Summary
Det här protokollet beskriver en minimalinvasiv osteosyntes teknik med en intramedullär skruv för standardiserade stabilisering av lårben frakturer, som kan användas för att analysera endochondral ben healing hos möss.
Abstract
Ben helande modeller är nödvändigt att analysera de komplexa mekanismerna för fraktur healing för att förbättra kliniska fraktur. Under det senaste decenniet noterades en ökad användning av mus-modeller i ortopedisk forskning, troligen eftersom musmodeller erbjuder ett stort antal genetiskt modifierade stammar och särskilda antikroppar för analys av molekylära mekanismer av frakturläkning. För att styra de biomekaniska villkor, är välkarakteriserad osteosyntes tekniker obligatorisk, även hos möss. Här rapporterar vi om utformning och användning av ett stängt ben healing modell att stabilisera lårben frakturer hos möss. Intramedullära skruven, av medicinsk kvalitet rostfritt stål, ger genom fraktur komprimering en axiell och roterande stabilitet jämfört med de oftast använda enkla intramedullära stift, som visar en total avsaknad av axial och roterande stabilitet. Stabilitet uppnås genom intramedullära skruven tillåter analys av endochondral healing. En stor mängd callus vävnad, fick efter stabilisering med skruven, erbjuder idealiska förutsättningar att skörda vävnad för biokemiska och molekylära analyser. En ytterligare fördel med användningen av skruven är det faktum att skruven kan infogas i lårbenet med minimalinvasiv teknik utan att skada på den mjuka vävnaden. Sammanfattningsvis är skruven ett unikt implantat som helst kan användas i sluten fraktur healing modeller erbjuder standardiserade biomekaniska förhållanden.
Introduction
Ben helande studier på möss är stor efterfrågan på grund av ett brett spektrum av antikroppar och genetiskt modifierade djur. Dessa fakta gör för att studera molekylära mekanismer för ben healing1. I de senaste åren utvecklat olika ben healing modeller för möss har varit2. Dessa modeller kan delas in i öppna modeller, där benet är osteotomized med en öppen laterala kirurgisk metod och i slutna modeller, där benet är splittrad fraktur som förebild infördes genom Bonnares och Einhorn3. Med denna teknik, en standardiserad tvärgående fraktur kan produceras av en 3-punkts bockning enhet och intramedullära implantat kan sättas in genom en liten mediala parapatellar snitt i en minimalinvasiv teknik att undvika en stor mjuk vävnad trauma.
Intramedullära skruven kan tillämpas för sluten fraktur stabilisering i möss. Skruven har roterande och axiella stabiliteten. Detta uppnås genom fraktur komprimering genom en proximal tråd och en distal huvud4. Ytterligare fördelar med skruven är den enkla operationsteknik, låg grad av invasivity, låga implantat vikt och, framför allt, en högre stabilitet som tillhandahåller standardiserade och kontrollerad biomekaniska villkor jämfört med andra intramedullära implantat5. I själva verket i de mest slutna frakturer modellerna, fragmenten stabiliseras endast av enkel pins, som är associerade med en total avsaknad av roterande och axiella stabiliteten och en hög risk för pin och också fraktur dislokation. Detta kan påtagligt påverka läkningsprocessen, vilket kan leda till fördröjd läkning eller icke-union bildas.
Det är väl känt att stabiliteten i frakturfixering har en enorm inverkan på den läkande process6,7. En hög stel fixering resulterar i intramembranous healing, medan en mindre stelbent fixering, som kan möjliggöra micromovements fraktur gapet, resulterar i endochondral healing. Stabilisering av frakturen med intramedullära skruven visar huvudsakligen en endochondral healing med en stor mängd callus vävnad, särskilt efter 2 veckors frakturläkning. Möjlighet att skörda en stor mängd callus vävnad möjliggör analys av flera parametrar genom olika tekniker.
