Summary
כאן, הצגנו את השיטות כדי לזהות עצמיים איון האנושי באמצעות מבחני electrochemiluminescence (ECL). הפרוטוקול, השתמשו כדי לחזות סוכרת מסוג 1, ניתן להרחיב על כדי לזהות עצמיים למחלות אוטואימוניות אחרות.
Abstract
עם פיתוח עצמיים איון הקשורים עם סוכרת מסוג 1 (T1D) מובילה פרויקט ומעכבות את המחלה באוכלוסייה הכללית. וזמינותו ECL הרומן הוא שלב נוזל nonradioactive assay עבור איון עצמיים עם רגישות גבוהה וספציפיות יותר הנוכחי "זהב" הסטנדרטי רדיו-איגוד וזמינותו (רבא). ECL מבחני ניתן להגדיר בצורה מדויקת יותר את התחלתה של presymptomatic T1D על ידי שיסייעו לך לייחד את עצמיים בסיכון גבוה, גבוה-זיקה עצמיים סיכון נמוך, נמוך-זיקה שנוצר ב RBAs ו immunosorbent מקושרים-אנזים קונבנציונאלי מבחני (אליסה ). החלבון אנטיגן בשימוש assay ECL זו נקראת עם Sulfo-תג, ביוטין, בהתאמה. כל assay נוגדן עצמי ECL המשתמשת חלבון אפיטופ מסוים צריך צעד אופטימיזציה לפני זה יכול לשמש עבור יישום מעבדה. שלב זה חיוני במיוחד בקביעת הדרישות סרום טיפולי חומצה, ריכוזים של יחסי של שני אנטיגנים שונים המסומנת Sulfo-tag ושל ביוטין. כדי לבצע את הבדיקה, סרום דגימות מעורבבים עם Sulfo-תג-מצומדת ו biotinylated ללכוד אנטיגן חלבונים בתמיסה פוספט buffered (PBS), המכילה 5% אלבומין שור (BSA). לאחר מכן, הדגימות מודגרת למשך הלילה ב 4 º C. באותו היום, צלחת מצופים streptavidin המוכנים מאגר חוסם הפריטים המוקפצים, מודגרות בן לילה ב 4 º C. ביום השני, לשטוף את הצלחת streptavidin ולהעביר את התערובת סרום-אנטיגן לצלחת. מניחים את הצלחת על צלחת ניעור, להגדיר אותו במהירות נמוכה, דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח. לאחר מכן, הצלחת נשטף שוב, מאגר קורא נוסף. הצלחת ואז נספר על המכונה קורא צלחת. התוצאות המועברים דרך אינדקס, אשר נוצר מדגימות נסיוב בקרה חיובית ושלילית סטנדרטי פנימית.
Introduction
מערכת סיווג הזמני האחרונות נוצר כדי לסייע עם האבחנה של שלבים הראשונים של T1D בחולים. זיהוי מדויק של איון האנושי עצמיים ממלא תפקיד חשוב בזיהוי, היערכות presymptomatic סוכרת מסוג 1, כמו הנוכחות של איון עצמיים מעיד על קיומם של תאי β מחלת חיסון עצמי. שיעור על סוכרת אשר משפיע על חולים מן המופע ההתחלתי של תאי β מחלת חיסון עצמי כדי המחלה סימפטומטי, המשויך המספר והסוג של איון עצמיים, הוא משתנה2,3.
הגיל של נוגדן עצמי seroconversion, כייל נוגדנים ואת זיקתו של איון עצמיים יכולה להשפיע על קצב ההתקדמות סימפטומטי סוג 1 סוכרת4,5,6,7,8 ,9,10. לאחרונה, מבחני ECL מפותחת יש בהרחבה מאומתים, הדגימו רגישות מוגברת, ויש עוד מחלות ספציפיות10,11,12,13. מבחני אלה לשפר את חיזוי ואת הזמני של הסיכון לסוכרת דרך גילוי מוקדם יותר של איון עצמיים. הם ליתר דיוק לסמן אתחול של איון מחלת חיסון עצמי, להתעלם את האותות סיכון נמוך-זיקה נמוכה לא רלוונטי לסוכרת.
ב וזמינותו ECL, עצמיים של הסרום, אם קיים, גשר אנטיגן Sulfo-תג-מצומדת כדי אנטיגן לכידת biotinylated בשלב הנוזלים. לאחר גישור, מקשר ביוטין תפס בשלב מוצק, דרך ECL שזיהה את Sulfo-התג בצלחת streptavidin מצופה (איור 1).
