 mL RNA bevarande lösning, i en rack eller transport behållare. Var noga med att följa tillverkarens riktlinjer för förhållandet mellan volymen av bevarande lösningen till volymen av vävnaden.
- Disponibla skalpeller och ren, lättbetong och autoklaverad pincett: en uppsättning för dissekera huden och en annan uppsättning för insamling av lymfkörtlarna (en för varje lymfkörtel, per djur), vilket förhindrar en korskontaminering av hud och miljö flora med lymfkörtel vävnaderna.
- 3 stansar mm biopsi verktyg, obduktion knivar, en behållare för använda skalpeller och biopsi verktyg, och skärbrädor eller engångs brickor för användning i lymfkörtel dissektion.
- Använd personlig skyddsutrustning, inklusive PPE krävs för arbete på lämplig BSL nivå för systemet.
- Autoklav återanvändbara metall-verktyg, inklusive tången, i metall pans före den obduktion, använde de köksredskap/torr varor inställning.
2. identifiering och urval av lymfkörtlar hos nötkreatur och Bison
Figur 3 . Lymfkörtlar i nötkreaturets huvud och hals. (A) detta tecknad bild visar valda lymfkörtlar av huvud och hals av Bos taurus. (B) denna bild visar parotis lymfkörteln i tvärsnitt (vänster) jämfört med de Parotis spottkörteln i tvärsnitt (höger). Observera skillnaden i texturer mellan de två vävnadstyper. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
-
Isolering av lymfknutor lymfkörtlar hos nötkreatur och bison
- Avliva djuret (nötkreatur eller bison oavsett ålder, som är lämpligt för experimentet) baserat på protokollet för lokala IACUC. Bekräfta döden genom metoder som uttryckligen beskrivs i den institutionella IACUC protokoll, inklusive avsaknaden av ett hjärtslag, avsaknaden av andning och avsaknad av en hornhinnan reflex. Flytta djuret till obduktion golvet.
Obs: Det finns olika metoder för humana dödshjälp används i laboratoriet praktiken av stora djur. Intravenös administrering av pentobarbital natrium och fenytoin natriumlösning är dock mest allmänt godkänd och utnyttjas form. Konsultera AVMA riktlinjerna för avlivning av djur. 19
Varning: Följ alla relevanta biosäkerhet protokoll för en obduktion på värdinstitutionen, inklusive riktlinjer för säkert bortskaffande av vassa föremål i en punkteringssäker behållare och sanering av återanvändbara metall knivar och pincett. Detta protokoll genererar sharps avfall från användning av disponibel skalpeller. Använd personlig skyddsutrustning som dikteras av de institutionella riktlinjer, kängor, overaller, handskar och skyddsglasögon. - Identifiera 3 deltagare att arbeta på animaliska vävnader.
Obs: Här, DISSEKTOR 1 kommer att ansvarig för den storskaliga snittning av önskad animaliska vävnader, DISSEKTOR 2 kommer att återställa lymfkörtlarna från avsnitten för olika djur och DISSEKTOR 3 kommer att arbeta vid ett separat bord att isolera sektioner från varje lymfkörtel och överföra dem till rör med en konserverande lösning. - Börja med att placera djuret i laterala koordinationsrubbning.
- Förlänga axeln genom att flytta främre extremiteten tillbaka i nivå med knät (framknä); Denna rörelse kommer att återföra axeln och möjliggör en enklare palpation av lymfkörteln. Känner för förekomsten av lymfkörtel ”klump”.
Obs: Under sjukdomstillstånd, lymfadenopati kan förekomma, vilket underlättar identifiering av lymfkörtlar, men denna process kan också påverka konsistens, sammansättning, och arkitekturen av lymfkörteln. - När du ligger, med axeln fortfarande extended, använda en skalpell eller obduktion kniv för att göra en huden snitt längs konturen av axeln.
Obs: Inte begränsa storleken på snittet, även om lymfkörteln har varit ligger via palpation. En större incision ger enklare tillgång till djupare vävnader och underlättar excision av lymfkörteln för DISSEKTOR. - Använder ett par pincett, dra tillbaka huden för att avslöja punkten av skuldra och nacke muskulatur.
Obs: Lymfknutor lymfkörteln finns ofta i underhudsfett, särskilt i overconditioned djur. - Återigen, palpera placeringen av lymfkörteln (figur 3A).
Obs: Till skillnad från underhudsfett, lymfkörtel kommer att hålla sin form när palperas. Dessutom är lymfkörtlar inte sammanhängande med alla omgivande vävnader, som de omges av en tunn fibrösa kapsel. - Efter att lokalisera lymfknutor lymfkörteln, noggrant dissekera ut underhudsfett, använder en skalpell och pincett, och isolera lymfkörtel.
- Leta efter förekomsten av en tunna fibrös kapsel, som avbildas i figur 1B, för att skilja mellan lymfkörtel och fettvävnad; lymfkörtlar är inte sammanhängande med alla omgivande vävnad.
- Överföra lymfkörteln till tabellen lymfkörtel dissektion, med en plastbricka för vävnad överföring, för ytterligare snittning.
Obs: Utseendet på dessa lymfkörtlar i bison är liknande. Tillhörande videon skildrar uppkomsten av lymfknutor lymfkörtel som dissekeras av höger axel av en amerikansk bison.
- Avliva djuret (nötkreatur eller bison oavsett ålder, som är lämpligt för experimentet) baserat på protokollet för lokala IACUC. Bekräfta döden genom metoder som uttryckligen beskrivs i den institutionella IACUC protokoll, inklusive avsaknaden av ett hjärtslag, avsaknaden av andning och avsaknad av en hornhinnan reflex. Flytta djuret till obduktion golvet.
-
Isolering av parotis lymfkörtlar hos nötkreatur och bison
- Börja med att placera djuret i laterala koordinationsrubbning på golvet obduktion. Leta upp käkleden (TMJ).
- Om detta är svårt att lokalisera, flytta underkäken långsamt och fastställa platsen där underkäken fäster vid skallen; Detta är TMJ.
- Använda en skalpell eller obduktion kniv, noggrant gör ett snitt i huden. Börja snittet dorsala gemensamma och utvidga det ventralt/vertikalt längs käklinjen.
- Dissekera huden bort för att avslöja den subkutana vävnaden. De Parotis spottkörteln kommer att synas först, tack vare sin stora storlek, lobulated yta utseende och rödfärgning.
- Använda pincett och en skalpell, flytta den parotis spottkörteln åt sidan för att hitta parotis lymfkörteln sitter bara kranial och mediala till den saliv-körteln (figur 3A). Undersöka parotis lymfkörteln vävnad för konsistens innan vidare behandling.
Obs: lymfkörtlar i ansiktet (parotis och submandibular) är associerade med saliv-körtlar, vilket kan förvirra den lymfkörtel isoleringen. I jämförelse med lymfkörtlar, spottkörtlar är mycket större och har en lobulated yta utseende. Dessutom, snittytan, spottkörtlar är homogen i naturen och uppvisar inte de klassiska kortikala och medullär arkitektoniska mönstret i lymfkörtlar (figur 3B). - Punktskatt körteln med en skalpell. Överföra den till tabellen lymfkörtel dissektion, med en plastbricka för vävnad överföring, för ytterligare snittning.
- Börja med att placera djuret i laterala koordinationsrubbning på golvet obduktion. Leta upp käkleden (TMJ).
-
Isolering av juvret lymfkörtlar hos kvinnliga nötkreatur och bison
- Placera djuret i laterala koordinationsrubbning.
- Höja den bakben för att exponera inguinal regionen och lokalisera juver.
Obs: I en hälsosam, icke lakterande djur, palpation av dessa lymfkörtlar kan inte vara möjligt. I en digivande djur vara dessa lymfkörtlar påtaglig vid stjärtfenan gränsen till basen av juvret. - Med en skalpell, gör ett snitt precis dorsala juvret, kör längs övre benet, att exponera juvret körtlar.
