Summary
Sinerjik uyuşturucu zor ve zaman alıcı ampirik olarak tanımlamak oluşur. Burada, belirlenmesi ve sinerjik küçük moleküller doğrulama yöntemi açıklanmaktadır.
Abstract
Antimikrobiyal ilaçlar önemli ölçüde yaşam kalitesi ve ömrü 20inci yüzyılda artmıştır rağmen antimikrobiyal direnç tüm toplumumuzun yetenek sistemik enfeksiyonları tedavisi için tehdit ediyor. Yalnız Amerika Birleşik Devletleri'nde, antibiyotik dirençli enfeksiyonlar bir yıl ve maliyeti yaklaşık 20 milyar YTL ek sağlık hizmetlerinde yaklaşık 23.000 kişi öldür. Antimikrobiyal direnç mücadele için bir yaklaşım bulaşmasını organizma ve onun ilaç direnci profil tespit edilmiştir önce enfeksiyon, kritik erken dönemde özellikle yararlı olan kombinasyon tedavisi olduğunu. Birçok antimikrobiyal tedavi kombinasyon tedavileri kullanın. Ancak, bu kombinasyonlar çoğu katkı, Birleşik etkinlik bireysel antibiyotik etkinliğini toplamı ile aynı olduğu anlamına gelir. Bazı kombinasyon tedavileri sinerjik: Birleşik etkinlik katkı daha çok daha büyüktür. Antimikrobiyal ilaç dirençli suşların büyümesini inhibe çünkü sinerjik kombinasyonları özellikle yararlıdır. Ancak, bu kombinasyonlar nadir ve tespit etmek zordur. Bu ikili bir şekilde test edilmesi için gerekli molekülleri sayısının çokluğu kaynaklanmaktadır: 1 milyon potansiyel kombinasyon 1.000 moleküllerin bir kütüphane bulunmaktadır. Böylece, çabaları molekülleri sinerji tahmin etmek için yapılmıştır. Bu makalede çakışma2 yöntemi (O2M) bilinen sinerjik küçük molekül çiftleri oluşabileceğini bizim yüksek-den geçerek yöntemi. O2M desen kimyasal genetik veri kümesinden gelen aşırı duyarlı her molekül sinerjik bir çift, ancak diğer molekülleri mutantlar tanımlamak için kullanır. Kahverengi laboratuvar mutant ama değil vahşi türü hücre büyümesini inhibe molekülleri yüksek üretilen iş ekran gerçekleştirerek bu büyüme fark patlatır. Laboratuar çalışma daha önce antibiyotik trimetoprim ve bu strateji kullanarak antifungal ilaç flukonazol ile synergize molekülleri tanımlanmış. Burada, yazarlar için birden fazla mikroorganizmaların değiştirilebilir roman sinerjik birleşimler için ekran için bir yöntem mevcut.
Introduction
Antibiyotik dirençli bakteri 2 milyondan fazla enfeksiyonları ve 23.000 ölümlerin her yıl Amerika Birleşik Devletleri'nin CDC1göre neden. Yeni tedaviler bunlar hastalık üstesinden gelmek için ihtiyaç vardır. Bu yeni tedaviler tanımlamak için stratejiler geliştirme yeni antimikrobiyal ilaçların veya küçük moleküller diğer koşullar mikrobiyal enfeksiyonlar2,3,4tedavisi onaylanmış repurposing içerir. Ancak, yeni ilaç keşfi çok pahalı ve zaman alıcı. Uyuşturucu repurposing roman uyuşturucu tanıtabilecek değil veya uyuşturucu5,6hedefler. Laboratuarımızın sinerjik kombinasyon tedavileri bilinen üçüncü bir strateji üzerinde duruluyor. İki küçük molekül birlikte onların bireysel efficacies7katkı etkisi büyük bir etkinlik var sinerjik kombinasyon oluşur. Ayrıca, sinerjik kombinasyonları bir patojen dayanıklı onları büyük potansiyel8,9işleme ek olarak daha az istenmeyen hedef dışı etkilere sahip çift küçük moleküllerin birine karşı etkili olabilir, 10.