בסקירה זו, מבחני ECL נוגדן בודד עם איון האנושי עצמיים בעיקר מנוצלים. בקצרה, מרובב נוגדן מבחני בהתבסס על מבחני ECL יחיד יידונו. מולטיפלקס וזמינותו יכול לשמש כדי לזהות מרובה, עד 10, עצמיים בתוך יחידה אחת, שימוש µL 15 של נסיוב. Assay תפוקה גבוהה פשוט זה יכול לשמש כדי מסך, בו זמנית, עצמיים מרובים למחלות אוטואימוניות מרובים הרלוונטיים באוכלוסייה הכללית.
Protocol
1. מאגר הכנה
- תיוג מאגר (2 x PBS, pH 7.9): ב- 400 מ של מים מזוקקים (DD) יונים, להוסיף 100 מ של 10 x PBS, להתאים את ה-pH ל- 7.9 עם NaOH.
- 3 מ מ של ביוטין: להמיס 1 מ ג של ביוטין בשנת 588 µL של תיוג מאגר.
- 3 מ מ של Sulfo-תג: nmol 150 התמוססות של Sulfo-תג ב- 50 µL של תיוג מאגר.
- מאגר אנטיגן (5% BSA): ב- 500 מל ל- PBS 1 x, להוסיף 25 גרם של אלבומין שור (BSA).
- להכין פתרון חומצה אצטית 0.5 M.
- 1.0 M של טריס-HCl מאגר pH 9.0: להכין 1 מ' טריס-HCl מאגר ולהתאים pH ל 9.0 עם HCl.
- ציפוי מאגר (3% A חוסם): ב- 500 מל ל- PBS 1 x, להוסיף 15 גרם חוסם א
- מאגר כביסה (0.05% Tween 20, PBST): ב מ 5000 ל 1 x PBS, להוסיף 2.5 מ של Tween 20.
- מאגר הקריאה (2 x במאגר הקריאה T עם חומרים פעילי שטח): ב- 500 מ של מים DD, להוסיף 500 מ של 4 x במאגר הקריאה T עם חומרים פעילי שטח (טבלה של חומרים).
- לאחסן ביוטין Sulfo-תג במקפיא-20 ° C.
הערה: שניהם פתרונות ביוטין ו- Sulfo-תג תמיד להיות מוכנים טרי רק לפני ההליך תיוג.
2. סמן את Autoantigen איון האנושי עם ביוטין, Sulfo-תג
הערה: ריכוז גבוה של אנטיגן, ≥0.5 מ"ג/מ"ל, מומלצת לתגובה תיוג יעיל יותר.
- לקבוע יחס אנושי איון autoantigen טוחנת ביוטין ו Sulfo-תג.
- להשיג את המספר טוחנת אנטיגן על ידי חלוקת המשקל אנטיגן על ידי משקל מולקולרי.
- השתמש טוחנת יחס של 1:5 של אנטיגן עם משקל מולקולרי קטן יותר (≤10 kd), היחס טוחנת של 1:20 עבור אנטיגן עם משקל מולקולרי גדול (> 50 kd).
- לחשב את עוצמת הקול עבור ביוטין או Sulfo-תג על-ידי חלוקת מספר טוחנת את הריכוז שלה.
- מערבבים את autoantigen האנושית איון ביוטין או Sulfo-תג עם שן טוחנת יחס של 1:5.
הערה: החלבון במערכות מאגר טריס או גליצין צריך להחליף כדי 2 x PBS מאגר עם pH 7.9 להשתמש במהדורה אחיזה לשינוי גודל עמודה. - מאז ביוטין המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות רגיש אור Sulfo-תג, לכסות את הצינורות התגובה ברדיד אלומיניום. דגירה התגובה בטמפרטורת החדר (RT) לשעה.
- במהלך הדגירה, פריים העמודה ספין על ידי שחולק 2 x PBS מאגר לתוך העמודה שלוש פעמים. Centrifuge הפתרון ב- 1000 g x למשך 2 דקות בכל פעם.
הערה: כיום התגובה תיוג, דרך גישור, עדיין נמשך ויש להשלימו צריך לעצור. - לעצור את התגובה תיוג וטיהור את autoantigen שכותרתו איון אנושי. לטהר, להעביר את autoantigen דרך העמודה ספין, centrifuge את העמודה ב- 1000 g x למשך 2 דקות.