- Dissekera den subkutana vävnaden och hitta juvret lymfkörteln inbäddad i ett tunt lager av underhudsfett. Om inte visuellt urskiljbara, palpera den exponerade vävnaden för förekomsten av en fast struktur i underhudsfettet.
- Använda pincett och en skalpell, noggrant dissekera ut lymfkörteln från fettet. Överföra den till tabellen lymfkörtel dissektion, med en plastbricka för vävnad överföring, för ytterligare snittning.
3. snittning och lagring av lymfkörtlar
- Passera isolerade lymfkörtlarna från DISSEKTOR 2 till dissector 3 på en dissektion tabell intill viktigaste obduktion utrymmet. Placera varje lymfkörtel på ett färskt avsnitt av en skärbräda. Före etikett skärbrädor i sektioner av lymfkörtel, att underlätta mottagandet av flera lymfkörtlar i följd. För infektiös prover, använda disponibla magasin.
- Använda pincett och en disponibel skalpell eller obduktion kniv, ta bort ett avsnitt av lymfkörteln. Använd en vass kniv, göra ett sagittalt snitt att öppna upp lymfkörteln.
- Undersöka insidan av lymfkörteln, särskilt i prover från smittade djur, letar du efter asymmetri, lesioner, färgskillnader, etc. registrera observationerna.
-
(Alternativ 1) Liten vävnadssnitt
- Använda disponibla skalpeller för att punktskatt bitar av varje lymfkörtel som är mindre än 5 mm i tjocklek och överföra varje bit till en tub med en RNA bevarande lösning med ren pincett.
-
(Alternativ 2) Lymph node biopsi eller snittning metoder
Obs: Biopsier eller snittning metoder, när de appliceras på parallella lymfkörtel sektioner över olika noder och djur, ge konsekvens av samplade vävnad för en bulk RNA analys.-
Kil snittning metod
- Efter att ha granskat avsnittet sagittal att fånga celler över profilen av lymfkörteln, punktskatt en paj-formad kil från lymfkörteln, från center till yttre kapseln. För en nod 2 cm i bredd (standard storlek, se tabell 1), skär en kil till centrum som är 4 mm i yttre båglängd och 5 mm i tjocklek kommer att ha en våt vikt på ~ 100 mg.
- Med en skalpell skär kilen i små bitar, inte tjockare än 5 mm, och ca 50-100 mg varje i våt vävnad vikt.
Obs: För konsekvens, behandla alla wedge bitar från en enda lymfkörtel antingen i en batch eller i separat rör följt av RNA pooling för att ge en representativ RNA profil från lymfkörteln sevärdheter. - Placera vävnad bitar med pincett in rören som innehåller minst 10 volymer av RNA bevarande lösning, jämfört med volymen av vävnaden.
-
Punch biopsi metod
- Välj ett verktyg med punch i biopsi om målet är att samla in specifika avsnitt, till exempel särskilda folliklar från noden. Välj ett verktyg som överensstämmer med storleken på provet önskas för samling. Punch biopsi verktyg finns tillgängliga i en mängd storlekar, från 1 till 8 mm i diameter.
- Visuellt lokalisera regionerna av intresse för prov i lymfkörteln.
- Använda verktyget punch biopsi för att punktskatt avsnitten av intresse, att trycka på och vrida verktyget i vävnaden att skapa kärnan. Överföra vävnad lappa med pincett till ett rör som innehåller minst 10 volymer av RNA bevarande lösning. Om tjockare än 5 mm, Använd pincett och en skalpell att ytterligare dela upp vävnaden i mindre bitar.
-
Kil snittning metod
- När proven har överförts till bevarande lösning (t.ex., RNALater), transportera dem tillbaka till laboratoriet vid rumstemperatur.
- Lagra proverna vid 4 ° C över natten för vävnad penetration.
- Nästa dag, häll bort överflödigt RNA konserverande lösningen och lagra vävnadsproverna vid-80 ° C. Ta bort så mycket konserveringsmedel som möjligt innan frysning proverna. Använd ett P1000 eller P200 mikropipett tips för en effektiv RNA konserverande lösning borttagning.
FÖRSIKTIGHET: Kassera upphälld bevarande lösningen på lämpligt sätt, på grundval av infektiös egenskaper av patogenen utnyttjas samt den kemiska och miljömässiga riskerna med konserverande lösningen som anges på säkerhetsdatabladet.
Obs: Riktlinjerna här tillhandahålls för den RNA bevarande lösning som beskrivs i Tabellen för material. Konsultera tillverkarens riktlinjer om använder alternativa bevarande lösningar.
4. behandling från RNA lymfkörtlar
FÖRSIKTIGHET: Använd en labbrock, handskar och korrekt ögonskydd för processtegen.
Obs: Fenol-baserade reagens används här beskrivs i Tabell av material (och protokollet är baserat på tillverkarens riktlinjer)20. Användningen av alternativa fenol-baserade reagenser kan kräva en ändring av förfarandet utifrån tillverkarens rekommendationer för den specifika produkten köpts.
- Innan åtkomst till proverna, före alikvot kylda (4 ° C) fenol-baserade reagensen homogenisering rör (1,5 mL/rör), med hjälp av en pipett.
Varning: Fenol är giftiga, frätande och en hälsofara. Kloroform är giftiga och hälsofarliga. Slutföra behandlingssteg 4.1-4.9 i dragskåp kemiska och bär handskar för att förhindra kontakt med kemikalier. I USA är kloroform ett farligt avfall. Kassera rör som innehåller farligt avfall enligt lokala och institutionella riktlinjer. Processen vävnadsprover från djur som smittats med patogener under den motsvarande BSL-2, BSL-3 eller BSL-4 riktlinjer. - När ett prov kan lossas från mikrocentrifugrör med ren pincett, omedelbart överföra cirka 50-100 mg av bevarade vävnad homogenisering röret som innehåller fenol-baserade reagensen.
- Begränsa upptining före tillägg till fenol-baserade reagensen. Använd lagring på torris när flera prover tas bort från frysen för bearbetning.
- Tätt tak röret, placera den på homogenisatorn, och Homogenisera provet med en rotor och stator vävnad Homogenisatorer i fenol-baserade reagensen. Slutföra behandlingen vid rumstemperatur. När kompletta kontrollera för ett molnigt utseendemässigt att säkerställa urvalet var framgångsrikt homogeniserad; vävnaden ska vara spridda i en grumlig suspension.
Obs: En 2 min RNA extraktion inställningen används (förinställda RNA_02_1 inställningen för homogenisatorn beskrivs i Tabell för material, avsedd för frysta vävnader). Rotor-stator anges i detta protokoll (se Tabell för material) är stora-tandad och anpassad för homogenisering av en rad vävnadstyper av, inklusive fibrösa material. Inställningen för RNA_02_01 är utformad speciellt för fryst (i motsats till färska) vävnader. Som lymfkörtlar har bindväv komponenter, rekommenderas en likaså optimerad rotor-stator Homogenisatorer att uppnå en effektiv dissociation. Se de nationella Institute of Environmental Health Sciences21 ytterligare information om homogenisering rekommendationer.- Om stora bitar av vävnad finns kvar efter homogenisering, upprepa förfarandet homogenisering. För att effektivt återställa RNA, måste vävnaden väl särskiljas.
- För mer fibrösa lymfkörtel bitar, Använd pincett och sax till pre hacka lymfkörtel lappa i flera mindre bitar före överföringen till homogenisering röret. Som beskrivits i inledningen, kan lymfkörtel vävnader från äldre djur vara mer fibrösa.
Obs: Om en dubbel analys av värd och patogen RNA önskas, ytterligare behandling (såsom pärla homogenisering) kan behövas för återvinning av bakteriell RNA, särskilt om grampositiva patogener är närvarande i vävnaderna.
- Omedelbart ta bort homogeniserade provet från rören och överföra det till RNase-fri mikrocentrifugrör (2,0 mL i storlek) med en P1000 mikropipett.