Sinerjik çiftleri uyuşturucu kombinasyonları11,12,13yaklaşık % 4-10 meydana nadirdir. Böylece, geleneksel teknikleri ikili ekranlar gibi zor ve zaman alıcı, küçük bir kütüphane üzerinden potansiyel kombinasyon yüz moleküllerin binlerce vardır. Ayrıca, sinerjik etkileşim genellikle bileşikler14aktivitesinden bilinemez. Ancak, yazarlar için örtüşme2 yöntemi (O2M)12olarak adlandırılan sinerjik çiftlerini ekran yüksek üretilen iş yaklaşımı geliştirdi. Burada, açıklanan bu yöntem bu sinerjik çiftleri daha hızlı, daha verimli tanımlanması için sağlar. O2M bilinen bir sinerjik çift ve bir kimyasal-genetik veri kullanımını gerektirir. Nakavt mutantlar Kütüphanesi birçok farklı küçük molekül huzurunda yetiştirilen kimyasal-genetik veri kümeleri oluşturulur. Bir molekül bilinen bir sinerjik çiftindeki ikinci sinerjik molekül olarak belirli nakavt mutant üzerinden fenotip aynı neden olmaktadır, aynı bu mutant üzerinden fenotip aydınlığa çıkartıyor diğer küçük molekül de bilinen her üye ile synergize sinerjik çifti. Bu mantığı kahverengi laboratuarda sinerjik antibiyotik çiftleri Escherichia coli (e.coli) karşı etkin ve sinerjik antifungal ilaç çiftleri patojenik mantar Cryptococcus neoformans (C. karşı etkin tanımlamak için kullanılmıştır neoformans)11,12. O2M sadece çeşitli patojenler için uyarlanabilir değil ama büyük Kütüphaneler moleküllerin tarama için kolayca ve hızla sinerjik çiftleri tanıtılmasına olanak sağlar. O2M tarafından tanımlanan genetik mutant ile tarama sadece sinerji için öngörülen küçük moleküller doğrulamak için bize izin verir. Olsaydı bile sadece 20 molekülleri synergize tahmin bu kitaplıkta, sinerji için şimdi test birkaç gün sürer, ancak böylece, 2.000-molekül kitaplığa ikili test ay, alır. O2M programlama bilgisi gerektirmez ve gerekli ekipman çoğu labs veya çekirdek imkanları mevcuttur. Araştırmacılar yanı sıra uyuşturucu kombinasyonlarda baktılar, O2M analiz bir uyuşturucu testi tamamladı ve önemli ilaç-ilaç etkileşimleri tespit ederek onların sayısı genişletmek isteyen herkese ilgilendirir. Aşağıda bakteri sinerjik küçük moleküllerin belirlenmesi gibi iyi bilinen deneyleri15,16öngörülen sinerjik etkileşim doğrulama protokolüdür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sinerji tahmin mutantlar örtüşme2 yöntemi (O2M) DataSet'in kimyasal-genetik üzerinden belirlenmesi
Not: Bu sinerji tahmin mutantlar Nichols ve arkiçin yayımlanan veri kümesi kullanarak tanımlamak için yöntemidir. 17 E. coli'. Ancak, bu herhangi bir kimyasal-genetik veri kümesi ve mikroorganizma yapılabilir. Bu veri kümeleri 100'den fazla küçük moleküller varlığında, yetiştirilen nakavt mutantlar için her küçük molekül her mutant bir kantitatif büyüme puan veren kütüphanesi içerir. İki tane sinerjik bilinmesi gereklidir ve büyüme puanları dahil veri kümesindeki her iki küçük moleküller için olmalıdır.
-
Tüm mutantlar her küçük molekül tek bir konsantrasyon huzurunda yetiştirilen ortalama büyüme puanı ve standart sapmayı hesaplayın.
Not: Bu yapılabilir herhangi bir elektronik tablo yazılımı kullanarak. Kahverengi laboratuvar Excel ve işlevlerini kullanır =AVERAGE(B3:B3981) ve =STDEV(B3:B3981) küçük molekül her sütununun hesaplamalar için.- Bu yönlendirme Eğer farklı bir veri kümesi kullanarak farklı olabilir rağmen anlamına gelir ve standart sapmalar küçük molekül, her sütundaki hesaplayın.
- Küçük molekül Nichols ve diğerleriiçin aynı veri kümesi kullanarak her konsantrasyon için Z puanları hesaplayın. 17 bir elektronik sayfa programında. Bunun için Z(2.5) negatif z skorları olacak = demek - 2,5 * standart sapma ve pozitif z score-ecek var olmak Z(2.5) = ortalama + 2,5 * standart sapma.