- לקבוע את הריכוז שכותרתו אנטיגן (µg/µL) באמצעות כמות חלבון אנטיגן ואת אמצעי האחסון הסופי.
הערה: בערך, שם יהיה 90-95% השמירה של אנטיגן שכותרתו לאחר כל עמודות ספין לעבור. - Aliquot אנטיגן שכותרתו וחנות עם התווית אנטיגן ב-80 מעלות צלזיוס.
3. הגדר את ריכוזי הטוב ביותר ואת יחסי עבור שני אנטיגנים עם תוויות עבור וזמינותו (בודק לוח Assay)
- הכנת שתי הדוגמאות סרום, אחד חיובי גבוה ואחד שלילי, עם הנפח הכולל של µL 200 עבור כל אחד.
- Aliquot µL 4 של נסיוב ולהוסיף 1 x PBS עד שאמצעי האחסון הסופי µL 20 לאדם. טוב בשביל צלחת PCR 96-ובכן. השתמש חצי צלחת עבור המדגם חיובי גבוה ואת החצי השני עבור הדגימה שלילית, כפי שמוצג באיור 2A.
- להוסיף 10 µL של ביוטין ו 10 µL של Sulfo-תג כאנטי דילולים טורי אנטיגן והתנהלות עבור שני אנטיגנים באופן שונה עם תוויות, באיור איור 2A. הפעל לדילול טורי אופקי עבור אחד אנטיגן שכותרתו לדילול טורי אנכי עבור אנטיגן שכותרתו אחרים.
- ממשיכים את שאר השלבים assay המתוארים 5.3 כדי 9.1.
- לחשב את היחס של אותות המדגם חיובי גבוה נגד כל אחד האותות המתאים מדגם שלילי שמוצג באיור 2B.
- לזהות את ריכוזי הטוב ביותר עבור ביוטין, Sulfo-תג תווית אנטיגנים על-ידי בחירת הצבע הגבוה ביותר או בסמוך היחס הגבוה ביותר בין חיובי לשלילי. שקול את האות רקע נמוך מן הדגימה שלילית לזהות את היחס.
הערה: Assay יום 1 כולל בשלב 4 לשלב 6.
4. מכינים את המאגר אנטיגן באמצעות הריכוז הנכון של ביוטין/Sulfo-תג תווית אנטיגן
- בחר את ריכוז כל אנטיגן בהתבסס על לוח בודק וזמינותו רציונלי.
- להכין 3 מ"ל של אנטיגן פתרון לכל צלחת, באמצעות הריכוז רציונלית של ביוטין/Sulfo-תג תווית אנטיגן עבור מאגר אנטיגן.
5. דגירה הדוגמאות סרום עם אנטיגן שכותרתו
הערה: ישנם שני הפרוטוקולים בסעיף זה, בלי טיפול החומצה סרום ואחד עם טיפול החומצה סרום. כל מבחני נוגדן עצמי איון מלבד רשות העתיקות assay להשתמש בפרוטוקול רגיל ללא טיפול סרום חומצה מצעדי 5.1 5.5, בעוד רשות העתיקות assay מדלג על שלבים אלה משתמש בפרוטוקול טיפול סרום חומצה מצעדי 5.6 ל 5.9.
- Aliquot µL 4 של נסיוב ולהוסיף 1 x PBS עד שאמצעי האחסון הסופי µL 20 לאדם. טוב בשביל צלחת PCR 96-ובכן.
- הוסף 20 µL של אנטיגן שכותרתו הפתרון לכל טוב.
- מכסים את הצלחת ה-PCR עם איטום רדיד ולהימנע אור.
- לשים את הצלחת על מטרף (מהירות נמוכה)-RT כבר שעתיים.
- לשים את הצלחת במקרר 4 ° C, דגירה לילה (18-24 שעות).
הערה: הפרוטוקול. הבא של צעדים מ 5.6 5.9 נועד רק עבור רשות העתיקות assay ודלג מבחני נוגדן עצמי אחר שלבים אלה. - לערבב 15 µL של סרום עם 18 µL של 0.5 M חומצה אצטית עבור כל דגימה סרום. דגירה תערובת זו ב RT למשך 45 דקות.
- להכין את הפתרון אנטיגן עם הריכוז רציונלית של ביוטין, Sulfo-תג תווית אנטיגן, בהתבסס על לוח בודק וזמינותו, באמצעות מאגר אנטיגן. בכל טוב, aliquot µL 35 מאגר אנטיגן, שמכיל ביוטין ותג Sulfo תוויות אנטיגן, לתוך צלחת PCR חדשה.