- Centrifugera provet för 5 min vid 12 000 x g vid 4 ° C för att ta provet skräp. Använder ett P1000 mikropipett tips, överför supernatanten till en färsk mikrocentrifug rör, efterlämnade pelleten.
- Inkubera supernatanten för 5 min i rumstemperatur. Dela varje prov mellan två 1,5 mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 0,2 mL kloroform per 1 mL fenol-baserade reagens (dvs, 0,3 mL för ett 1,5 mL prov); Invertera det för hand för 1-2 min att blanda faserna, men gör inte vortex provet. Inkubera det i 2 min i rumstemperatur.
- Centrifugera det i 15 min på 12 000 x g vid 4 ° C.
- Ta försiktigt bort den övre tydlig vattenhaltiga fasen med en mikropipett (P1000 eller P200) som ska utgöra det övre lagret, utan att störa interphasen eller röd fenol-kloroformskiktet. Överföra den till en ny mikrocentrifug rör.
- Blanda det med en lika stor volym av 100% etanol; Blanda noggrant genom att vända tuben 4 - 5 gånger. Röret visas ofta molnigt.
- Med en mikropipett spets, överför vätskan till en kiselbaserad kommersiella spin kolumn, att ytterligare rena och eluera RNA, efter tillverkarens instruktioner22. Eluera RNA genererade från ~ 50 mg av vävnad i 50-100 µl RNase-gratis vatten.
Obs: Medan fenol-baserade reagens extraktion tar bort DNA i den organiska fasen, för nedströms användning av RNA i qRT-PCR och/eller RNA-sekvensering applikationer, rekommenderas en ytterligare behandling av RNA-prover med DNAS. - Alikvot eluerade RNA till separata rör för användning i en kvantifiering och kvalitet bedömning, att minska någon frysa-upptining av det huvudsakliga RNA-provet. Överföra rören till-80 ° C för lagring.
- Vid lymfkörtel prover från djur smittade med zoonotiska patogener, särskilt på BSL-3 inneslutning nivå, validera det resulterande RNA-provet för avsaknad av patogener om provet kommer att flyttas till ett lägre biosäkerhet nivå kontrollområde för kvalitetsanalys, RT-PCR eller RNA-sekvensering bibliotek förberedelse.
Obs: Det är viktigt att beakta lokala föreskrifter och i fråga om CDC (Centers for Disease Control and Prevention) inaktivering riktlinjerna för arbetet med Välj ombud, är det nödvändigt att validera alla Inaktiveringsmetoder på forskarens lokal plats.- Ta bort 1/10th volymen av varje eluerade RNA-prov från steg 4.12 (dvs, 5 µl från 50 µl av den total-RNA). Med steril teknik, blanda provet med 100 µl av bakterietillväxt buljong i en steril 1,5 mL mikrocentrifug rör. Med hjälp av en steril plast spridare, sprida RNA-buljong blandningen över ytan på en agarplatta.
Obs: Välj en buljong typ och agar tallrik konsekvent med tillväxten av den patogen som djuren utmanades. - Inkubera agarplattan under specifika villkor för tillväxten av den patogen som djuren utmanades. Kontrollera om avsaknad av återvunna bakterier innan du tar bort proverna från BSL-3 reaktorinneslutningen.
Obs: Den resulterande eluerade RNA, efter kvantifiering och tester av integritet, är lämplig för nedströms tillämpningar, inklusive en RNA-sekvensering och RT-PCR-analys.
- Ta bort 1/10th volymen av varje eluerade RNA-prov från steg 4.12 (dvs, 5 µl från 50 µl av den total-RNA). Med steril teknik, blanda provet med 100 µl av bakterietillväxt buljong i en steril 1,5 mL mikrocentrifug rör. Med hjälp av en steril plast spridare, sprida RNA-buljong blandningen över ytan på en agarplatta.
- Bedöma RNA återhämtning och renhet med en spektrofotometer. För att bedöma RNA kvaliteten, Fyll på 1-2 µl av de eluerade RNA-provet till spektrofotometern för en analys. Spela in ett spektrum av provet i intervallet ultraviolett (UV).
- Från UV-spektrumet, registrera förhållandet A260/a280 , A260/a230 förhållandet och värdet A260 för provet (A = absorbans).
- Som enkelsträngat RNA vid en koncentration av 40 µg/mL har en absorbans 1.0 på 260 nm, beräkna RNA) koncentration (µg/mL) genom att multiplicera A260 x 40 för renat prover.
- Som en snabb metod för bedömning av RNA integritet, för att utesluta någon försämrad prover från ytterligare analys, blanda 2 µl av varje RNA-prov med 4 µl av 1,5 x formamide lastning färgämne [95% avjoniserat formamid, 0.025% (w/v) bromofenolblått, 0.025% (w/v) xylen cyanol, 5 mM EDTA (pH 8.0), 0.025% (w/v) SDS] i 1,5 mL mikrocentrifug rör23,24.
- Värm rören vid 70 ° C i 1 min och sedan överföra rören till is för 1 min.
- Ladda proven till en 1% agarosgel beredd i 1 x TBE (för en fullständig beskrivning av en infödd agaros gel-elektrofores för RNA, se Rio, Ares Jr., Hannon och Nilsen)24. Separata prover av standard gelelektrofores metoder och bekräfta förekomsten av 28S och 18S ribosomalt RNA band.
- Följa upp den gel-elektrofores med kvantitativ analysmetoder för RNA integritet bestämning [t.ex., en Bioanalyzer och RIN (RNA integritet nummer) analys] som beskrivs i Representativa resultat och Mueller, O. et al. 25 och Schroeder, A. et al. 26.
5. alternativa extraktionen metod från Formalin-fast, Paraffin-inbäddat (FFPE) vävnader
Obs: Även om FFPE vävnad bevarande inte representerar den mest robusta metoden för nukleinsyra bevarande, det protokoll som presenteras nedan kan vara ett sätt att studera vissa transkriptionell förändringar när andra bevarade vävnader är tillgängliga.
- Förbereda formalin reagenser för vävnad bevarande av dispenseras formalin i plastbehållare. Vävnader bör bevaras i formalin med förhållandet 20:1 formalin: vävnad volym/vikt, respektive.
Varning: Formalin är en känd cancerorsak och även om inte akut giftiga, kronisk exponering (oftast genom inandning ångor) kan representera en betydande hälsorisk. Ordentlig ventilation och PPE (dvs, användning av handskar i nitril, ändras inom 15 minuter efter den första exponeringen) krävs att minimera hälsoriskerna. Hänvisa till till OSHA formaldehyd Standard (29 CFR 1910.1048) för ytterligare information om exponering övervakning och riskbedömning.
Obs: Använder för lite formalin kan påverka vävnaden förmåga att bli fullständigt bevarade när nedsänkt i konserveringsmedel. - Efter isoleringen av vävnad av intresse, försiktigt trimma vävnaden till mindre än 5 mm i tjocklek.
- Med pincett, noga att dränka trimmade vävnaden i formalin att minimera eventuella stänk.
Obs: Vävnader bör vara helt nedsänkt i formalin som möjliggör en fullständig fixering. Det är viktigt att alla ytor av vävnad är helt täckta med formalin.
- Med pincett, noga att dränka trimmade vävnaden i formalin att minimera eventuella stänk.
- När vävnaderna har blivit begravda i formalin, Tillåt för vävnad fixering kan uppstå i minst 24 timmar vid rumstemperatur.
Obs: Formalin tränger vävnader långsamt, med en hastighet av 1 mm per timme från alla ytor27,28. Därför att hålla tjockleken på vävnadssnitt på mindre än 5 mm resulterar i en snabb fixering av hela vävnad. - Efter fixeringen, överföra vävnader till ett lämpligt reagens för paraffin bädda in.
Obs: till exempel vävnaderna undersökas i detta manuskript överfördes till 70% etanol innan för inbäddning. - Bädda in vävnader i paraffin. 29
- Avsnitt vävnaden till 10-80 µm tjocklek (användning 10-20 µm önskas miRNA extraheras)29.