- Bu moleküller tüm konsantrasyonları bakmak için emin olmak bilinen sinerjik çifti oluşturan küçük moleküller önemli Z skorları mutantlar hangi gen içeren belirlemek. Bir mutant puan büyüme daha az negatif Z (2.5) puan edinildi veya bu küçük molekül için pozitif Z (2.5) puan daha büyük, önemli kabul edilir.
- Herhangi bir önemli gen mutantlar bir operon ait belirlemek.
Not: E. coliiçin yazarlar tavsiye "Ecoli wiki" bilgi için kontrol eğer bir polycistronic RNA parçası olarak genlerin transkripsiyonu ile ilgili olarak. - Farklı konsantrasyonlarda ilgi küçük moleküller çoğunluğu için ortak gen/operon mutantlar tanımlamak (Örn., antibiyotik trimetoprim ile synergize molekülleri tanımlamak için önemli bir Z gösteren mutantlar ararken ««puan) huzurunda trimetoprim ve bilinen sinerjik ortakları sulfamethizole veya sulfamethoxazole gibi büyüdü. Bunlar sözde sinerji tahmin mutantız.
2. Synergizers O2M kimyasal-genetik Dataset içinde tahmin
- Veri kümesi17' ye dönersek, sinerji tahmin mutant bir önemli bir büyüme puanı aydınlığa çıkartıyor küçük molekül her konsantrasyonu belirlemek. Bu küçük moleküller her konsantrasyon için hesaplanan Z skorları bakarak yapılır. Yine, bir önemli bir büyüme puan olumsuz Z skor veya küçük molekül bu konsantrasyon için pozitif Z puanı daha büyük olan.
Not: bir molekül bile onun konsantrasyonları birinde görüntülenirse, molekül tahmin edilen bir synergizer olarak kabul edilir. Önemli bir büyüme puanı temin etmez herhangi bir tahmin edilen sigara synergizer moleküldür.
3. öngörülen sinerjik etkileşim doğrulama
- Tahmin edilen synergizers minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) bulma.
- E. coli bir gecede kültür 37 ° C'de M9 en az medyada büyümek
Not: Herhangi bir gecede kültür faiz organizma için uygun şekilde tanımlanmış ortamda yetiştirilen olabilir. Kahverengi laboratuvar LB veya YPD gibi zengin medya önermez. M9 en az medya 10.5 g/L M9 suyu, %0,2 casamino asitler, 0.1 M CaCl2, % 0,4 glikoz, 1 M MgSO4, % 0.25 Nikotinik asit ve %0,33 tiamin H2o oluşur - Eğer patojen ilgi küçük moleküller alınması üzerine literatürde bulundu mikrofon veri yüksek bir konsantrasyon dimetil sülfoksit (DMSO) dağıtılması (> 10 mg/mL).
- 96-şey plaka kullanarak 100 µL M9 medya her şey için ekleyin. Toplam 200 µL içerecek şekilde bir ekstra 100 µL M9 medya sütun 1 ekleyin.
- Çoklukta (~ 10 µL) konsantre küçük molekül çözüm 1 sütun ekleyin. Sütun 1 (8 plaka küçük moleküller) kuyu başına bir küçük molekül.
Not: Bu synergize tahmin edilmektedir küçük moleküller ilgi vardır. Kahverengi laboratuvar genellikle yüksek konsantrasyonlu küçük molekül çözümün E. coliinhibe olabilir % 100 DMSO miktarın altına olan 10 µL ekler. - Küçük moleküller eklendikten sonra küçük moleküller plaka x ekseni oranında seyreltin. 100 µL çözüm sütun 1, sütun 2 yer alıp karıştırın. 100 µL sütun 2, 3 sütun içinde yer alıp karıştırın. 100 µL yerleştirilir kadar 11 sütununda bu işleme devam edin. Sütun 11 karıştırın, sonra o sütundaki 100 µL alıp atmak. Sütun 12 ile sadece medya verileri normalleştirmek için bırakın.
- Plaka aşılamak. Optik yoğunluk (OD600) bir gecede kültür elde etmek. Kültür ve OD600 0,002 itibaren M9 medyaya bir çözüm hazırlamak (veya uygun 500 hücre/µL ilgi istenen organizma için temsil eden konsantrasyon). Yani iyi başına 1.000 hücre kültür çözüm 2 µL plaka her kuyuya pipet.
