यहां, हम electrochemiluminescence (ECL) परख का उपयोग मानव टाप एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए तरीके प्रस्तुत किया । प्रोटोकॉल, प्रकार की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया 1 मधुमेह, अन्य स्व-प्रतिरक्षित रोगों के लिए स्वतः एंटीबॉडी का पता लगाने पर विस्तारित किया जा सकता.
टाइप-1 से जुड़े टाप-एंटीबॉडी को तुच्छ करना मधुमेह (T1D) परियोजना के लिए रास्ता है और आम जनता में इस बीमारी रोकते जाता है । एक उपंयास ECL परख उच्च संवेदनशीलता और वर्तमान ‘ सोने ‘ मानक रेडियो-बाध्यकारी परख (RBA) से विशिष्टता के साथ टाप एंटीबॉडी के लिए एक रेडियोधर्मी द्रव चरण परख है । ECL परख और अधिक ठीक उच्च जोखिम, कम जोखिम से उच्च-अपनत्व एंटीबॉडी भेद द्वारा रोगसूचक T1D की शुरुआत को परिभाषित कर सकते हैं, कम संबंध RBAs में उत्पंन एंटीबॉडी, और पारंपरिक एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा ). इस ECL परख में इस्तेमाल किया प्रतिजन प्रोटीन Sulfo के साथ लेबल-टैग और बायोटिन, क्रमशः है । प्रत्येक ECL autoantibody परख है कि एक विशेष प्रतिजन प्रोटीन का उपयोग करता है एक अनुकूलन कदम से पहले यह प्रयोगशाला आवेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की जरूरत है । यह कदम विशेष रूप से सीरम एसिड उपचार, सांद्रता, और Sulfo-टैग और बायोटिन के साथ लेबल दो अलग प्रतिजनों के अनुपात के लिए आवश्यकताओं का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण है । परख करने के लिए, सीरम नमूने Sulfo-टैग-संयुग्मित और biotinylated कैप्चर antigen में फास्फेट बफ़र्ड समाधान (पंजाब), 5% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) युक्त प्रोटीन के साथ मिश्रित कर रहे हैं । बाद में, नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर की मशीन हैं । एक ही दिन, एक streptavidin-लेपित प्लेट अवरोधक बफर के साथ तैयार किया जाता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात गर्मी । दूसरे दिन, streptavidin प्लेट को धो लें और सीरम-प्रतिजन मिश्रण को प्लेट पर ट्रांसफर कर दें । प्लेट शेखर पर प्लेट रखें, यह कम गति पर सेट, और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर मशीन । बाद में, प्लेट फिर से धोया जाता है, और पाठक बफर जोड़ा जाता है । इसके बाद प्लेट रीडर मशीन पर गिनी जाती है । परिणाम एक सूचकांक है, जो आंतरिक मानक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण सीरम नमूनों से उत्पंन होता है के माध्यम से अवगत करा रहे हैं ।
एक हाल ही में मचान वर्गीकरण प्रणाली रोगियों में T1D के प्रारंभिक चरणों के निदान के साथ सहायता करने के लिए बनाया गया है । मानव टाप एंटीबॉडी का सटीक पता लगाने की पहचान करने और प्रतीकात्मक प्रकार 1 मधुमेह, के रूप में टाप एंटीबॉडी की उपस्थिति β-सेल प्रतिरक्षा की उपस्थिति को इंगित करता है में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । दर जिस पर मधुमेह β-कोशिका की उन्मुक्ति की प्रारंभिक घटना से रोगियों को प्रभावित रोगसूचक रोग, संख्या और टाप एंटीबॉडी के प्रकार के साथ जुड़े, चर है2,3.
autoantibody seroconversion की आयु, titer, और टाप एंटीबॉडी के अपनत्व की प्रगति की दर को प्रभावित कर सकते हैं रोगसूचक प्रकार 1 मधुमेह4,5,6,7,8 ,9,10. हाल ही में, विकसित ECL परख बड़े पैमाने पर मांय किया गया है, वृद्धि की संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया है, और अधिक रोग है विशिष्ट10,11,12,13। इन परख की भविष्यवाणी को बढ़ाने और टाप एंटीबॉडी के पहले का पता लगाने के माध्यम से मधुमेह जोखिम के मचान । वे और अधिक ठीक टाप उन्मुक्ति की दीक्षा चिह्नित और कम आत्मीयता और कम जोखिम मधुमेह के लिए प्रासंगिक नहीं संकेतों की अनदेखी.