- לפני סיום השלב דגירה (שלב 5.6) 45 min, להוסיף µL 8.3 1 מ' טריס pH 9.0 מאגר לצד של כל טוב בצלחת אנטיגן (שלב 5.6). חשוב להגביל את ערבוב בין המאגר טריס אנטיגן. מיד להעביר 25 µL של הסרום, אשר מטופלת עם חומצה, בשלב 5.6, כל טוב, להתסיס את הפתרון. מכסים את הצלחת ה-PCR עם איטום רדיד ולהימנע אור.
- לשים את הצלחת על מטרף (מהירות נמוכה)-RT עבור ה 2 לשים את הצלחת במקרר 4 ° C ולאפשר את הצלחת על דגירה לילה (18-24 שעות).
6. מכינים את הצלחת Streptavidin
- לקחת צלחת streptavidin מהמקרר 4 ° C ולאפשר את הצלחת להגיע RT.
- לאחר הצלחת streptavidin-RT, להוסיף 150 µL של 3% A חוסם כל טוב.
- מכסים את הצלחת ה-PCR עם איטום בנייר כסף.
- דגירה של הצלחת במקרר 4 ° C בלילה.
הערה: Assay יום 2 כולל 7 שלב שלב 9.
7. העברה סרום/אנטיגן דוגר על הלוח Streptavidin
- למחרת, להוציא את הצלחת streptavidin מהמקרר ולמחוק את המאגר מהצלחת. הגדר מגבות נייר יבש על השולחן והקש על הצלחת הפוך עד שיש אין מאגר נוסף בתוך הבארות.
- למלא את הצלחת streptavidin ריק עם 150 µL של PBST לכל טוב וזורקים את PBST מהצלחת עבור סכום של שלושה שוטף.
- העברת 30 µL של סרום/אנטיגן דוגר לכל טוב המשקולת streptavidin.
- כיסוי לצלחת עם נייר כסף כדי להימנע אור. לנער את הצלחת, על קביעת ערך נמוך, ב RT לשעה.
8. לשטוף את הצלחת ולהוסיף במאגר הקריאה
- ביטול דוגר מהצלחת. להוסיף 150 µL של PBST לכל טוב וזורקים את PBST מהצלחת עבור סכום של שלושה שוטף.
- לאחר הרחצה, להוסיף 150 µL לכל טוב של מאגר הקריאה.
הערה: חשוב למנוע בועות אוויר בפתרון, כי זה ישפיע על איך הצלחת לקרוא על המכונה קורא צלחת.
9. קרא את הצלחת וניתוח נתונים
- לספור את הצלחת על המכונה קורא צלחת. נוגדן הערכים מוצגים כמניין לשניה (CPS).
- להעביר רמות נוגדנים התקבל מהמכונה קורא צלחת כאינדקס היחסי. לחשב את האינדקס של המשוואה הבאה:
מדד ערך = [CPS (דוגמה) - CPS (בקרה שלילית)] / [CPS (בקרה חיובית) - CPS (בקרה שלילית)]. - לזהות נוגדנים חיוביים ושליליים תוצאות באמצעות שרשם על הגישה החיובית, מוגדרת בהתבסס על ה-99 של נושאים שליטה בריאים 100 (שאינו חולה סוכרת יחידים ללא מחלות אוטואימוניות ידועות ויש מי אין היסטוריה משפחתית של סוכרת).