Här rapporterar vi om utformning och tillämpning av intramedullära skruven i möss, liksom på dess fördelar och nackdelar i experimentella studier på normala endochondral benläkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden utfördes enligt National Institutes of Health riktlinjerna för användningen av försöksdjur och följt institutionella riktlinjer (Landesamt für Verbraucherschutz, Zentralstelle Amtstierärztlicher Dienst, Saarbrücken, Tyskland).
1. beredning av kirurgiska instrument och implantat
- Välj en skalpell blad (storlek 15), en liten kompress, fin pincett, en 27 G nål, en icke-resorberbara 5-0 sutur, sax och en nålförare rutan mikrokirurgiska instrument.
- Packa upp den intramedullära skruven, ledaren (0,3/0,2 mm i diameter, 10 cm längd), självcentrerande borrkronan (0,5 mm i diameter) och handborr (figur 1, se Tabell för material).
Obs: Intramedullära skruven (0.5 mm i diameter, 17,2 mm längd) är tillverkad av medicinsk kvalitet rostfritt stål för retrograd implantering i lårbenet. Skruven har en proximal tråd (0.5 mm i diameter, 4 mm längd) med en näsa (0,2 mm diameter, 0,4 mm längd) på spets och distala konformade huvudet (0,8 mm diameter, längd 0.9 mm) att uppnå fraktur komprimering samt axiella och roterande stabilitet. - Exponera implantaten och alla kirurgiska instrument till en desinficerande lösning (96% alkohol) för 5 min eller sterilisera dem (ångsterilisering, 130 ° C, 25 min). Efter desinfektion eller sterilisering, placera instrumenten på en operation trasa. Placera drift trasan i direkt anslutning till tabellen liten djur operation.
2. djur, anestesi och analgesi
- Välj den stam, ålder och kön i möss enligt studie frågan som tas upp.
Obs: För denna studie användes 12 - till 14-vecka-gammal hanmöss CD-1. Lämpliga kroppsvikten att använda intramedullära skruven är mellan 25-35 g. - Söva möss med en intraperitoneal injektion av 15 mg/kg xylazin och 75 mg/kg ketamin. Bekräfta anesthetization genom tå nypa. Tillämpa öga smörjmedel för att skydda djurens ögon torkar under anestesi. Efter induktion av anestesi, Placera musen under en värme radiatorn att hålla kroppstemperaturen konstant. Under förfarandet övervakades djur med upprepade tå Nyp för att säkerställa en lämplig plan för anestesi.
- Ansöka analgesi tramadol-hydroklorid i dricksvattnet (1,0 mg/mL) från dag 1 före operationen fram till dag 3 efter operationen.
Obs: Analgesi och infektionförhindrande bör i samförstånd med respektive riktlinjerna i landet och institution där experimenten kommer att utföras.
3. kirurgiska ingrepp och intramedullära skruv Implantation
- Före operation, raka av hela höger bakben och tillämpa en hårborttagningsprodukter kräm. Efter 5 min, ta bort grädden och rengör benet med vatten. Sedan tillämpa en desinficerande lösning med 96% alkohol. Betadine eller klorhexidin kan läggas till alkoholen att säkerställa fullständig asepsis.
- Placera musen i ryggläge på tabellen små djur operationen under aseptiska förhållanden. Böj höger knä som möjliggör ett främre förhållningssätt till kondyler i knäet. Utföra en 5-mm mediala parapatellar snitt på höger knä med skalpell bladet.
- Mobilisera patellar ligament noggrant med skalpell bladet och pinnen. Sedan Skift patella lateralt med fina tången att exponera intercondylar skåran på lårbenet.
- Öppna intercondylar skåran precis i mitten lårbenet mellan båda kondyler. Se till att inte överstiga 1,0 mm i djup för borrhålet.
- Starta manuell borrning på en långsam hastighet och en 45 ° förskjutning ventralt till lårbenet axeln med 0,5 mm centrering borr och handborr (figur 1 c och D, figur 2). Under borrningen, kontinuerligt minska vinkeln till 0 ° förskjutning (parallellt med ben axeln av lårbenet). Stoppa borrning när ett djup av 1,0 mm nås.