- Yavaşça plaka sallamak ve 0 h okuma OD600 elde edilir. Plakayı 24 h 24 h okuma OD600 elde edilir için 37 ° C'de büyümeye izin.
Not: Kullanım uygun diğer organizmalar için koşullar ilgi büyüyor. - Her şey bir elektronik tablo programı kullanmanız için net büyüme hesaplamak.
- Ortalama hiçbir ilaç büyüme elde etmek için sütun 12 net büyüme ortalama. Bir elektronik tablo yazılımı kullanarak hiçbir ilaç büyüme ortalaması için diğer wells normalleştirmek. Bakmak için herhangi bir şey ile az % 10 büyüme MIC90 tanımlamak için. Herhangi bir MIC50 büyüme de az %50 ile gösterir. Bu Wells küçük molekül konsantrasyonu hesaplayın.
- E. coli bir gecede kültür 37 ° C'de M9 en az medyada büyümek
- Dama tahtası deneyleri sinerjik etkileşim için
- E. coli bir gecede kültür medyada M9 en az önce büyümek.
Not: Uygun kullanım koşulları diğer organizmalar için büyüyen. - Her şey bir 96 iyi tabak ve bir ekstra 100 µL sütun 1 100 µL M9 medya ekleyin.
- Test küçük molekül eklemek (~ 8 MIC x) her şey sütun 1 ve çift konsantrasyon ekleyin (~ 16 x mikrofon) iyi A1 için (bir küçük molekül test plaka).
Not: Bu miktar mikrofon test tamamlandı önceden belirlenir ve her potansiyel synergizer için farklıdır. - Bir degrade seyreltme alarak 100 µL sütun 1 ve sütun 2 aktarma x ekseni üzerinde oluşturun. 100 µL sütun 11 eklenene kadar bu işleme devam edin. Karıştırın, sonra sütun 11 100 µL alıp atın. Herhangi bir ilaç sütun 12 (Şekil 1A) eklemeyin.
- Giriş uyuşturucu için y ekseni boyunca ikinci ilaç degradenin ayarlayın. Medya içeren 2 x mikrofon giriş molekülün satırındaki A. Mix ve seyreltik olarak daha önce alarak 100 µL satır A ve 100 µL satır G. Mix yerleştirilir kadar B. Continue (devam) yerleştirerek üzerinden 100 µL eklemek, 100 µL ve elden çıkarma giriş herhangi bir ilaç satır H. eklemek için sağlanması, Bu satır H ve sütun 12 test ilaç çifti (Şekil 1B) tek tek doz içeren sağlar.
- Plaka aşılamak. 2 µL OD600 0,002 bir E. coli kültürün her şey (iyi başına 1.000 hücreleri) ekleyin.
- 0 h okuma plaka her kuyuya OD600 ölçmek.
- 37 ° C'de 24 h plaka kuluçkaya
- 24 saat her kuyuda OD600 ölçmek.
- E. coli bir gecede kültür medyada M9 en az önce büyümek.
- Çözünme kesirli inhibitör konsantrasyon dizinden (FICI) hesaplama
- Her şey için net büyüme plaka, 0 h, bir elektronik tablo programında 24 h OD600 OD600 çıkararak hesaplar.
- Yazılım büyüme yok küçük molekül içerir her şey iyi H12 bölerek normalize.
- Sütun 12 giriş molekülünün MIC90 ve H. satırda potansiyel synergist MIC90 bulmak
- Büyüme yüzde 90'ını inhibe tüm kuyular için bak.
- Ya da en düşük (sinerjik) aşağıda o FICI90 hesaplamak veya yukarıda (düşman) en üst denklemi kullanarak her iki MIC90 değeri:
- Herhangi bir FICI ≤ 0,5 olarak sinerjik düşünün ve FICI ≥ 4 antagonistik (Şekil 2).
Not: Bu da MIC50 ile yapılabilir (% 50 büyüme inhibisyonu) bu mikrofon değerlerine göre bir FICI50 almak için.
- Bliss bağımsızlık tahlil
Not: Bliss bağımsızlık bir mikrofon, kendi yoktu herhangi bir potansiyel synergist ile çalıştırılır.- E. coli bir gecede kültür M9 medya 37 ° C'de daha önce olduğu gibi büyür.