- Med skalpell och pincett, ta bort en 40 mg vävnad bit från varje prov att bearbetas och placera det i en steril, nuclease-fri mikrofugrör.
- Utnyttja ett kommersiella kit utformad för avparaffinering och nukleinsyra återvinning av FFPE vävnadsprover för att extrahera RNA bevarade prover.
Obs: De kit som refereras i Tabellen av material använder xylen och etanol tvättar för att ta bort paraffin, ett proteas behandling steg och ett glas-fiber-filter för att rena RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Användningen av de överväganden som presenteras i denna artikel (steg 1-4 i protokollet) kommer stödet att återvinning av RNA från stora djur prover som är lämplig för en efterföljande analys i värd gen uttryck studier. RNA kvaliteten för nedströms tillämpningar bedöms av flera standardåtgärder. Spektrofotometri, A260/a280 förhållandet ger ett mått på protein kontaminering och A260/a230 förhållandet tillhandahåller en annan renhet bedömning som kommer att upptäcka kemiska föroreningar såsom fenol. I varje fall, nyckeltal ~ 2.0 är bevis på hög kvalitet RNA och minskad nyckeltal är bevis för kontaminering. Ännu viktigare, dessa nyckeltal ger inte någon information om RNA nedbrytning, som kan bedömas kvalitativt (steg 4.15-4.17) och kvantitativt (steg 4.18, såsom genom en RNA integritet nummer eller RIN Poäng).
Det är viktigt att notera att förväntade kvalitetsnivån på RNA återhämtat sig från lymfkörtel vävnadssnitt, i genomsnitt, lägre än för RNA återhämtat sig från nötkreatur vita blodkroppar prover. I en omfattande serie av RNA extraktioner från vävnad från nötkreatur och cellinjer hitta Fleige och Pfaffl30 att Genomsnittligt RIN (RNA integritet nummer mätt på en Bioanalyzer) varierar mellan < 5 för jejunum och våmmen vävnad och > 9 för vita blodkroppar celler och gulkroppen, med lymfkörtel RIN noter faller i mitten i genomsnitt 6,9. Fleige och Pfaffl30 noterar att fasta vävnader producerar RIN noter sträcker sig från 6-8, och att vävnader med högre koncentrationer av bindväv uppvisar i allmänhet en högre genomsnittlig degradering. Tätheten av bindväv i lymfkörteln, plus RNaser inneboende nivån i denna vävnadstyp, kan vara ansvarig för oförmågan att konsekvent återvinna RNA med RIN noter > 9 från lymfkörtlar.
Dock visas ett exempel på en Bioanalyzer profil för RNA återhämtat sig från en bison juvret lymfkörtel enligt den metod som presenteras här i figur 4A, visar en återställning av RNA med en RIN poäng på 8,6 (främst intakt och lämplig för i princip alla nedströms tillämpningar). RNA som genereras från detta förfarande har använts för att framgångsrikt skapa bibliotek för användning i RNA-sekvensering; Detta protokoll möjliggör för vanlig isolering av RNA-prover från bison och bovin lymfkörtlar med RIN värden > 8 (och ofta > 9). För en provuppsättning av åtta extraherade RNA-prover, genomsnittlig absorbans förhållandet vid 260 nm/280 nm 2.1 och 260 nm/230 nm var 2,1, vilket indikerar en låg protein förorening och en låg förorening med kemikalier som fenol, respektive. Den genomsnittliga nukleinsyra återhämtningen från varje utvinning var 97 ± 10 µg per ~ 100 mg eller en avkastning på ~ 1 µg RNA/mg av lymfkörteln vävnad.
Figur 4 . Representativa kvalitet spår som skildrar RNA kvalitet från utvinning metoder. (A) denna panel visar en total-RNA spår av hög kvalitet RNA genereras från en bison lymfkörtel, med hjälp av proceduren som presenteras i detta manuskript. (B) denna panel visar ett spår av ett nötkreatur FFPE-prov väljs från tabell 4, som skildrar mycket försämrade RNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
På grund av utmaningarna är associerad med snabba isolering av vävnader från stora djurkroppar, särskilt när det gäller provtagning från vilda arter, effekterna av tidsfördröjningen mellan dödshjälpen och placering av vävnad bitarna i en RNA-bevarande lösningen är potentiella oro i analysen. Informationen i litteraturen om stabiliteten av RNA i lymfkörteln vävnad, i synnerhet, är begränsad. Därför, för att ge information om godtagbar parametrar för vävnad samling, stabiliteten i RNA i bison lymfkörtel efter dödshjälp präglades.
För detta experiment ansågs tid 0 tiden djuret dödförklarades avsaknaden av ett hjärtslag och en avsaknad av en hornhinnan reflex. Efter transport av kadavret och början av obduktion, ~ 15 min hade förflutit före hämtning av den första lymfkörtel provet (15-20 min var standard i våra observationer för återvinning av fältet djur, tidsförlopp varierar beroende på var ). Juvret lymfkörteln identifierades, och en liten del av vävnad var bort och underhållas i rumstemperatur. Sektioner därefter togs på cirka 15 min intervall och överförs till RNA konserveringsmedel; i mitten av tidsförloppet hämtats ett andra prov av lymfkörteln från djuret för andra uppsättning 4 tidpunkter i serien (figur 5A; slutna cirklar, figur 5 c). RNA extraherades parallellt från lymfkörtel lappar med metoden som beskrivs ovan. Denna 1 h experiment visar att lymfkörteln RNA behållit flesta av dess integritet över tid kursen, med endast smärre minskningar av RIN poängen i slutet av gången kursen (figur 5B och 5 C). Likaså RNA från nötkreatur lymfknutor och parotideallymfknutorna behöll sin integritet mätt som RIN poäng över ~ 1 h tid kurser efter slakt (figur 5 c; djuret information ges i tabell 2). Dessutom extraherades RNA från juvret lymfkörtel sektioner som samlades 8 h efter döden, håller hela sektioner i cell kultur media antingen rumstemperatur eller vid 37 ° C att simulera hålltid i en djurkropp. Ribosomalt RNA var observable även efter 8 h håller tider (figur 5 d).
Figur 5 . RNA kvalitet i bison lymfkörtel prover samlas in över tid kurser efter döden. (A) denna panel visar en experimentell översikt över ett 1 h tid kursen förfarande. (B, C) Dessa paneler visar en undersökning av RNA kvalitet för prover tagna över en 1 h tid kurs från en juvret lymfkörtel som isolerats från en amerikansk bison. Gel reflekterar RNA prover denatureras i formamid och separeras i en 1% icke-denatureringen gel. Panelen (C) skildrar förändringarna i RIN noter för varje prov. Data från ytterligare experiment på nötkreatur lymfknutor och parotideallymfknutorna överdras som anges. (D) denna panel visar ett exempel på RNA gel, som beskrivs för gelen används i panelen (B), för juvret lymfkörtel prover bearbetas efter 8 h inkubation antingen rumstemperatur (Lane 1) eller vid 37 ° C (Lane 2) i cell kultur media. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Dessa representativa resultat överensstämmer med RNA stabilitet resultat för andra vävnadstyper och källor. Tabell 3 ger en sammanfattning av resultaten av ett urval av publicerade artiklar som har undersökt RNA stabilitet över före bevarandetid kurser. Observera att endast trender från RIN Poäng och/eller rRNA gel observation (total-RNA) ingår i tabellen, även om några papper ger en ytterligare analys av mRNA integritet, såsom genom bestämning av förhållandet mellan 5' vs. 3' segment av valda RNAs (t.ex., Fajardy et al.) 31. det är dock viktigt att komma ihåg att längre tid mellan död och prov bevarande kan resultera i förändringar i RNA uttrycket profiler, som visat, till exempel för placenta vävnad31. Jämfört med stabil avskrifter, kan mer instabila RNAs vara uttömda. Det är därför viktigt att utnyttja ett snabb, strömlinjeformat arbetsflöde för vävnad återhämtning för att minska eventuella förseningar när djuret är tillgänglig för obduktion, för att uppnå de mest biologiskt giltig RNA-profilerna. Det vore ett misstag att anta att förekomsten av intakt ribosomalt RNA anger frånvaron av ändringar i transkriptom profil. Fortfarande, representativa resultaten tyder på att även med ökad bearbetning gånger nödvändiga för stora djur provtagning, är det möjligt att förbereda RNA som är lämplig för en gen uttryck analys från lymfkörtel prover.