- Efter öppnandet ben intercondylar skåran, nålen 27 G i intramedullära hålighet över den hela längden av lårbenet. Bunt intramedullära hålighet i lårbenet manuellt via roterande rörelser av 27 G nålen. Tryck nålen fram för att perforera det kortikala benet på trochanter proximalt.
- Nålen 27 G och tillämpa ledaren genom den distala delen av lårbenet.
- Göra ett snitt i huden med en skalpell blad (storlek 15) proximalt över ledaren och driva ledaren tills båda ändar på ledaren är utanför. Se till att hålla ledaren på plats.
- Skapa en definierad sluten fraktur med giljotinen.
- Placera musen i sidoläge med höger ben under giljotinen. Kontrollera att den diafysära delen av lårbenet är placerad mitt i giljotinen.
- Släppa vikt (200 g) från det definierade avståndet av 25,5 cm.
- Kontrollera konfigurationen fraktur samt fraktur position och ställning ledaren (figur 3) med hjälp av röntgenapparaten (se Tabell för material).
- Anslut intramedullära skruven med näsan på den distala änden till 0,2 mm ledaren och infoga det i lårbenet under ständig press och medsols rotation.
- Skjuvning av drivaxeln när tillräcklig vridmomentet uppnås.
- Ta bort ledaren proximalt.
- Flytta patella och fixa patella senan till musklerna med en enstaka sutur med hjälp av en 5-0 syntetiska, monofilament, oresorberbara polypropylen suturen. Använda enstaka suturer av samma material och storlek för att stänga såret. Kontrollera att minska fragment och skruven ställning radiologiskt använder röntgenapparaten (se Tabell för material).
- Hålla djuren under värme kylaren tills de återhämta sig från anestesi. Lämna inte djuren utan uppsikt tills de har återfått tillräcklig medvetande för att upprätthålla ventrala koordinationsrubbning. Tillbaka djuren till enda burar i djuranläggningen. Returnera inte djuren till företaget av andra djur under de första 24 h, även om de har återhämtat sig helt från anestesi.
- Övervaka djuren noga varje dag. Upprätthålla postoperativ analgesi använder tramadol-hydroklorid dricksvatten med en dosering på 1,0 mg/mL under de första tre dagarna. Fortsätt analgesi om, dag 4 efter operation, djuren fortfarande visar tecken på smärta, som indikeras av läte, rastlöshet, bristande rörlighet, underlåtenhet att brudgummen, onormal kroppshållning och brist på normala intresse i omgivningarna. Avsluta smärtlindring när djuren är smärtfri.
- I slutet av experimentet avliva djuret av en överdos av barbiturat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drifttiden från huden snitt för att såret stängning var 20 min. Operationen kan utföras utan stereo-Mikroskop. Postoperativt, övervakades djuren dagligen. Postoperativ analgesi avslutades efter 2 dagar eftersom inget av djuren visade tecken på smärta efter denna tidsperiod. Det för djuren visade också normala viktbärande inom 2 dagar efter operationen. Sårinfektioner observerades inte under hela observationsperioden.
Radiologiska analyser efter 2 veckor visade en uppenbart bildandet av callus vävnad överbrygga klyftan fraktur (figur 4A). Efter 5 veckor, var frakturen läkt och den periosteal förhårdnader var nästan helt ombyggda (figur 4B).
Histologiska analyser av förhårdnader och zonen fraktur efter 2 veckor visade typisk vävnadsdistribution av endochondral healing med broskvävnad byggd under processen chondrogenic och vävda ben (figur 5A). Efter 5 veckor, brosk vävnaden försvunnit, och filtben konverterades till den lamellära ben för att rekonstruera normalt anatomiska och lastförmåga egenskaper av benet (figur 5B).
Biomekaniska analyser efter 2 veckor anges en böjstyvheten med 37% jämfört med kontralaterala ej spräckt ben. Efter 5 veckor var böjstyvheten nästan 100% vilket indikerar komplett helande (figur 6).