Not: Bu adımda yine, uygun yetişme şartlarına ilgi diğer organizmalar için kullanılabilir. - 96-şey plakaları potansiyel sinerjik molekül, giriş molekül, kasanın ve sigara tedavi kontrol testleri için hazır olun.
- Potansiyel synergist plaka her şey için 50 µL M9 medya ekleyerek oluşturun. 50 µL medya kümesi bir konsantrasyon (10 µM veya 100 µM) içeren bir satır her şey için potansiyel synergist ekleyin. Plaka başına 8 molekülleri sınayın.
- Giriş molekül plaka her şey için 50 µL medya ekleyerek oluşturun. 50 µL 4 x içeren eklemek her kuyuya 1 sütun için giriş ilacın MIC. X ekseni boyunca bir degrade seyreltme mikrofon tabak, sütun 1 50 µL alarak, dispersiyon ve sütun 2 karıştırma benzer oluşturun. Sütun sütun 12 50 µL atılması 12, kadar bu işlemi sürdürün. Her şey için bitiş toplam 100 µL bu yüzden her şey için bir ek 50 µL medya ekleyin.
- Kombinasyon plaka 96 iyi plaka kullanarak oluşturma, her şey için 50 µL medya ekleyin. 50 µL 4 x içeren eklemek her kuyuya 1 sütun için giriş ilacın MIC. Benzer sütun 1 50 µL alarak, dispersiyon ve sütun 2 karıştırma mikrofon tabak, x ekseni boyunca oranında seyreltin. Bu sütun 12, 50 µL 12 sütundan atılması için tüm yol devam. 50 µL 10 µM ya da her şey bir satır için 100 µM potansiyel synergist içeren medya ekleyin. Yine, bir konsantrasyon veya satır başına ilaç olmalıdır.
- Sigara tedavi kontrol plaka bütün wells için 100 µL M9 medya ekleyerek oluşturun.
- Tüm plakaları her yanı sıra daha önce bakteri kültürü 2 µL 0,002 veya 1.000 hücrelerin bir OD600 ile ekleyerek aşılamak.
- Her şey 0 ile 24 h OD600 ölçmek.
- E. coli bir gecede kültür M9 medya 37 ° C'de daha önce olduğu gibi büyür.
- Bliss bağımsızlık puan hesaplama
- Her şey için net büyüme plaka 0 h 24 h bir elektronik tablo programı kullanmanız büyümeden OD600 çıkararak hesaplar.
- Kuyuları ortalama büyüme için bir elektronik tablo programında hiçbir ilaç plaka normalleştirmek.
- Elektronik tablo yazılımı kullanarak, inhibisyon 1 net büyüme çıkararak hesaplar.
- Elektronik tablo yazılımı yalnızca giriş degradede içeren denetim plaka sütunlarda ortalama.
- Her şey için bliss puanı denklemi tarafından Hesapla:
Bliss puanı (iyi X + giriş sütun X) -iyi X kombine = - Olumsuz puanları Wells giriş MIC90 aşağıda bulabilirsiniz.
Not: Birden fazla konsantrasyonları arasında negatif puanları bir sinerjik etkileşim gösterir.
4. yüksek üretilen iş ekran roman sinerjik çiftleri tanımlamak için sinerji tahmin mutantlar ile
-
Sinerji tahmin mutantlar tanımlamak
Not: Adım 1.5 sözde sinerji tahmin mutantlar tespit edilmiştir. Burada, hangi bu mutant bir yüksek üretilen iş ekran sinerjik ilaçlar için en iyi çalışacaktır belirlemek. Biz bir Bioscreen makine bu tahlil gerçekleştirilen ama 96 iyi plaka okuyucu sayısı-meli da var olmak kabul edilebilir.- Her sözde sinerji tahmin mutantlar ve vahşi-türü hücre M9 en az medyada büyümek.
- 100 kadar set de petek plaka (veya 96 iyi plaka) uygun büyüme orta, büyüme orta + giriş uyuşturucu, büyüme orta + giriş ilaç ve büyüme orta + sinerjik sigara uyuşturucu bilinen sinerjik ortağı ile. Araç denetimleri eklemek için emin olun.
Not: Dört kuyu her zorlanma/ilaç/yoğunlaşması çoğaltmak öneririz. - Şey, boş denetim wells de dahil olmak üzere başına 1.000 hücre aşılamak.