एक ECL परख में, सीरम में एंटीबॉडी, अगर मौजूद है, Sulfo-टैग-संयुग्मित प्रतिजन द्रव चरण में biotinylated कब्जा प्रतिजन के लिए पुल । पाटने के बाद, बायोटिन लिंकर ठोस चरण में पकड़ा और streptavidin लेपित प्लेट पर Sulfo-टैग द्वारा ECL के माध्यम से पता चला (चित्रा 1) ।
इस समीक्षा में, एकल एंटीबॉडी ECL परख मानव टाप एंटीबॉडी के साथ मुख्य रूप से उपयोग किया जाता है । संक्षेप में, मल्टीप्लेक्स एंटीबॉडी एकल ECL परख पर आधारित परख चर्चा की जाएगी । मल्टीप्लेक्स परख के लिए कई की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, 10, एक के भीतर एंटीबॉडी एक अच्छी तरह से, सीरम के 15 µ एल का उपयोग कर । यह सरल उच्च प्रवाह परख स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एक साथ, कई आम जनता में प्रासंगिक कई स्व प्रतिरक्षा रोगों के लिए एंटीबॉडी ।
टाप एंटीबॉडी वर्तमान में प्रकार की प्रतिरक्षा के लिए सबसे अधिक विश्वसनीय मार्क्स हैं 1 मधुमेह. वे टाप विशिष्ट उन्मुक्ति की शुरुआत के निशान और प्रकट रोग जोखिम निर्धारित करते हैं । ECL परख, टाप एंटीबॉडी के लिए, बड़े पैमाने पर किया गया है कई राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय प्रकार में मान्य 1 मधुमेह नैदानिक परीक्षण. परख में वृद्धि की संवेदनशीलता और विशिष्टता के रूप में वर्तमान ‘ गोल्ड ‘ मानक RBAs की तुलना में दिखाया गया है । ECL परख उच्च रोग विशिष्टता और उच्च जोखिम कम जोखिम, कम से RBA द्वारा उत्पंन-अपनत्व के संकेतों से भेदभाव के द्वारा उच्च बीमारी विशेष के लिए अपने बेहतर लाभ दिखाया गया है । यह विशेष रूप से विषयों जो केवल एकल टाप autoantibody सकारात्मक है और टाइप करने के लिए कभी नहीं प्रगति की है में देखा है 1 मधुमेह । इन कम संबंध के अधिकांश एंटीबॉडी को अनुवर्ती साल के भीतर किया परीक्षण के दौरान खो पाए थे, ‘ एक क्षणिक सकारात्मक रूप में बर्ताव । के रूप में पहले से कल्पना की, इन कम ‘ समानता ‘ एकल एंटीबॉडी की संभावना एक पार से प्रतिक्रियाशील अणु के साथ प्रतिरक्षण से हुई । जबकि उच्चतर संबध, उच्चतर जोखिम टाप करने वाले स्वयं के साथ प्रतिरक्षण से हुआ इसके अलावा, ECL-परख पूर्व मधुमेह के साथ बच्चों में वर्षों से वर्तमान मानक रेडियो-बाध्यकारी परख (RBA) से ‘ seroconversion ‘ के समय antedate करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है, जो जंम से नैदानिक मधुमेह के लिए पीछा किया गया । एक चल रहे अंतरराष्ट्रीय नैदानिक परीक्षण, युवा (टेडी) में मधुमेह के पर्यावरणीय निर्धारकों, सटीक पता लगाने के लिए समय और उपस्थिति इंगित करने के लिए सबसे पहले टाप autoantibody ‘ seroconversion ‘ को निशाना बनाना टाप की शुरुआत बहुत प्रतिरक्षा और पर्यावरण ट्रिगर की पहचान करने के लिए । ECL परख में वृद्धि की संवेदनशीलता के लिए एक संभावित कारण यह है कि परख सभी immunoglobulin वर्गों कब्जा: आईजीजी, आईजीएम, IgA, या IgE, बल्कि पारंपरिक RBA या एलिसा जो केवल आईजीजी का पता लगाने पर निर्भर से ।