Dessutom undersöktes effekterna av variabeln tid efter upptining; under denna tid är RNA känsliga för nedbrytning av nukleaser som är närvarande i vävnaden. Kvaliteten på de RNA-prover som bearbetade med detta protokoll med antingen 0 eller 64 min hålltid vid rumstemperatur efter upptining vid steg 4.1 mättes genom en RIN poäng. Detta experiment visar att protokollet är ganska okänslig för Tina tiden, vilket gör den robust för bearbetning av flera prover (figur 6A).
Figur 6. Ytterligare analys av RNA kvalitetsparametrar. (A) denna panel visar RNA kvalitet resultat för RNA renas antingen omedelbart efter upptining (0 min) eller efter att ha hållit för 64 min i rumstemperatur före behandlingen. Staplarna representerar i genomsnitt 3 vävnad bitar för varje villkor, ± standardavvikelsen. Alla vävnader förvarades i en RNA konserverande lösning innan upptining, som beskrivs i protokollet. (B) denna panel visar ett Bioanalyzer spår av ett prov från en dåligt homogeniserad lymfkörtel bit som innehåller stora delar av bindväv. Den lilla storleken på 28S och 18S topparna, jämfört med topparna i bergskedjan 5S, är uppenbart. Detta kan också inträffa på grund av nedbrytning av RNA, även om relativt platt baslinjen mellan intervallet 5S och 18S peak är alternativt tyder på dålig utvinning; Se Avraham, R. et al. 48 för ytterligare detaljer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Som en jämförelse till isolering av RNA från lymfkörtlar genomfördes en rättegång återhämtning av RNA från FFPE mesenteriska lymfkörteln bitar från nötkreatur. Som beskrivits ovan, var proverna fast för 1 vecka i formalin före paraffinet inbäddning, följt av 4 månaders lagring i paraffin i rumstemperatur. Vävnaderna var sektioneras i fem 10 µm sektioner, och använder den FFPE extraktionsförfarande, cirka 62 ng/µL av RNA per prov (± 14 ng/µL) återvanns. Absorbansen nyckeltalen på 260 nm/280 nm i genomsnitt 1,9, vilket indikerar en produkt med låga nivåer av proteinet kontaminering, även om A260/a230 var unfavorable (tabell 4). Observera att RIN poängen iakttas för dessa prover var mycket låg (< 2), vilket indikerar en försämring av RNA produkterna (tabell 4. Figur 4B), överensstämmer med beskrivningen av Srinivasan et al. 45. i analyser utnyttja qPCR, vanligtvis små sektioner av RNA, eller mer specifikt cDNA (< 200 bp), förstärks. Därför förstärkning av små produkter kan fortfarande uppstå från förstörda prover och qPCR-analys kan utföras. Till exempel, var det möjligt att förstärka ett segment av det ribosomala proteinet S9 (RPS9) avskrift från dessa FFPE-återvunnen prover av qPCR. CT värdena var konsekventa över proven och i genomsnitt 19,2 ± 1,8. Tänk på de begränsningar som finns när utnyttja FFPE-beredda proverna, emellertid, som större produkter är inte nödvändigtvis, och nedbrytningen kan inte ha inträffat i en jämn takt över alla prover. Därför, detta material kan användas för studier med varningar, men betydande begränsningar finns för eventuella efterföljande program som RNA-sekvensering.
| Lymfkörtel typ | Läge | Längd | Bredd | Regioner som dräneras av noder |
| Prescapular | Bara mediala till axelleden; inbäddade i underhudsfett och under ett lager av muskler | 1-10 cm | 1,5-2 cm | Huden på halsen; skuldra; och hud, muskler och lederna i nedre bröstkorg extremiteterna (ref. 8) |
| Prefemorala (även kallad precrural) | Bara dorsala och mediala till att kväva, cirka 12-15 cm ovanför knäskålen | 8-10 cm | 2,5 cm | Huden på bäcken lem, buken, och stjärtfenan delar av bröstkorgen (ref. 8) |
| Retrofaryngeal | Hittade i mittlinjen dorsala till svalget | 4-5 cm | 2-3,5 cm | Tunga, slemhinnor i munhålan, tandkött, läppar, hårda gommen, spottkörtlar, de flesta av musklerna i halsen |
| Parotis | Beläget subkutant ventrala till käkleden, caudal till tuggmuskel (ref. 8) | 6-9 cm | 2-3 cm | Hud, subcutis, de flesta av musklerna i huvudet, musklerna i ögat och örat, ögonlock, lacrimal körtel, rostralt delen av näshålan |
| Submandibular (kan vara 1-3 för närvarande) | Beläget subkutant på den mediala aspekten av vinkeln på underkäken, associerade med spottkörtlarna | 3-4 cm | 2-3 cm | Nos, läppar, kinder, hårda gommen, rostralt delen av näshålan, spetsen av tungan, hud och muskel av huvudet (ref. 8) |
| Juvret (kvinna ytliga ljumsk, vanligtvis 2 närvarande) | Hittade caudally och dorsalt i förhållande till bröstkörtlarna | 6-10 cm | Juvret, vulva, absid i slidan, hud på de mediala och stjärtfenan aspekterna av låret, mediala ytan av benet | |
| Testikelcancer (manlig version av ytliga ljumsk) | Nedan prepublic senan inom ett fettlager runt halsen på pungen | 3-6 cm | Pungen, förhuden och penis |
Tabell 1. Översikt av nötkreatur ytliga lymfkörtlar.
| Djur beskrivning | Läge i manuskriptet | Ålder | Sex | Hälsostatus |
| Videofilmade Bison bison | Bison i video--lymfkörtel återhämtning | 5-6 yo | Kvinna | Friska |
| Videofilmade Bos taurus | Nötkreatur i video--lymfkörtel återhämtning | 7-8 yo | Kastrerad hane | Friska |
| Bison bison för RNA stabilitet studie | Bild 5A-C | 5-6 yo | Kvinna | Friska |
| Bos taurus A för RNA stabilitet studie | Fig. 5 c, Fig. 6A | 7-8 yo | Kastrerad hane | Friska |
| Bos taurus B för RNA stabilitet studie | Fig. 5 c | 7-8 yo | Kastrerad hane | Friska |
| Bos taurus för FFPE kvalitet studie | Tabell 4, Fig. 4B | 0,5 yo | Kastrerad hane | Felfri (kontroll från O157: H7 infektion studie) |
| Observera att metoden som har använts på flera ytterligare nötkreatur, bison och geten lymfkörtel prover, utöver de som markeras här. | ||||
| Dessutom, vi använde samma metod på lymfkörtel som samlats in från en 1,5 mo. gamla kvinnliga kalv. | ||||
Tabell 2. Kännetecken för djur som används i pilotstudier.
