Summary
このプロトコルでは、大腿骨の骨折は、癒しのマウスにおける軟骨内骨を分析するための標準化された安定化髄内ねじを用いた低侵襲骨接合法について説明します。
Abstract
骨の治癒モデルは骨折臨床骨折治療を改善する治癒の複雑なメカニズムを分析する必要があります。過去 10 年間の間に整形外科研究マウス モデルの使用の増加を認め, 最もおそらくマウス モデルは、多数の遺伝子組み換え系統と骨折治癒の分子機構の解析のための特別な抗体を提供していますので。生体力学的条件を制御するためよく特徴付けられる骨接合技術がマウスでも、必須です。ここでは、マウスの大腿骨骨折を安定させるためにデザインと閉じた骨治癒モデルの使用について報告する.医療グレード ステンレス製髄内ネジ破壊圧縮による軸力と回転安定性の完全な欠如を示す主に使用される単純な髄内ピンと比較して軸と回転の安定性を提供します。髄内ネジにより安定性には、軟骨内の癒しの分析ができます。カルス、ねじによる安定化以降の大量では、生化学的・分子解析のための組織を収穫するための理想的な条件を提供しています。ネジの使用のそれ以上の利点は、ネジを軟部組織への損傷を引き起こすことがなく低侵襲技術と大腿骨に挿入できること事実です。結論としては、ネジでは、閉鎖骨折モデル標準化された生体力学的条件を提供を治癒が理想的に使われることができますユニークなインプラントです。
Introduction
マウスの骨治療の研究は、大きな需要、抗体や遺伝子組み換え動物の広いスペクトルのためこれらの事実は、骨治癒1の分子機構を研究することを。過去数年間では、癒しモデルのマウスがされている別の骨は2を開発しました。これらのモデルは、オープン モデルである骨は切り離した骨オープンの横外科的アプローチを使用しておよび Bonnares、アインホルン3で導入された破壊モデルに基づく骨がフラクチャされて閉鎖のモデルに分けることができます。この手法を使用すると、標準化された横骨折は 3 点曲げデバイスによって作り出すことが、主要な軟部組織の外傷を避ける低侵襲技術で小さな内側 parapatellar 切開髄内インプラントを挿入できます。
髄内ネジは、マウスの閉鎖骨折の安定化のために適用できます。ネジは回転と軸の安定性を提供しています。これは近位撚り糸と、遠位の頭4破壊圧縮によって達成されます。ねじのそれ以上の利点は単純な手技、invasivity、低の低グレード インプラントの重量および、特に、他の髄内と比較して標準化され、制御された生体力学的条件を提供する高い安定性インプラントの5を。実際には、最も閉鎖骨折モデルにおけるフラグメントは回転と軸の安定性の完全な欠如とピンの高リスクに関連付けられている単純なピンによってだけ安定して脱臼骨折のも。これは著しく治癒遅延または非組合結成があります癒しのプロセスを影響します。
骨折固定器具の安定性では、癒しのプロセス6、7の途方もない影響が知られています。高剛性固定結果膜内癒し癒しの軟骨内で結果を破壊ギャップの micromovements を可能性があります、以下の剛性固定。髄内ネジと破壊の安定化は、主に、軟骨とヒーリング大量カルス組織の特に骨折治癒の 2 週間後を示しています。カルス組織の大規模な量を収穫する可能性異なった技術によって複数のパラメーターの解析が可能。 にします。
ここでは、設計とその長所と短所、正常軟骨内骨の治癒に関する実験的研究だけでなく、マウスで髄内ねじの応用について報告する.