ECL परख में, आईएए जैसे कुछ विशेष एंटीबॉडी के लिए, प्रतिजन के लिए एंटीबॉडी के बंधन को कुछ सामांय मानव सीरम में मौजूद घटक द्वारा बाधित लगता है । निकालने के लिए या इस निषेध जारी, सीरम नमूनों की एसिड उपचार के लिए पहले सीरम प्रतिजन के साथ किया गया था करने के लिए आवश्यक था । [चित्रा 5] में दिखाया गया है, ECL-आईएए परख, दोनों माउस इंसुलिन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और ‘ रोगियों सीरम एंटीबॉडी के प्रतिजन के साथ बाध्यकारी गतिविधियों बहुत बढ़ाया गया था । सीरम नमूनों की अंलीकरण, एंटीबॉडी परख में इस्तेमाल किया, आमतौर पर असंबद्ध पूर्व मौजूदा जटिल परिसरों के लिए लागू है । कैसे आईएए संकेतों मानव सीरम के नमूनों में हिचक रहे है और सीरम के अंलीकरण द्वारा जारी के पीछे तंत्र ज्ञात नहीं है, लेकिन इस विधि अंय ECL में इस्तेमाल किया गया है परख14,15आधारित है ।
कुछ मामलों में, जब अणुओं लेबल, या तो बायोटिन या Sulfo-टैग, प्रतिजन प्रोटीन अणुओं के लेबलिंग positionsinside पर हैं, या बहुत एंटीबॉडी बाध्यकारी है, जो एंटीबॉडी के लिए बाध्यकारी गतिविधि के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं की कुंजी epitopes के करीब । यह परख संवेदनशीलता कम हो जाएगा और पूरी तरह से नीचे परख आंसू कर सकते हैं । नियमित लेबलिंग प्रक्रिया के लिए, अधिकतम या संतृप्ति प्रत्येक प्रतिजन प्रोटीन अणु के लिए वांछित हर संभव लेबलिंग की स्थिति की लेबलिंग क्षमता को अधिकतम करने के द्वारा प्रति लेबल अणु के अनुसार अधिक से अधिक गतिविधि या संकेत उत्पंन करने के लिए है । unसंतृप्त लेबलिंग अणुओं का दाढ़ अनुपात को कम करने के द्वारा किया जाना चाहिए (बायोटिन और Sulfo-टैग) antigen प्रोटीन पर लेबलिंग एंटीबॉडी बाइंडिंग गतिविधि के व्यवधान के लिए एक संभावित कारण हो जाता है । प्रमुख epitopes बेहतर आरक्षित किया जा सकता है और एंटीबॉडी बाध्यकारी गतिविधि के व्यवधान ज्यादातर मामलों में unसंतृप्त लेबलिंग रणनीति का उपयोग कर जारी किया जा सकता है ।
प्रत्येक परख अज्ञात नमूनों की सूचकांक गणना के लिए एक आंतरिक मानक उच्च सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण शामिल करना चाहिए । सामांय नियंत्रण की है परख ऊपरी सीमा के पास एक कम सकारात्मक नियंत्रण के लिए परख संवेदनशीलता की निगरानी के लिए शामिल महत्वपूर्ण है । प्रयोगशाला लंबी अवधि के उपयोग के लिए मानक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के पर्याप्त aliquots रखना चाहिए और सभी aliquots-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए । परख गुणवत्ता आश्वासन के लिए, परख प्रत्येक नमूने के लिए डुप्लिकेट में चलाया जाना चाहिए और हर सकारात्मक परिणाम एक अलग परख में नमूना दोहरा द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए । एक तिहाई परख आवश्यक है जब दूसरी पुष्टि परख पहले परख और दो परख है, जो सहमत के परिणाम के साथ सहमत नहीं है (उदा, +, + या-,-), एक सकारात्मक या नकारात्मक परिणाम के अंतिम निर्धारण किया जाएगा ।
एकल ECL परख के लिए निर्धारित मंच के साथ, एक मल्टीप्लेक्स की परख इन पर विस्तार किया जा सकता है । यह एक साथ एक अच्छी तरह से सीरम की एक छोटी राशि के साथ एक में 10 अलग एंटीबॉडी को निर्धारित कर सकते हैं । वर्तमान में, चार आईएए, गड़, IA-2a, और ZnT8A सहित टाप एंटीबॉडी T1D और आम जनता के साथ रोगियों के दोनों रिश्तेदारों में T1D करने के लिए प्रगति की जोखिम भविष्यवाणी के लिए महत्व में बराबर हैं । इन 4 वर्तमान एकल autoantibody माप का उपयोग कर एंटीबॉडी स्क्रीनिंग के लिए उपयोग के तरीकों श्रमसाध्य और अक्षम हैं, विशेष