Representative Results
איור 2 מציג את לוח המשחק. הוא הראה את 250 ננוגרם למ"ל של ביוטין ו 250 ננוגרם למ"ל של אנטיגן שכותרתו ריכוזים הרציונלית ביותר בשימוש וזמינותו שוקל את אותות מן המדגם בקרת חיובי גבוה, המדגם שליטה שלילי כמו הרקע של וזמינותו, ואת היחס בין Sulfo-תג חיובי לאותות שלילי. עם הריכוזים אופטימיזציה של אנטיגנים שכותרתו שני אלה, וזמינותו בוצעה עם הדוגמאות סרום מ 100 חולים שאובחנו רק לאחרונה עם T1D ופקדים בריא 100. ערך האינדקס של 0.023 הוגדר שרשם assay עבור הגישה החיובית. זה מייצג רגישות של 85% ירידה לפרטים חולים של 99% בפקדים בריא שימוש במקלט הפועלים האופיינית עקומה (ROC) המוצגת באיור 3 א. הבדיקה על הדגימות לא ידוע נערך עם פנימית תוצאות חיוביות סטנדרט גבוה, נמוך תוצאות חיוביות, ודוגמאות שליטה שלילי. התוצאות של הסעיפים CPS מוצגות באיור טבלה 2A. הממוצע CPS של פקדים חיובי גבוה ונמוך מסומנים באדום, [(19940+15866) 17903/2] [(857+820) 839/2], ואת הפקדים שליליים מסומנים בירוק, [(170+165) 168/2]. האינדקס עבור דגימות לא ידוע הוא מחושב על ידי "(CPSמדגם-168)/(17903-168)." 2B הטבלה מציגה את הערכים מחושב אינדקס עבור כל הדגימות. ערכי אינדקס חזק יותר 0.023 נכתבות באדום, המייצגים הערכים CPS נכתב גם באדום טבלת 2A. ניתן להגדיר ערכים אלה התוצאות החיוביות מהערךהאחוזון ה 99 של האוכלוסייה בקרה בריאים . כאשר ריכוז לא רציונלי אנטיגן משמש, וזמינותו יהיה רקע גבוה, כפי שמוצג בטבלה 2 ג רמות נמוכות של נוגדנים חיובי ייחסר כמו הערכים A2, A5, D1 ו- H4 מודגשים באפור בדו מימד טבלה.
איור 1 : איור של לכידה טרינארית צלחת על assay ECL-רשות העתיקות יחיד. איון נוגדן עצמי בהגשרים סרום Sulfo-התג מצומדת אנטיגן כדי אנטיגן לכידת biotinylated, אשר נלכדים בשלב מוצק בצלחת מצופים streptavidin. זיהוי של Sulfo-תג שנלכדו צלחת מצומדת אנטיגן מושגת באמצעות ECL. איור זה שונה מיו, ואח. 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : רוק עקומת לקביעת שרשם של חיוביות assay. האחוזון ה 99. היחודיות המתאים 85% רגישות נבחר, מיוצג כערך אינדקס של 0.023. זה הגבול העליון של וזמינותו נלקח 100 פקדים בריא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : איור של נסיוב אדם נורמלי חוסם אותות ECL-IAA. ת האותות של מבחני ECL-רשות העתיקות עם נוגדנים חד-שבטיים אינסולין (מואב) היו חסומים באופן דרסטי התוספת של נסיוב אדם נורמלי. בעת השוואה בין מואב ב- PBS, האות חלקית שוחזר כאשר הסרום האנושי טופלה עם חומצה. ב': אותות assay ECL-רשות העתיקות עם 4 סרה המטופל היו משופרת באופן משמעותי עם טיפול החומצה. איור זה שונה מיו, ואח. 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : איור של וזמינותו Mutiplex ECL. נוגדן אנטיגן מתחמי נוצרות בשלב-הנוזל עם linkers ספציפיים. מתחמי נוגדן-אנטיגן-מקשר ספציפי מאופקים על כל אחד המקומות מקשר ספציפי של אותה היטב. המכונה קורא צלחת הוא היכולת להבחין את האותות ממקורות שונים המקומות ונותן CPS ספירות בערוצים שונים 10, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
טבלה 1: בודק לוח assay קובע את ריכוזי ואת יחסי של ביוטין ומתויגים Sulfo-תג אנטיגנים. ת: raw CPS נחשב לצלחת לוח בודק עם הסרום חיובי גבוה על חצי צלחת, נסיוב שלילי על החצי השני. הריכוז של אנטיגן biotinylated היה מדולל אופקית בסדרה, הריכוז של Sulfo-תג תווית אנטיגן היה מדולל אנכית בסדרה. ב': יחס ערכי הסעיפים CPS של הסרום חיובי גבוה נגד כל אחד שלהם ספירות CPS המקביל של הסרום שלילי. הבארות המסומן הצהוב מייצג את היחס הטוב ביותר בין חיובי לשלילי לוח ב'... יחס זה מקביל 250 ננוגרם למ"ל ביוטין, 250 ננוגרם למ"ל Sulfo-תג תווית אנטיגן ריכוזים בלוח A עם ספירת CPS נמוך באופן קביל עבור נסיוב שלילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של השולחן הזה.