- 48 h 37 ° C'de sallayarak ile büyümek ve OD600 her 20 dk okuyun.
- Vahşi-türü ve sinerji arasındaki en büyük büyüme fark giriş uyuşturucu ve bilinen sinerjik ortakları huzurunda tahmin mutant hücreleri gösterir ilaç konsantrasyonu ve saat noktayı belirlemek. Uygun zaman nokta ve konsantrasyon uyuşturucu huzurunda sinerjik giriş uyuşturucu (Şekil 3) ile hareket değil bilinen yetiştirilen vahşi tipi ve sinerji tahmin mutant hücreleri arasında fazla büyüme fark olmamalıdır.
-
Sinerjik uyuşturucu için yüksek üretilen iş ekran
- Vahşi-türü hücreleri ve sinerji tahmin mutant hücreleri M9 en az medyada büyümek.
Not: uygun büyüme orta vade farkı organizma için kullanın. - Uyuşturucu de, önceki adımda belirlenen küme toplama, küçük moleküller ile 100 µL ortamı içeren ortam her kitaplıktan ekleyin. Boş wells (olmadan hücreleri) ve wells ile araç denetimleri içerir (e.g., DMSO) herhangi bir büyüme inhibisyonu için uyuşturucu seyreltme araç tarafından hesap için.
- En az dört araç kontrol kuyu başı plaka, ideal iyi pozisyon etkileri için hesap için plaka dağılmış hazırlayın. Deneyleri değişken varsa, de satır/sütun başına en az bir araç denetim içerir ve her satır/sütun denetim de denetimi olarak yerine bir bütün plaka (adım 4.2.5) için her satır/sütun için Z score hesaplamak için kullanın.
- Kültür 2 µL her yanı sıra daha önce ekleyin. (Vahşi türü bakteri ve tahmin edilen sinerji mutant bakteriler için bir tabak bir tabak).
- 0 ile 18 h E. coli için veya 48 h OD600 C. neoformansiçin değerlendirmek.
- Elektronik tablo yazılımı kullanarak, net büyüme araç kontrol kuyulardan boş Wells OD600 çıkararak hesaplar. Kuyu-2.5, Z-score ile tanımlamak (Z puanı demek - 2.5 = * standart sapma). Bu wells bir potansiyel synergist küçük molekül içerir.
- 3. adımda açıklanan yöntemleri kullanarak ekran sayısı doğrulayın.
- Vahşi-türü hücreleri ve sinerji tahmin mutant hücreleri M9 en az medyada büyümek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dama tahtası deneyleri sinerjik etkileşim ölçmek için yarı nicel bir yöntemdir. FICI, çıkış final skoru belirleyen bir ilaç kombinasyonu sinerjik (FICI ≤0.5) görülürse, Sigara-etkileşim (0,5 < FICI < 4), ya da antagonist (FICI ≥4.0). Şekil 1 bir dama tahtası tahlil uyuşturucu degradeler ayarlamak verilmektedir. Şekil 2 ortak sonuçlar gösterilmektedir. % 90 Büyüme inhibisyon daha az görüntülemek büyüme (mor wells) göz önünde bulundurun. Her şey bir tabak içinde OD600 ölçme sonra de biz hiçbir uyuşturucu kontrolü için her şey normale. Normalleştirilmiş bir değer ile bir şey > 0,1 (iyi denetimin OD%600 10) "olarak büyüme" attı. FICI puanları bağlı olarak iyi seçilmiş değişebilir; Biz en düşük fiyat FICI her tabağını veriyor iyi seçin. Bu iyi F9 (sütunlar sayılı, aydın satır) olurdu, Şekil 2A, bir FICI ile 0.07 =. Şekil 2BFICI iyi C3 hesaplanır (FICI = 1,0). Antagonistik etkileşim için olası en yüksek FICI puanı için bak. Şekil 2Ciçinde FICI hangi bir FICI 8.0 vermek iyi A1 hesaplanır.