Figur 1: implantat. A. intramedullära skruven (0.5 mm i diameter, 17,2 mm längd) med tråden (0.5 mm i diameter, 4 mm längd) och näsan (0,2 mm diameter, 0,4 mm längd) proximala och ett konformat huvud (0,8 mm diameter, 0.9 mm längd) distala. B. ledaren (0,3/0,2 mm i diameter, 10 cm längd). C. den centrering borrspets (0,5 mm diameter). D. handborr. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk ritning av de lårbenet kondyler som anger posten pekar för intramedullära skruven. Lårbenet kondyler med intercondylar skåran i främre-bakre Visa (vänster) och sagittal se (höger). Korset (vänster) anger startpunkten för intramedullära skruven, pilen (höger) indikerar 45 ° förskjutning till lårbenet axeln att börja borra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: röntgenbild av lårbenet med en tvärgående fraktur och infogade ledaren. Röntgenbild visar konfigurationen av tvärgående fraktur i den diafysära delen av lårbenet (pil) och ledaren i intramedullära hålrummet överbrygga frakturen. Skala staplarna representerar 5 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: röntgenbilder efter 2 och 5 veckors benläkning. A. radiografisk analys av ett lårben stabiliserad med skruven efter 2 veckor, visar uppenbara förhårdnader bildas. B. radiografisk analys av ett lårben stabiliserad med skruven efter 5 veckor, visar nästan fullständig läkning av frakturer med ombyggnaden av förhårdnader. Skala staplarna representerar 5 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: histologiska sektioner efter 2 och 5 veckors benläkning. A. histologisk analys av ett lårben stabiliserad med skruven efter 2 veckor, visar de typiska Vävnadsdistributionen under endochondral ben healing med brosk (c) och (b) benvävnad inom förhårdnader. B. histologisk analys av ett lårben stabiliserad med skruven efter 5 veckor, visar nästan fullständig ombyggnaden till lamellär ben. De histologiska avsnitten var målat enligt metoden trikrom. Skala staplarna representerar 1000 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6: biomekanisk analys. Biomekanisk analys av böjstyvheten efter 2 veckor (vit stapel, n = 9) och 5 veckor (svart bar, n = 8). Böjstyvhet ges i procent till kontralaterala icke-brutna lårbenet. Data ges som medelvärde ± standardavvikelsen för medelvärdet (SEM), * p < 0,05 vs. 2 veckor. Efter styrker antagandet för normalfördelning (Kolmogorov-Smirnov-test) och med lika varians (F-test), utfördes jämförelsen mellan de två experimentella grupperna med hjälp av Students t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg av det kirurgiska ingreppet är att hitta den rätta startpunkten för skruv implantation i mitten av lårbenet kondyler vid intercondylar skåran samt optimal orientering på nålen parallellt med ben axeln för brotschning av den intramedullära hålighet. För att undvika en felaktig post position, bör kirurgen förbereda skåran tills en optimal vy uppnås. För att styra orientering under brotschning, bör lårbenet av möss hållas med fingrarna i en stabil position. Ytterligare ett avgörande steg är införandet av skruven in i lårbenet över ledaren eftersom ledaren kan glida ur den proximala ben fragment vilket resulterar i en fraktur dislokation. I det här fallet, kirurgen kan försöka gänga benfragment igen, men denna manöver är mest misslyckade och djuren måste sedan exkluderas från studien.
Det kirurgiska ingreppet kan dessutom utveckla några komplikationer. Till exempel kan patellar ligament, som skiftas sido för att få en optimal utsikt till kondyler, brista. Detta kräver suturering av ligament efter skruv inläggning. Under öppning benet på kondyler och brotschning intramedullära hålrummet, kan kondyler sprängas. I det här fallet finns det ingen möjlighet för felsökning, eftersom skruven inte tillräckligt fastställas på den distala änden och komprimering av frakturen inte uppnås. En annan komplikation är förskjutning av infogade ledaren eller en felaktig placering av benet. Denna komplikation kan minskas genom hantering med försiktighet och radiografiska analysen efter införande för att bekräfta korrekt placering under operation. Dessutom kirurgen bör uppmärksamma att skruven sitter eftersom en framskjutning av skruven kan begränsa rörligheten för musen eller minska frakturer kompression. En röntgenapparaten är därför obligatorisk för det kirurgiska ingreppet. Endast djur efter radiografisk bekräftelse i slutet av operation bör ingå i studieprotokollet.