בטבלה 2: ניתוח של תוצאות assay. ת raw CPS סופרת מהצלחת assay עם הפקדים חיובי גבוה ונמוך סטנדרטי מודגש ובאדום, הפקדים שלילי סטנדרטי מודגשים בירוק. כל מדגם היה בהמסור וזמינותו. ב': אינדקס ערכים חושבו, כמפורט בפרוטוקול וזמינותו. כל ערך אינדקס גדול יותר מאשר 0.023 הוגדרה בתור תוצאה חיובית, המסומנים באדום. C: raw CPS סופרת מהצלחת assay עם אותה קבוצה של דגימות כאשר ריכוז אנטיגן לא רציונלי היה בשימוש. כתוצאה מכך רקע גבוה, כמה תוצאות חיוביות נמוך בדרך כלל זוהה, כפי שמוצג בלוח ב', היו המרה התשלילים, מסומן באפור לוח ד אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של השולחן הזה.
Discussion
איון עצמיים הם כעת סמנים ביולוגיים הכי אמין עבור מחלת חיסון עצמי של סוכרת מסוג 1. הם לסמן את תחילתה של איון ספציפי מחלת חיסון עצמי, לקבוע עבירה מחלות. ECL וזמינותו, עבור איון עצמיים, אומתה בהרחבה לניסויים קליניים סוכרת סוג לאומיים ובינלאומיים 1 מרובים. הבדיקה הראתה רגישות מוגברת וספציפיות לעומת הזרם "זהב" RBAs רגיל. וזמינותו ECL הראו יתרונה מעולה עבור המחלה הם ברמת פירוט גבוהה גבוהה מפלה-זיקה, איון בסיכון גבוה עצמיים מהמודיעין סיכון נמוך, נמוך-זיקה שנוצר על ידי רבא. זה הוא הבחין במיוחד במקצועות שאינם רק נוגדן אחד איון עצמי חיובי, לא התקדמו ל סוכרת מסוג 1. רוב אלה זיקה נמוכה עצמיים נמצאו ללכת לאיבוד במהלך המשך בדיקה נעשה תוך חודשים עד שנים, מתנהג כארעי' חיובי." כפי שצוין בעבר שיערו, אלה זיקה נמוכה סביר 'יחיד' עצמיים נבעה חיסון מולקולה cross-reactive. תוך זיקה גבוהה יותר, גבוה יותר הסיכון איון עצמיים נבעה חיסון עם אנטיגנים איון עצמם. בנוסף, ECL-מבחני הפגינו את היכולת antedate הזמן של 'seroconversion' מ הנוכחי תקן מחייב רדיו מבחני (רבא) על ידי שנים אצל ילדים עם סוכרת טרום, שהיו במעקב קליני לסוכרת מלידה. שוטף הבינלאומי ניסוי קליני, גורמים סביבתיים סוכרת ב יאנג (טדי), תלוי איתור מדויק כדי לאתר במדויק את התזמון ואת המראה של נוגדן עצמי איון הראשון 'seroconversion' כדי לסמן את ראשית דרכו של איון מחלת חיסון עצמי, לזיהוי גורמים סביבתיים. סיבה אפשרית לרגישות מוגברת ב- ECL וזמינותו היא וזמינותו לוכדת כל השיעורים בנוגדנים: IgG, IgM, איגה, או IgE, יותר מאשר מסורתיים רבא או אליסה אשר מסתמכים רק על הגילוי של IgG.
במבחני ECL, עבור כמה עצמיים מסוים כמו רשות העתיקות, הכריכה של עצמיים כדי אנטיגן נראה להיות מעוכבים על ידי רכיבים מסוימים נוכח בנסיוב אדם נורמלי. כדי להסיר או שחרור עיכוב זה, טיפול החומצה הדוגמאות סרום היה צורך לעשות לפני הנסיוב, נדגרה עם אנטיגן. כמו באיור [איור 5], וזמינותו ECL-רשות העתיקות, פעילות האיגוד של נוגדנים חד שבטיים אינסולין את העכבר והן עצמיים של המטופלים סרום עם אנטיגן היה שיפור משמעותי. לחומצי הדוגמאות סרום, בשימוש מבחני נוגדן, מיושם בדרך כלל כדי לבטל שיוך של מתחמי מאוגד הקיימת מראש. המנגנון מאחורי כמה אותות רשות העתיקות עכבות בדגימות בנסיוב אדם ושוחרר על ידי לחומצי סרום אינו ידוע, אך שיטה זו כבר בשימוש אחרים ECL המבוסס על מבחני14,15.