रूप से बड़े पैमाने पर जनसंख्या स्क्रीनिंग के लिए । महत्वपूर्ण बात, T1D के साथ रोगियों के 40% तक एक अतिरिक्त स्व-प्रतिरक्षित हालत16,17,18है । दुर्भाग्य से, इन स्थितियों के लिए स्क्रीन करने के लिए कोई आसान और सस्ती उपकरण है । मल्टीप्लेक्स ECL परख केवल एक में 4 वर्तमान प्रमुख टाप autoantibody परख के संयोजन में सक्षम नहीं है, लेकिन यह भी करने में सक्षम है और अंय प्रासंगिक स्व प्रतिरक्षित रोग से अधिक autoantibody परख गठबंधन । यह यह कुशलतापूर्वक बड़े पैमाने पर आबादी में एक साथ कई स्व-प्रतिरक्षित रोगों के लिए उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग का संचालन करने के लिए संभव बनाता है । मल्टीप्लेक्स ECL परख में, के रूप में [चित्रा 6] में दिखाया गया है, प्रत्येक एंटीबॉडी-प्रतिजन द्रव-चरण में गठित परिसर में एक ही अच्छी तरह से एक विशिष्ट linker स्रोत स्थान पर रोका जाएगा । प्लेट रीडर मशीन पर सिग्नल रिसीवर स्पॉट के 10 विभिन्न स्रोतों से संकेतों को पहचान करने में सक्षम है । हालांकि, एक बहुत ही उच्च संकेत के साथ स्पॉट एक उच्च परख पृष्ठभूमि उत्पंन और परस्पर बात के माध्यम से पड़ोसी धब्बे को हस्तक्षेप के कारण कर सकते हैं । इस कारण से, प्रत्येक autoantibody परख के लिए ऊपरी सीमा संकेतों से कम 20,000 गिनती तक सीमित होना चाहिए । हमारे अनुभव में, कम पृष्ठभूमि के साथ एंटीबॉडी अपेक्षाकृत दूर रखा जाना चाहिए उन स्थानों से उच्च गिनती होने जब स्पॉट मानचित्र बनाया गया है । मल्टीप्लेक्स ECL की परख का उपयोग करते हुए दीर्घकालिक अध्ययनों के लिए यह सिफारिश की गई है कि इसी linker का इस्तेमाल इसी autoantibody परख के लिए किया जाए ताकि परख सुसंगत रहें.
The authors have nothing to disclose.
यह काम NIH ग्रांट DK32083, JDRF ग्रांट 2-SRA-2015-51-क्यू-आर द्वारा समर्थित किया गया ।
Human recombinant proinsulin protein(PINS) | AmideBio | Human Proinsulin, Rec | |
Human recombinant GAD65 protein | Diamyd | rhGAD65 | |
Human recombinant IA-2 protein | Creative BioMart | IA2 | |
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
10x PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA-ALORICH | A7906-500G | |
96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
Streptavidin coated plate | MSD | L15SA | |
Zeba sizing spin column | Thermo Fisher Scientific | 89890 | |
Twen-20 | Fisher | BP337-500 | |
HCl | Fisher | A144-500 | |
NaOH | Fisher | SS255-1 | |
Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
EZ-Link Biotin | Thermo Fisher Scientific | PI21329 | |
Sulfo-tag | MSD | R91AO-1 | |
Blocker A | MSD | R93AA-1 | |
4x Read Buffer T with Surfactant | MSD | R92TC-1 | |
EZ-Link NHS-PEG4-Biotin | ThermoScience | 21329 | |
Sulfo-TAG | MSD | R91AO-1 | |
96-well polymerase chain reaction (PCR) plate | Fisher brand | 14230232 | |
96-Well Streptavidin plate | MSD GOLD | L 15SA-1 | |
Zeba Spin Desalting Column | ThermoScience | PL208984 | |
96-well Plate Shaker | Perkin Elmer | 1296-003 | |
Plate Reader | MSD | QuickPlex SQ120 | |
Benchtop centrifuge with bucket rotary | Beckman | Allegra X-15R |