| Vävnadstyp | Konserveringsmetod | Holding villkor | Nedbrytning slutsats | Referens |
| Bovin fett, Skelett muskel, lever | Knäppa frysning (flytande N2) | 4 ° C, vakuum förpackade vävnad | Muskel RNA mer stabil (även till 8 dagar lagring); adipose och levern stabil främst till 24 h. enligt bedömning av utseendet av rRNA band | Bahar et al. (2007)32 |
| Människors kolon, kolorektal cancer | RNA bevarande lösning | Rumstemp. | RIN bevaras för 2 h., men delmängd av gener visar förändringar i uttryck från 0,5-2 h. | Yamagishi et al. (2014)33 |
| Mus lever, mjälte | RNA bevarande lösning eller snapin frysning (torris flytgödsel) | Inuti musen stommen (37 ° C) | Mjälten prover var stabil ut till 1,5 h; lever prover uppvisade tidigare nedbrytning (24% minskning i RIN på 105 min.) | Choi et al. (2016)34 |
| Mus lever | Ingen (Homogenized färska i guanidinium kaliumtiocyanat-fenol-kloroform) | 25 ° C, 37 ° C | Begränsad nedbrytning ut till 4 h. vid 25 ° C, men omfattande nedbrytning vid 37 ° C i 4 h. (som observerats med RIN noter). | Almeida et al. (2004)35 |
| Mänskliga ileum | RNA bevarande lösning eller snapin frysning | 4 ° C, 37 ° C | Generellt stabil vid 1,5 h. vid 37 ° C; Stabil ut till 6 h. vid 4 ° C (som observerats med RIN noter). Observera att författarna ger också en sammanfattning av utvalda RNA stabilitet resurser i tabell S1 som kan fungera som en ytterligare referens för dem som är intresserade av ytterligare genomgång av vävnaden RNA integritet litteratur. | Lee et al. (2015)36 |
| Mänskliga levern | Knäppa frysning (flytande N2 eller isopentan) | Rumstemp. | Nedbrytning observerats på 1 h. (upp till 0,85 ΔRIN); Mer nedbrytning i mindre prover av lever än i större prover. | Kap et al. (2015)37 |
| Mänskliga kolorektal cancer | Knäppa frysning (flytande N2/isopentan) | 4 ° C | Nedbrytning observerats av 1 h.; RIN Poäng endast 4,2 efter 90 min. fördröjning i frysning tid | Hong et al. (2010)38 |
| Mänskliga levern | RNA bevarande lösning, även flash frysning (vätska N2) | Rumstemp, 4 ° C | Prover var stabil jämna ut till 1 d. på is; nedbrytning observerats efter 1 d. vid rumstemp. (men inte efter 3 h.; som observerats med RIN noter) | Lee et al. (2013)39 |
| Häst fett, Skelett muskel | Knäppa frysning (flytande N2) | 13 ° C | Författarna rekommenderar att bästa integritet för muskel var inom 2 h.; fett bevarande inom 0,5 h. rekommenderas av författarna (såsom rRNA gel utseende) | Morrison et al. (2014)40 |
| Lax hjärna, njure, lever, muskler | RNA bevarande lösning | Rumstemp. | Hjärnan RNA stabil till 4-8 h., njure och muskel exhbiit vissa nedbrytning av 8 h. (gel, RIN Poäng båda används) | Seear & Sweeney (2008)41 |
| Kanin bindväv (ligament, senor, brosk) | Knäppa frysning (flytande N2) | 4 ° C, rumstemp. | Ingen ”overt” nedbrytning ut till 96 h. efter döden, såsom rRNA gel utseende | Martjuk et al. (1998)42 |
| Råtthjärna, lungorna, hjärtat, levern | Visas extraheras färska | Inuti råtta kadavret hölls i 20 ° C inkubator | Högsta RNA stabilitet observerats i hjärnan (kunde observera rRNA band ut till 7 dagar efter döden, även om nedbrytning var närvarande), måttlig stabilitet i lungor och hjärta, låg stabilitet i levern; såsom rRNA gel utseende | Inoue et al. (2002)43 |
| Mänskliga tonsill, kolon | Med och utan RNA bevarande lösning, sedan snapin-fryst | Rumstemp. 22 ° C, 4 ° C RNA bevarande lösning, kall koksaltlösning eller is (0 ° C) | Stabil till 16 h. på is eller i RNA bevarande lösning; viss nedbrytning vid 6 eller 16 h. i kall saltlösning eller RT (mätt i RIN noter) | Micke et al. (2006)44 |
Tabell 3. Urval av tidigare avgöranden om RNA stabilitet i postmortala vävnadsprover. Posterna representerar valda manuskript från litteraturen om RNA stabilitet, med en rad olika vävnadstyper representerade, inklusive murint, mänskliga biopsi och veterinärmedicinska exempel. Metoder för bevarande, funktionsläget av lagring före extraktion och en kort sammanfattning av resultaten tillhandahålls för varje exempel. Om inget annat anges, proverna förvarades på allt från is till 37 ° C, följt av snapin frysning eller en infusion med RNA bevarande lösning, efter tid kursen (med andra ord, stabilitet som mättes inte i närvaro av en RNA bevarande lösning under ruvningen, om inte anges).
| Prov-ID | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Ett260/a280 | 1,96 | 1,98 | 1,98 | 1,91 | 1,98 | 1,89 | 1,89 | 1,91 | 1.9 | 1.84 | 1.84 | 1,97 |
| En260/a230 | 0,67 | 0,14 | 0,19 | 0,26 | 0,61 | 0,69 | 1.33 | 0,11 | 0,21 | 0,39 | 0,1 | 0,44 |
| RIN | 1.6 | 1.1 | 1.3 | 1.2 | 1 | 1.3 | 2 | 1.1 | 1.2 | 1 | 1 | 1 |
Tabell 4. Representativa resultat från RNA isoleras från nötkreatur FFPE mesenteriala lymfkörtlar. Tabellen visar resultaten från spektrofotometrisk och kvalitet analyser från en rad FFPE nötkreatur lymfkörtel prover bearbetas med hjälp av den metod som beskrivs i detta manuskript. I varje fall återspeglar resultaten starkt försämrade RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Majoriteten av transcriptomic studier och tillhörande protokoll fokuserar på mus, råtta eller postmortala mänskliga prover. Utredningar i boskap och vilda djur är dock ett brett utbud av möjligheter för karakterisering av immunsvaret mot sjukdom, både som veterinärmedicin och, när det gäller zoonotiska sjukdomar, att människors hälsa. Detta protokoll föreskrivs en disposition av huvudprioriteringar för hög integritet RNA-extraktion från vävnader från stora djur, som nötkreatur, bison, getter och får. Storleken på djuren, samt villkoren för provsamlingen, göra återhämtningen en mer omfattande process, med postmortala behandling längre tid än mus lymfkörtel återhämtning. Likaså nödvändiggör den stora storleken på dessa lymfkörtlar protokoll som återställer parallella prover från olika djur samt prover som är representativa för de immunologiska/patologiska förändringarna inom lymfkörtel. Förslagen för provinsamling i detta protokoll ger för återvinning av intakt RNA samt när det gäller representativa profiler baserade på den snittning av lymfkörteln.
Som en demonstration av vikten av ett standardiserat provtagningsstrategi och protokoll, som presenteras här, tillfrågade vi 25 papper från databasen PubMed Central som kännetecknas av transcriptomes boskap lymfkörtlar. Ett papper indicerat vid behandling av en stor lymfkörtel avsnitt i taget, en diskuteras metoder specifika laser fånga lokalt, en nämnde att ett ”representativt” samlades in från lymfkörteln, och endast ett papper46 anges att lappa av lymfkörtel samlas in (10 mm3 i storlek) ingår både cortex och medulla regioner. Medan andra papper noterade att små prover (vanligen 30-100 mg) bearbetades för RNA analys, nämnde 84% av tidningarna inte en provtagningsstrategi för insamling av dessa vävnad bitar. Som RNA-sekvensering är fortfarande relativt dyrt, analys av flera avsnitt per lymfkörtel är osannolikt att vara ekonomiskt livskraftigt i de flesta fall, särskilt eftersom biologiskt identiska prover prioriteras typiskt för statistisk analys. Genom att samla ett urval över en kil av en sagittally sektionerad lymfkörtel, fångas RNA från lymfkörtel regioner rika på olika typer av immunceller i alla prover. Detta protokoll kan därför tjäna som referens för en dokumenterad och reproducerbara provtagningsstrategi för lymfkörtel transkriptomik.