Borttagning av intramedullära skruven i slutet av experimentet kan utföras utan problem, eftersom chefen för skruven kan anslutas till en speciell borttagning instrument eller, alternativt, skruven kan tas också med innehavaren av nålen.
En begränsning med tekniken är att intramedullära skruven tillhandahålls av företaget endast i en storlek med en definierad längd 17,2 mm och därför storleken på lårbenet måste beaktas. En ytterligare begränsning av användningen av intramedullära skruven är att i vivo micro beräknade datortomografi-(CT) eller magnetisk resonanstomografi (MRT) analyser av läkningsprocessen är nästan omöjligt på grund av Implantatmaterialet, vilket påverkar bilden kvalitet. Dessa analyser kan därför endast utföras efter dödshjälp och avlägsnande av implantatet i slutet av studietiden. Slutligen kan inte skruven användas för att analysera defekt benläkning, eftersom den axiella stabiliteten uppnås genom komprimering av benfragment av proximala tråden och distala huvudet.
Ben helande studier använda antingen öppen8,9,10,11,12,13,14 eller stängt4,15, 16,17 ben healing modeller. Öppna ben helande modeller kan en mer stelbent fixering av fragment jämfört med stängda ben healing modeller, vilket resulterar i en högre mängd intramembranous läkning utan en uttalad callus formation. Eftersom öppna modeller är associerade med lite förhårdnader bildas, kan dessa modeller inte föredras i experiment som kräver större mängder av callus vävnad för biokemiska och molekylära analyser. Ett mer ytterligare missgynnar av öppna modeller är behovet av en invasiv laterala strategi med en stor mjuk vävnad trauma. Däremot förutsätter en sluten modell att endast en liten mindre invasiva snitt. Tills nu finns bara några stängda modeller i möss2.
I slutna ben healing modeller, används oftast en enkel intramedullära stift. Denna teknik har dock tydliga nackdelar. Framför allt, bristen på axiell och roterande stabilitet. Detta kan resultera i en heterogen helande svar5. Även om denna nackdel är kända för att påverka experimentella resultat18, använda färska studier, som avser att analysera mekanismerna för benläkning, fortfarande murina modeller där frakturen stabiliseras endast med en PIN-kod eller lämnas ostabiliserad7 . Vi anser att stabil osteosyntes tekniker, jämförbara med dem som används i klinisk praxis, bör också användas i möss. För att uppnå axiella och roterande stabilitet, utvecklades intramedullära skruven som inducerar fraktur komprimering av en distal huvud och en proximal tråd. Av intresse, tillämpningen av intramedullära skruven producerar inte en stel fixering och, således den torsional styvheten av fractured platsen stabiliserad med intramedullära skruven är betydligt lägre jämfört med det av fractured platsen stabiliseras av en extern fixeringsanordning eller låsning plattan5. Det krävs dock en mindre stelbent fixering att studera endochondral benläkning, eftersom endast en mindre stelbent fixering tillåter micromovements ben fragment, som framkalla den endochondral läkningsprocessen. Dock i en tidigare ex vivo studie visas producerar intramedullära skruven en distinkt axiella och roterande stabilitet. Biomekaniska analyser visade att intramedullära skruven uppnår en torsional styvhet på 0,34 ± 0,18 Nmm / °, vilket är betydligt högre jämfört med som uppnås med konventionella pin (0.00 ± 0.00 Nmm / °)5. Intramedullära skruven införs här är alltså den enda implantat som kan användas i en minimalinvasiv teknik och ger standardiserade biomekaniska förhållanden för den studien endochondral frakturläkning i möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av RISystem AG, Davos, Schweiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse Screw | RISystem AG | 221,100 | |