במקרים אחדים, כאשר תיוג מולקולות, ביוטין או Sulfo-תג, positionsinside תיוג של מולקולות חלבון אנטיגן הם, או קרוב מאוד epitopes מפתח של הנוגדן מחייב, אשר עלולים להפריע לפעילות איגוד כדי נוגדנים. זה יהיה להפחית רגישות assay, יכולים להרוס לגמרי את וזמינותו. עבור השגרה תיוג הליך, מקסום או רוויה היא הרצויה עבור כל מולקולה של חלבון אנטיגן לייצר פעילות מקסימלית או אותות לכל מולקולה עם תוויות על-ידי הגדלת קיבולת תיוג של כל תנוחה אפשרית תיוג. תיוג רוויים צריכה להתבצע על-ידי הפחתת יחס טוחנת של תיוג מולקולות (ביוטין ו Sulfo-תג) החלבון אנטיגן אם תיוג על אנטיגן הופך סיבה אפשרית הפרעה לפעילות איגוד נוגדן. רס ן epitopes יכול להיות טוב יותר שמורות, הפרעה של הנוגדן מחייב פעילות יכול להשתחרר באמצעות את אסטרטגיית תיוג רוויים ברוב המקרים.
כל assay צריך לכלול פנימי סטנדרט גבוה חיוביים ושליליים פקד לחישובי אינדקס של דגימות לא ידוע. פקד חיובי נמוך ליד הגבול העליון של וזמינותו של פקדים רגילים חשוב לכלול עבור בקרה של רגישות וזמינותו. המעבדה צריכה לשמור מספיק aliquots של פקדים רגילים חיוביים ושליליים לשימוש ארוך טווח, כל aliquots צריך להיות מאוחסן ב-20 ° C. עבור אבטחת איכות assay, עליך להפעיל את מבחני שבו כפילויות עבור כל דגימה, כל תוצאה חיובית צריך להיות מאושרות על ידי חוזר המדגם ב assay נפרדים. Assay השלישי הכרחי בעת וזמינותו מאשרות השני אינו מסכים עם וזמינותו הראשון ואת התוצאות של מבחני שני, אשר מסכימים (למשל., +, + או-, -), יהיה הקביעה הסופית של תוצאה חיובית או שלילית.
עם פלטפורמת להגדיר עבור מבחני ECL יחיד, assay מרובבת ניתן להרחיב על אלה. זה יכול לקבוע בו זמנית עד 10 עצמיים שונים בבאר יחידה אחת עם כמות זעירה של סרום. כיום, ארבע עצמיים איון כולל רשות העתיקות, GADA IA-2A, ZnT8A שווים בחשיבותם לחיזוי הסיכון של סדר T1D של שני קרובי משפחה של חולים עם T1D של האוכלוסייה הכללית. השיטות מנוצל לסינון אלה עצמיים 4 באמצעות מדידות נוגדן עצמי יחיד הנוכחי הן מייגעת ולא יעיל, במיוחד להקרנה האוכלוסייה בקנה מידה גדול. חשוב, עד 40% של חולים עם T1D יש17,16,מחלה של חיסון עצמי נוספים18. למרבה הצער, אין שום כלי קלה וזולה עבור תנאים אלה מסך. וזמינותו ECL מולטיפלקס היא לא רק המסוגלת שילוב 4 מבחני נוגדן עצמי הנוכחי של איון הגדולות לתוך אחד, אך גם היא היכולת לשלב יותר מבחני נוגדן עצמי יותר ממחלות אוטואימוניות רלוונטיים אחרים. הדבר מאפשר לנהל ביעילות תפוקה גבוהה הקרנת למחלות אוטואימוניות מרובים בו-זמנית אוכלוסיות בקנה מידה גדול. ב וזמינותו ECL מולטיפלקס, כפי שמוצג [איור 6], כל מתחם נוגדן אנטיגן נוצר הנוזל-בשלב יהיו מרוסנים למקום מקור ספציפי מקשר אותו היטב. קולט האותות בממיר המכונה קורא צלחת הוא מסוגל לזהות את האותות ממקורות שונים 10 נקודות. עם זאת, המקומות עם אות גבוהה מאוד ניתן ליצור רקע וזמינותו גבוהים, לגרום להפרעה למקומות שכנות באמצעות צולבות לדבר. מסיבה זו, האותות הגבול העליון עבור כל assay נוגדן עצמי צריך להיות מוגבל פחות מ-20,000 ספירות. מניסיוננו, עצמיים עם רקע התחתון צריך להיות ממוקם יחסית רחוק מנקודות אלה בעל עבירות גבוהה יותר כאשר המפה ספוט מיועד. עבור מחקרים ארוכי טווח באמצעות מבחני ECL מולטיפלקס, מומלץ כי מקשר אותו לשמש וזמינותו נוגדן עצמי אותו כדי לשמור על עקביות וזמינותו.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH הענק DK32083, האגודה לסוכרת נעורים גראנט 2-SRA-2015-51-Q-R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human recombinant proinsulin protein(PINS) | AmideBio | Human Proinsulin, Rec | |
| Human recombinant GAD65 protein | Diamyd | rhGAD65 | |
| Human recombinant IA-2 protein | Creative BioMart | IA2 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA-ALORICH | A7906-500G | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| Streptavidin coated plate | MSD | L15SA | |
| Zeba sizing spin column | Thermo Fisher Scientific | 89890 | |