En iyi tarama koşulları yanlış pozitif ekranından, zaman ve para tasarrufu sağlayan yüksek bir dizi engel olur. Sinerji tahmin mutantlar mantar Cryptococcus neoformansiçin optimize edilmiş, biz test giriş uyuşturucu (flukonazol), dört bilinen sinerjik sigara uyuşturucu (kafein, climbazole, trimetoprim ve brefeldin A) ve beş flukonazol'ın sinerjik ortakları (rifamisin, myriocin, nigericin, rapamycin ve FK506, tüm Chandrasekaran, S. ve ark. tartışıldı 18). O2M Analizi (Bölüm 1 ve 2), seçmeli olarak sinerji tahmin mutant hücreleri ama değil vahşi türü hücre büyümesini inhibe için bilinen synergizers beklediğimiz ile bu moleküller keşfetti. Beklenen büyüme fark en üst düzeye çıkarmak için en çok hangi sub-inhibitory konsantrasyonları her küçük molekül için bir dizi test.
Örnek sonuçları Şekil 3' te gösterilmektedir. Sinerjik flukonazol, brefeldin A, Inhibe vahşi tipi ve sinerji tahmin mutant büyüme ile sadece biraz hareket etmez bir molekül ve yaklaşık aynı miktarda. Rifamisin (Şekil 3B), sinerji tahmin mutant (cnag_03917Δ) büyüme inhibe ama vahşi-türü hücre büyümesini değildi. Böylece tarama için timepoint bu aralıkta 32 ve 49 s sonrası aşılama arasında en büyük büyüme fark oldu. Büyüme eğrileri diğer sinerjik ve sinerjik olmayan moleküller rifamisin ve brefeldin A, sırasıyla andıran.
Resim 1 : Adım 3 dama tahtası tahlil tasviri. Test ilaç ve giriş uyuşturucu degradeler gösterilmiştir A ve B, anılan sıraya göre. Son tahlil plaka C. olduğu gibi görünmesi gereken Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Grafiksel dama tahtası tahlil sonuçlarını. Çizimleri sinerjik, hiçbiri, ve antagonistik etkileşim tasvir içinde A, B ve C, sırasıyla. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Tarama zaman tanımlamak için örnek veri. (A)vahşi-türü (yeşil) ve sinerji tahmin mutant (mavi), brefeldin A, küçük bir molekül huzurunda flukonazol ile synergize değil bilinen yetiştirilen C. neoformans . Vahşi-tipi kumanda (koyu yeşil) ve tedavi ilaç (açık yeşil) sinerji tahmin mutant denetim (koyu mavi) ve tedavi ilaç (açık mavi) büyüme benzer bir fark var. Rifamisin varlığında, küçük bir molekül flukonazol ile synergize bilinen yetiştirilen (B) vahşi tipi ve sinerji tahmin mutant. Vahşi-tipi kumanda (koyu yeşil) ve tedavi ilaç (açık yeşil) sinerji tahmin mutant denetim (koyu mavi) ve tedavi ilaç (açık mavi) daha küçük bir büyüme fark var. En büyük fark, bilinen sinerjik molekül için 48 h görülmektedir ve fark, o zaman noktasında bilinen sinerjik molekül için benzer. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sinerjik küçük molekül çiftleri mikrobik enfeksiyonları tedavi güçlü bir araç olabilir, henüz sinerjik çiftleri tanımlamak için zor, çünkü onlar tam klinik potansiyellerini ulaşmak değil. Bu kağıt sinerjik çiftleri basit ikili kombinasyonları çok daha hızlı tanımlamak için bir yöntem açıklanır. Kimyasal-genetik veri kümelerini kullanarak, O2M daha sonra ekran büyük kitaplıklarına küçük moleküllerin bir okuma olarak sinerjik çiftleri tahmin etmek için kullanılabilir gen altını gizleme ile mutantlar tanımlar. Ekranlar, sinerjik ortakları largescale tanımlanması için sırayla kılan yüksek ölçeklenebilirlik için küçük moleküller tahmin yeteneği sağlar. Sinerjik çiftleri belirledikten sonra bir moleküler mekanizması temel sinerjik etkileşim aydınlatmak sonra rasyonel tasarım ek sinerjik çiftleri11.