I utarbetandet av RNA från vävnader finns det flera viktiga steg för processuella beslutsfattande. Först, metodologiska litteraturen är blandad när det gäller användningen av bevarande lösningar vs. användning av flash-fryst vävnad prover (och efterföljande kall temperatur slipning). Särskilt när det gäller stora djur necropsies finns det flera potentiella processuella fördelar användningen av en bevarande lösning, som ingår i detta protokoll. Först, vävnadsprover kan lagras under obduktion i bevarande lösning utan att behöva omedelbart överföra rören till flytande kväve. För det andra, användning av ett bevarande lösning ger ytterligare skydd före provet bearbetning för RNA-extraktion, särskilt om provet kort eller delvis tinar före homogenisering. Resultaten i figur 6A indikerar att detta skyddande effekt sträcker sig till lymfkörteln vävnad. Däremot måste flash-frysta prover upprätthållas i fruset tillstånd tills ögonblicket av homogenisering i en fenol-innehållande buffert. För fältet obduktion av stora djur, där flytande kväve inte är lätt tillgängliga, kan slutligen prover lagras i bevarande lösning tills de kan återlämnas till labbet.
Ytterligare fördelar av de molekylära komponenterna i proceduren presenteras här bland annat förekomsten av fenol under inledande vävnad behandling, som fungerar som ett desinfektionsmedel under processen aerosol-genererande av homogenisering för prover från smittade djur och användningen av förfarandet spin kolumn att avlägsna kvarvarande fenol och guanidin isotiocyanat från provet. Representativa resultaten visar att förfarandet genererar högkvalitativa RNA, bedömd av en260/a280 och en260/a230 nyckeltal, gel elektrofores och RIN noter och är robust inför tid kursen utmaningar av boskap och vilda djur provtagning. Hopkoppling av vävnad bevarande (t.ex., i RNALater), homogenisering i fenol-baserade reagens (t.ex., TRIzol) och kiseldioxid kolumn rening har använts framgångsrikt i litteraturen till profil gen uttrycksmönster i får abomasal lymfkörtlar infekterade med gastrointestinala nematoder46 och i nötkreatur lymfkörtlar infekterade med ett herpesvirus47, med RIN Poäng större än 8 och större än 7 över alla prover, respektive.
När det gäller en resulterande RNA med oacceptabla RIN noter för efterföljande analys, följande variabler, som är standard för RNA bearbetning, bör bedömas: den totala bearbetning tid besiktningen, villkora av vävnaderna, bearbetning/tidsfördröjningen efter Tina, tekniken under den RNA-extraktionen och RNA hantering efter extraktion. Den totala bearbetning tid besiktning bör bedömas särskilt i fråga om vävnader från djur som hittats döda, i motsats till euthanized djur. Som beskrivits ovan, RNA är relativt stabilt i lymfkörtlar, men långa fördröjningar i behandlingen kan leda till nedbrytning, särskilt för instabila avskrifter. En förbryllande tid variabel kunde närvara om prover jämförs mellan slaktkroppar som har förblivit i fältet för skilda mängder av tid. Villkora av vävnader bör bedömas, eftersom nedbrytningen av vävnad integritet, på grund av patologiska förändringar i samband med infektion, kan minska RNA stabilitet. Till exempel lägre RNA kvalitet har observerats i placentome av Brucella-infekterade djur efter aborten (Boggiatto et al., läggs upp). Bearbetning/tidsfördröjning efter blidvädret mildras genom användning av bevarande lösningar, som beskrivs i detta protokoll. Vara säker på att tjockleken på vävnad bitarna är tillräckligt låg för att möjliggöra en korrekt och snabb penetration av konserveringsmedel lösningen i vävnaden (< 5 mm tjocklek med hjälp av de konserveringsmedel som nämns i Tabell för material). Under den RNA-extraktionen, buffertar bör RNase-fri och kontakt med handskar och andra förorenade objekt (RNaser finns på huden) måste undvikas. För malning av lymfkörteln vävnad, den största källan till potentiella RNaser blir i vävnaden själv, men det är fördelaktigt att minska införandet av föroreningar i alla skeden av förfarandet. För att hantera RNA efter utvinning, som beskrivs i protokollet, prover alikvot RNA in rören innan frysning och lagring vid-80 ° C, för att eliminera behovet av att frysning-tining proverna för en kvalitativ och kvantitativ analys.
Låga räntor i förfarandet, förutom följd av nedbrytningen av RNA-prover, kan vara på grund av en ineffektiv homogenisering av lymfkörteln vävnad vid steg 4,3 i protokollet. Observera att inkubering i en RNA bevarande lösning kan ändra strukturen på vävnaden (ökad fasthet), även om de flesta lymfkörtel vävnader dissocierade effektivt i pilot körningar med den stora tandade rotor och stator dissociator beskrivs här. Som påpekas i steg 4.3.1, homogenisering i fenol-baserade reagens bör upprepas om dissociation är ofullständiga. Murbruk-och-mortel slipning, är följt av en resuspension av marken provet i en fenol-baserade reagens, ett annat alternativ för laboratorier utan tillgång till en Homogenisatorer med dessa specifikationer. Dock presenterar en homogenisering i engångsrör flera potentiella fördelar över slipningen av fryst vävnad i en mortel och stöt, inklusive en mer genomförbar och kortare arbetsflöde för bearbetning av flera prover, avsaknad av prov förlust vid slipning , ingen rensning, och ingen potentiell kontakt med drivna provexemplar, vävnader från smittade djur.
Avraham o.a. 48 beskriver att en stor 5S RNA topp i slutprodukten RNA, parat med en låg återhämtning av 28S och 18S ribosomalt RNA, kan vara ett tecken på en ofullständig Lysering av cellerna (som i sin tur för lymfkörtel bearbetning, kan vara på grund av en ofullständig dissociation av tiss UE). Figur 6B innehåller ett exempel på en RNA-profil som genereras från en bit av nötkreatur parotis lymfkörtel som var mycket hög i bindväv och inte homogenisera effektivt. RNA avkastning ska beräknas och övervakas över prover i en uppsättning för analys för att bekräfta att liknande återvinningar erhålls per mg vävnad och prover för direkt jämförelse av RNA-sekvensering ska bearbetas i batch, använder samma homogenisering strategi för alla prover. Observera att metoden kil provtagning även stöd i att undvika en samling av ett prov som är uteslutande en region av omfattande bindväv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter avslöja. All forskning finansieras med intramurala medel från US Department of Agriculture, Agricultural Research Service. Alla hänvisningar till specifika produkter tillhandahålls i syfte att experimentell reproducerbarhet och representerar inte något godkännande av dessa produkter av den federala regeringen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka James Fosse för hans utmärkta arbete på alla videography och video bearbetning; Michael Marti för hans utmärkta arbete i generation av digitaliserade nötkreatur bilder; Lilia Walther för hennes hjälp med RNA-extraktion och Bioanalyzer körningar; Mitch Palmer och Carly Kanipe för deras hjälpsamma granskning och återkoppling på lymfkörtel bilder; och djurvård och veterinära personalen vid National Animal sjukdom Center för alla deras hårda arbete och hjälp med djurhållning och förberedelserna för obduktion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments) | ThermoFisher | AM7020 | |
| 1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Disposable scalpels | Daigger Scientific | EF7281 | |
| Tissue forceps, rat tooth | Fisher Scientific | 12-460-117 | Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference |
| 3 mm punch biopsy needles | Fisher Scientific | NC9949469 | |
| Sharps container (small and transportable for necropsy) | Stericycle | 8900SA | 1 qt. size shown here |
| Cutting boards or disposable trays | Fisher Scientific | 09-002-24A | Available in a variety of sizes, depends on user preference |
| Personal protective equipment | Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.) | ||
| Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments) | ThermoFisher | 15596026 | |
| Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments) | ThermoFisher | 12183018A | Designed for up to 100 mg tissue |
| 100% Ethanol (200 proof for molecular biology) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments) | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Agarose (General, for gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| 1X TBE | Fisher Scientific | BP24301 | Can also make from scratch in the laboratory |
| Deionized formamide | EMD Millipore | S4117 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer) | ThermoFisher | ND-2000 | |
| Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols) | Agilent | G2939BA | |
| FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue) | ThermoFisher | AM1975 | |
| Plastic spreader (L-shaped spreader) | Fisher Scientific | 14-665-231 | Only needed for sterility testing for samples from infected animals |
| Necropsy knives | Livestock Concepts | WI-0009209 |
References
- Tizioto, P. C., et al. Immunological response to single pathogen challenge with agents of the bovine respiratory disease complex: an RNA-sequence analysis of the bronchial lymph node transcriptome. PLoS One. 10 (6), e0131459 (2015).