| Twen-20 | Fisher | BP337-500 | |
| HCl | Fisher | A144-500 | |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
| EZ-Link Biotin | Thermo Fisher Scientific | PI21329 | |
| Sulfo-tag | MSD | R91AO-1 | |
| Blocker A | MSD | R93AA-1 | |
| 4x Read Buffer T with Surfactant | MSD | R92TC-1 | |
| EZ-Link NHS-PEG4-Biotin | ThermoScience | 21329 | |
| Sulfo-TAG | MSD | R91AO-1 | |
| 96-well polymerase chain reaction (PCR) plate | Fisher brand | 14230232 | |
| 96-Well Streptavidin plate | MSD GOLD | L 15SA-1 | |
| Zeba Spin Desalting Column | ThermoScience | PL208984 | |
| 96-well Plate Shaker | Perkin Elmer | 1296-003 | |
| Plate Reader | MSD | QuickPlex SQ120 | |
| Benchtop centrifuge with bucket rotary | Beckman | Allegra X-15R |
References
- Insel, A. I., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S. Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. Lancet. 358 (9277), 221-229 (2001).
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
- Steck, A. K., et al. TEDDY Study Group. Predictors of progression from the appearance of islet autoantibodies to early childhood diabetes: The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY). Diabetes Care. 38 (5), 808-813 (2015).
- Krischer, J. P., et al. TEDDY Study Group. The 6 year incidence of diabetesassociated autoantibodies in genetically at-risk children: the TEDDY study. Diabetologia. 58 (5), 980-987 (2015).
- Achenbach, P., et al. Stratification of type 1 diabetes risk on the basis of islet autoantibody characteristics. Diabetes. 53 (2), 384-392 (2004).
- Achenbach, P., Bonifacio, E., Koczwara, K., Ziegler, A. G. Natural history of type 1 diabetes. Diabetes. 54 (Suppl. 2), S25-S31 (2005).
- Steck, A. K., et al. Age of islet autoantibody appearance and mean levels of insulin, but not GAD or IA-2 autoantibodies, predict age of diagnosis of type 1 diabetes: diabetes autoimmunity study in the young. Diabetes Care. 34 (6), 1397-1399 (2011).
- Achenbach, P., Koczwara, K., Knopff, A., Naserke, H., Ziegler, A. G., Bonifacio, E. Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes. J Clin Invest. 114 (4), 589-597 (2004).
- Yu, L., Dong, F., Miao, D., Fouts, A. R., Wenzlau, J. M., Steck, A. K. Proinsulin/insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
- Yu, L., Miao, D., Scrimgeour, L., Johnson, K., Rewers, M., Eisenbarth, G. S. Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
- Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
- Yu, L. Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay. Methods Mol Biol. 1433, 85-91 (2016).
- Myler, H. A., McVay, S., Kratzsch, J. Troubleshooting PEG-hGH detection supporting pharmacokinetic evaluation in growth hormone deficient patients. J Pharmacol Toxicol Methods. 61 (2), 92-97 (2010).
- Zhong, Z. D., Dinnogen, S., Hokom, M., et al. Identification and inhibition of drug target interference in immunogenicity assays. J Immunol Methods. 355 (1-2), 21-28 (2010).
- Barker, J. M., Yu, J., Yu, L., Wang, J., Miao, D., Bao, F., et al. Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups. Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).
- Triolo, T. M., Armstrong, T. K., McFann, K., Yu, L., Rewers, M. J., Klingensmith, G. J., et al. Additional autoimmune disease found in 33% of patients at type 1 diabetes onset. Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).
- de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus. Neth J Med. 65 (7), 235-247 (2007).