| Guide wire | RISystem AG | 521,100 | |
| Centering bit | RISystem AG | 590,205 | |
| Hand drill | RISystem AG | 390,130 | |
| Cotton-Swab (150 mm, small head) | Fink Walter GmbH | 8822428 | |
| Suture (5-0 Prolene) | Ethicon | 8614H | |
| Forceps | Braun Aesculap AG &CoKG | BD520R | |
| Scissors | Braun Aesculap AG &CoKG | BC100R | |
| Needle holder | Braun Aesculap AG &CoKG | BM024R | |
| 27 G needle | Braun Melsungen AG | 9186182 | |
| Scalpel blade size 15 | Braun Aesculap AG &CoKG | 16600525 | |
| Heat radiator | Sanitas | 605.25 | |
| Depilatory cream | Asid bonz GmbH | NDXZ10 | |
| Eye lubricant | Bayer Vital GmbH | 2182442 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH | 1320422 | |
| Ketamine | Serumwerke Bernburg | 7005294 | |
| Tramadol | Grünenthal GmbH | 2256241 | |
| Disinfection solution (SoftaseptN) | Braun Melsungen AG | 8505018 | |
| CD-1 mice | Charles River | 22 | |
| X-ray Device | Faxitron MX-20, Faxitron X-ray Corporation | 2321A0988 | |
| Fracture device small | RISystem AG | 891,100 |
References
- Jacenko, O., Olsen, B. R. Transgenic mouse models in studies of skeletal disorders. J Rheumatol Suppl. 43, 39-41 (1995).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. J Orthop Res. 2 (1), 97-101 (1984).
- Holstein, J. H., et al. Development of a stable closed femoral fracture model in mice. J Surg Res. 153 (1), 71-75 (2009).
- Histing, T., et al. Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture. J Orthop Res. 27 (9), 1152-1156 (2009).
- Claes, L., Augat, P., Suger, G., Wilke, H. J. Influence of size and stability of the osteotomy gap on the success of fracture healing. J Orthop Res. 15 (4), 577-584 (1997).
- Histing, T., et al. Characterization of the healing process in non-stabilized and stabilized femur fractures in mice. Arch Orthop Trauma Surg. 136 (2), 203-211 (2016).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J Orthop Res. 20 (5), 1091-1098 (2002).
- Cheung, K. M., Kaluarachi, K., Andrew, G., Lu, W., Chan, D., Cheah, K. S. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21 (4), 685-690 (2003).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. J Biomech. 41 (8), 1689-1696 (2008).
- Histing, T., et al. An internal locking plate to study intramembranous bone healing in a mouse femur fracture model. J Orthop Res. 28 (3), 397-402 (2010).
- Garcia, P., et al. The LockingMouseNail-a new implant for standardized stable osteosynthesis in mice. J Surg Res. 169 (2), 220-226 (2011).
- Histing, T., Klein, M., Stieger, A., Stenger, D., Steck, R., Matthys, R., Holstein, J. H., Garcia, P., Pohlemann, T., Menger, M. D. A new model to analyze metaphyseal bone healing in mice. J Surg Res. 178 (2), 715-721 (2012).
- Histing, T., Menger, M. D., Pohlemann, T., Matthys, R., Fritz, T., Garcia, P., Klein, M. An Intramedullary Locking Nail for Standardized Fixation of Femur Osteotomies to Analyze Normal and Defective Bone Healing in Mice. J Vis Exp. (117), (2016).
- Hiltunen, A., Vuorio, E., Aro, H. T. A standardized experimental fracture in the mouse tibia. J Orthop Res. 11 (2), 305-312 (1993).
- Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. Characterization of a closed femur fracture model in mice. J Orthop Trauma. 18 (10), 687-695 (2004).
- Holstein, J. H., Menger, M. D., Culemann, U., Meier, C., Pohlemann, T. Development of a locking femur nail for mice. J Biomech. 40 (1), 215-219 (2007).
- Claes, L. E., et al. Effects of mechanical factors on the fracture healing process. Clin Orthop Relat Res. 355 Suppl, S132-S147 (1998).