- Miller, L. C., et al. Analysis of the swine tracheobronchial lymph node transcriptomic response to infection with a Chinese highly pathogenic strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. BMC Veterinary Research. 8, 208 (2012).
- Silva, T. M. A., Costa, E. A., Paixao, T. A., Tsolis, R. M., Santos, R. L. Laboratory animal models for brucellosis research. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 518323 (2011).
- Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of the lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
- Elmore, S. A. Histopathology of the lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34 (5), 425-454 (2006).
- Luscieti, P., Hubschmid, T. h, Cottier, H., Hess, M. W., Sobin, L. H. Human lymph node morphology as a function of age and site. Journal of Clinical Pathology. 33 (5), 454-461 (1980).
- Hadamitsky, C., et al. Age-dependent histoarchitectural changes in human lymph nodes: an underestimated process with clinical relevance? Journal of Anatomy. 216 (5), 556-562 (2010).
- Sisson, S., Grossman, J. D., Getty, R. Sisson and Grossman’s The Anatomy of Domestic Animals, Volume 1. , Fifth Edition, W.B. Saunders Company. Philadelphia, PA. (1975).
- Olsen, S. C., Johnson, C. Comparison of abortion and infection after experimental challenge of pregnant bison and cattle with Brucella abortus strain 2308. Clinical and Vaccine Immunology. 18 (12), 2075-2078 (2011).
- Brichta-Harhay, D. M., et al. Microbiological analysis of bovine lymph nodes for the detection of Salmonella enterica. Journal of Food Protection. 75 (5), 854-858 (2012).
- Samuel, J. L., O’Boyle, D. A., Mathers, W. J., Frost, A. J. Isolation of Salmonella from mesenteric lymph nodes of healthy cattle at slaughter. Research in Veterinary Science. 28 (2), 238-241 (1980).
- Arthur, T. M., et al. Prevalence and characterization of Salmonella in bovine lymph nodes potentially destined for use in ground beef. Journal of Food Protection. 71 (8), 1685-1688 (2008).
- Cray, W. C., Moon, H. W. Experimental infection of calves and adult cattle with Escherichia coli O157:H7. Applied and Environmental Microbiology. 61 (4), 1586-1590 (1995).
- Thiermann, A. B. Experimental leptospiral infections in pregnant cattle with organisms of the Hebdomadis serogroup. American Journal of Veterinary Research. 43 (5), 780-784 (1982).
- Palmer, M. V., Waters, W. R., Whipple, D. L. Investigation of the transmission of Mycobacterium bovis from deer to cattle through indirect contact. American Journal of Veterinary Research. 65 (11), 1483-1489 (2004).
- Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA, and proteins from cell and tissue samples. BioTechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. https://www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx. (2013).
- TRIzol Reagent Manual. , ThermoFisher Scientific. https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf (2016).
- Disruption and Homogenization of Tissue for the Extraction of RNA. , National Institute of Environmental Health Sciences . https://www.niehs.nih.gov/research/resources/protocols/extraction/disruption/index.cfm (2014).
- PureLink RNA Mini Kit Protocol . , Life Technologies. https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/purelink_rna_mini_kit_man.pdf (2012).
- RNA Gel-loading Buffer. , Cold Spring Harbor Protocols. http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/1/pdb.rec397 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M. Jr, Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing Agarose Gel Electrophoresis of RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
- Mueller, O., et al. A microfluidic system for high-speed reproducible DNA sizing and quantitation. Electrophoresis. 21 (1), 128-134 (2000).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques. , Churchill Livingstone. China. (2012).
- Medawar, P. B. The rate of penetration of fixatives. Journal of Microscopy. 61 (1-2), 46-57 (1941).
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27, 126-139 (2006).
- Fajardy, I., et al. Time course analysis of RNA stability in human placenta. BMC Molecular Biology. 10 (21), (2009).
- Bahar, B., et al. Long-term stability of RNA in post-mortem bovine skeletal muscle, liver and subcutaneous adipose tissues. BMC Molecular Biology. 8, 108 (2007).
- Yamagishi, A., et al. Gene profiling and bioinformatics analyses reveal time course differential gene expression in surgically resected colorectal tissues. Oncology Reports. 31 (4), 1532-1538 (2014).
- Choi, S., Ray, H. E., Lai, S. H., Alwood, J. S., Globus, R. K. Preservation of multiple mammalian tissues to maximize science return from ground based and spaceflight experiments. PLoS One. 11 (12), e0167391 (2016).
- Almeida, A., Thiery, J. P., Magdelenat, H., Radvanyi, F. Gene expression analysis by real-time reverse transcription polymerase chain reaction: influence of tissue handling. Analytical Biochemistry. 328 (2), 101-108 (2004).
- Lee, S. M. L., Schelcher, C., Thasler, R., Schiergens, T. S., Thasler, W. E. Pre-analytical determination of the effect of extended warm or cold ischaemia on RNA stability in the human ileum mucosa. PLoS One. 10 (9), e0138214 (2015).
- Kap, M., et al. The influence of tissue procurement procedures on RNA integrity, gene expression, and morphology in porcine and human liver tissue. Biopreservation and Biobanking. 13 (3), 200-206 (2015).
- Hong, S. H., et al. Effects of delay in the snap freezing of colorectal cancer tissues on the quality of DNA and RNA. Journal of the Korean Society of Coloproctology. 26 (5), 316-325 (2010).
- Lee, S. M., et al. RNA stability in human liver: comparison of different processing times, temperatures and methods. Molecular Biotechnology. 53 (1), 1-8 (2013).
- Morrison, P. K., et al. Post-mortem stability of RNA in skeletal muscle and adipose tissue and the tissue-specific expression of myostatin, perilipin and associated factors in the horse. PLoS One. 9 (6), e100810 (2014).
- Seear, P. J., Sweeney, G. E. Stability of RNA isolated from post-mortem tissues of Atlantic salmon (Salmo salar L.). Fish Physiology and Biochemistry. 34 (1), 19-24 (2008).
- Marchuk, L., Sciore, P., Reno, C., Frank, C. B., Hart, D. A. Postmortem stability of total RNA isolated from rabbit ligament, tendon, and cartilage. Biochimica et Biophysica Acta. 1379 (2), 171-177 (1998).
- Inoue, H., Kimura, A., Tuji, T. Degradation profile of mRNA in a dead rat body: basic semi-quantification study. Forensic Science International. 130 (2-3), 127-132 (2002).
- Micke, P., et al. Biobanking of fresh frozen tissue: RNA is stable in nonfixed surgical specimens. Laboratory Investigation. 86 (2), 202-211 (2006).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Ahmed, A. M., et al. Variation in the ovine abomasal lymph node transcriptome between breeds known to differ in resistance to the gastrointestinal nematode. PLoS One. 10 (5), e0124823 (2015).
- Russell, G. C., et al. Host gene expression changes in cattle infected with Alcelaphine herpesvirus 1. Virus Research. 169 (1), 246-254 (2012).
- Avraham, R., et al. A highly multiplexed and sensitive RNA-seq protocol for simultaneous analysis of host and pathogen transcriptomes. Nature Protocols. 11, 1477-1491 (2016).