O2M kimyasal genetik bir veri kümesi ve bilinen bir sinerjik çift gerektirir. Neyse ki, kimyasal-genetik veri kümeleri mikroplar19,20,21çeşitli için ortaktır. Kahverengi laboratuvar daha önce O2M başarıyla C. neoformans ve E. coli11,12' sinerjik çiftleri bulabilirsiniz gösterdi. Bu geniş etki O2M geniş bir çeşitli organizmalar için uygulanabilir bir ölçeklenebilir yöntemi olarak sahip olduğunu gösterir. Burada listelenen tüm adımları farklı bir mikroorganizma ile nispeten benzer sonuçlar, böylece O2M sinerjik çiftleri genel tanımlaması için değerli bir araç yapma büyüme için değiştirilebilir. Bu yöntemlerden en az programlama bilgisine O2M gerektirse de çeşitli diğer gruplar farklı analitik yöntemlerle kimyasal-genetik veri kümesinden gelen sinerjik kombinasyonları tespit vardır. Her yöntemin sinerjik antibiyotik veya antifungaller 18,22,23,24sinerjik çiftleri çok sayıda keşfedilmeyi kalmasını telkin, farklı grupları tanımlar. O2M ve diğer sinerji tahmin yöntemleri de kanser ilaç kombinasyonlarını belirlemek de dahil olmak üzere memeli sistemler için potansiyel olarak geçerlidir.
Özetle, bu yöntem bir kimyasal-genetik veri kümesinden gelen hızlı bir şekilde sinerjik çiftleri için ekran için açıklar. Bu yöntem ve diğerleri sinerjik çiftleri kliniklerde daha uygun bir tedavi seçeneği haline yardımcı olur. Ayrıca, O2M'ın hızlı ve yaygın yöntem bu değerli bir araç zaman sinerjik küçük molekül çiftleri Aradığınız kanıtlıyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser patoloji departmanı, Utah Üniversitesi J.C.S.B. için bir başlangıç hibe tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioscreen C | instrument | Growth Curves USA | |
| Synergy H1 | instrument | BioTek | |
| M9 broth | reagent | Amresco | J863-500G |
| Casamino Acids | reagent | Fisher Scientific | BP1424-500 |
| Glucose | reagent | Sigma | G7021-10KG |
| Nicotinic Acid | reagent | Alfa Aesar | A12683 |
| Thiamine | reagent | Acros Organics | 148991000 |
| CaCl2 Dihydrate | reagent | Fisher | C79-500 |
| MgSO4 Heptahydrate | reagent | Fisher | M63-500 |
| chemical-genetics dataset | dataset | examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text. | |
| trimethoprim (example input drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN19552701 |
| sulfamethoxazole (example test drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN15671125 |
References
- Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management. Front Public Health. 2, 145 (2014).
- Butts, A., Krysan, D. J. Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New. PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870 (2012).
- Roemer, T., Krysan, D. J. Antifungal Drug Development: Challenges, Unmet Clinical Needs, and New Approaches. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (5), a019703 (2014).
- Oprea, T. I., Mestres, J. Drug Repurposing: Far Beyond New Targets for Old Drugs. AAPS J. 14 (4), 759-763 (2012).
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nat Rev Drug Discov. 11 (3), 191-200 (2012).
- Rangel-Vega, A., Bernstein, L. R., Mandujano-Tinoco, E. A., García-Contreras, S. J., García-Contreras, R. Drug repurposing as an alternative for the treatment of recalcitrant bacterial infections. Front Microbiol. 6, 282 (2015).
- Torella, J. P., Chait, R., Kishony, R. Optimal Drug Synergy in Antimicrobial Treatments. PLoS Comput Biol. 6 (6), e1000796 (2010).
- Cowen, L. E., et al. Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease. P Natl Acad Sci. 106 (8), 2818-2823 (2009).
- Zuo, G. -Y., et al. Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). Molecules. 16 (12), 9819 (2011).
- Jia, J., et al. Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).
- Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. S. High-throughput identification and rational design of synergistic small-molecule pairs for combating and bypassing antibiotic resistance. PLOS Biol. 15 (6), e2001644 (2017).
- Brown, J. C. S., et al. Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics. Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).
- Cokol, M., et al. Systematic exploration of synergistic drug pairs. Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).
- Borisy, A. A., et al.
- Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. What is synergy? The Saariselkä agreement revisited. Front Pharmacol. 6, 181 (2015).
- Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis. Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell. Cell. 144 (1), 143-156 (2011).
- Chandrasekaran, S., et al. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).
- Pradhan, A., et al. Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery. Sci Rep. 5, 15930 (2015).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).
- Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. E. Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry. PLoS Genetics. 8 (3), e1002562 (2012).
- Robbins, N., et al. An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens. Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).
- Wildenhain, J., et al. Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning. Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).
- Spitzer, M., et al. Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole. Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).