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Protocol
すべてのプロシージャの実験動物の使用のための健康の国民の協会ガイドラインに従って行われ、制度ガイドライン (Landesamt für Verbraucherschutz、Zentralstelle Amtstierärztlicher した、ザールブリュッケン、ドイツ)。
1. 手術器械やインプラントの準備
- 器具ボックスからメスの刃 (サイズ 15)、小さい綿棒、微細鉗子、27 G 針、5-0 の非吸収性縫合糸、はさみ、ニードル ホルダーを選択します。
- 髄内ねじ、ガイド ワイヤ (直径 0.3/0.2 mm、長さ 10 cm) を開梱、センタリング ドリル ビット (0.5 mm 径) と手ドリル (図 1;材料の表を参照してください)。
注: 髄内ねじ (直径 0.5 mm、長さ 17.2 mm) は、大腿骨への逆行性注入用医療グレード ステンレス鋼の行われます。ネジにはヒントと遠位円錐形の頭 (直径 0.8 mm、0.9 mm の長さ) 軸と回転の安定性と同様、破壊圧縮を達成するために、(直径 0.2 mm、0.4 mm) の鼻を持つ近位部スレッド (直径 0.5 mm、4 mm)。 - インプラントと 5 分間消毒ソリューション (96% アルコール) にすべての手術器具を公開または (蒸気滅菌、130 ° C、25 分) それらを殺菌します。消毒や殺菌の後操作布に楽器を配置します。位置操作布小動物操作テーブルに隣接。
2. 動物、麻酔、鎮痛
- ひずみ、対処されて研究の質問によるとマウスの性別や年齢を選択します。
注: この研究のため 12-14 週齢雄 CD 1 マウスが使用されました。髄内のネジを使用する適切な体重は 25-35 g の間です。 - キシラジンと 75 mg/kg のケタミンを 15 mg/kg の腹腔内注入マウスを麻酔します。つま先ピンチして、anesthetization を確認します。麻酔中に乾燥から動物の目を保護するために目を潤滑します。麻酔導入後、体温を一定に保つための放熱器の下にマウスを配置します。中には、動物を麻酔の適切な面を確保するため繰り返しつま先ピンチを監視しました。
- 鎮痛のため飲料水 (1.0 mg/mL) にトラマドール塩酸塩を手術前に手術後 3 日目まで、1 日目から適用されます。
注: 鎮痛および感染予防する必要があります国と機関のそれぞれのガイドラインに一致して実験が実行されます。
3. 手術の手順と髄内ネジ注入
- 術前に右後ろ足全体を剃るし、脱毛クリームを適用します。5 分後クリームを取り出して水で脚をきれい。96% のアルコールで消毒ソリューションを適用します。Betadine またはクロルヘキシジンは、完全な無菌状態を確保するためアルコールに追加できます。
- 無菌条件下で仰臥位小さな動物操作テーブルの上にマウスを配置します。膝の顆に前方アプローチを許可する右の膝を曲げます。メス刃を使用、右膝に 5 mm 内側 parapatellar 切開を実行します。
- メスの刃と綿棒で慎重に膝蓋靭帯を動員します。大腿骨の顆間のノッチを公開する微細鉗子で膝蓋骨を横方向にシフトし。
- 両顆と大腿骨のちょうど真ん中に顆間のノッチを開きます。ドリル穴の深さ 1.0 mm を超えないことを確認します。
- 手動の低速と 45 ° オフセット 0.5 mm ドリル刃と手ドリル (図 1とD図 2) の中心を使用して大腿骨軸に腹に掘削を開始します。掘削中に継続的に 0 ° オフセット (大腿骨の骨軸と平行) に角を小さきます。掘削深さ 1.0 mm に達すると停止します。
- 顆間ノッチで骨を開いたら、大腿骨の全体の長さの髄腔に 27 G の針を挿入します。27 G 針の回転運動を介して手動で大腿骨の髄腔を連します。前方の針をプッシュすると、近位大転子で皮質骨を穿孔します。
- 27 G 針を除去し、大腿骨の遠位部をガイドワイヤーを適用します。
- ガイドワイヤー近位メス刃 (サイズ 15) して皮膚切開を行い、ガイド線の両端が外までガイドワイヤーを前進します。場所でガイドの線を維持することを確認します。
- ギロチンを使用して定義された閉じた破壊を作成します。
- ギロチンの下で右の足と横方向の位置にマウスを配置します。大腿骨の骨幹の部分がギロチンの真ん中に配置されていることを確認します。
- 定義された距離 25.5 cm から (200 g) の重量をドロップします。
- 破壊構成破壊位置と x 線装置を使用してガイド線 (図 3) の位置制御 (材料の表を参照してください)。
- 0.2 mm のガイドワイヤーを遠位端鼻と髄内ネジを接続し、連続的な圧力と時計回りの回転の下で大腿骨に挿入します。
- 十分なトルクが達成されるとき、ドライブ シャフトのせん断強度。
- 近位ガイド ワイヤを削除します。
- 膝蓋骨の位置を変更し、5-0 合成、モノフィラメント、裁断ポリプロピレン縫合糸を使用して 1 つの単一の縫合と筋肉に膝蓋腱を修正します。同じ材料、サイズの単一の縫合糸を使用して傷を閉じる。フラグメントと行えた x 線装置を使用して、ネジ位置の削減を制御 (材料の表を参照してください)。
- 麻酔から回復するまでは、放熱器の下で動物を飼います。放置しないでください、動物まで腹臥床を維持するために十分な意識を取り戻しています。動物を飼養施設で単一のケージに戻ります。彼らは完全に麻酔から回復している場合でも、最初の 24 時間中に他の動物の会社に動物を返しません。
- 毎日注意深く動物を監視します。最初の 3 日間投与量 1.0 mg/mL の飲料水にトラマドール塩酸塩を使用して術後鎮痛を維持します。発声、落ち着きのなさ、モビリティ、新郎に障害、異常姿勢、環境の中で通常の関心の欠如の欠如によって示されるように鎮痛を続ける場合、手術後に、4 日目、動物はまだ痛みの証拠を示します。鎮痛を終了するときに動物が痛みのないです。
- 実験の終わりには、バルビツール酸塩の過剰摂取によって動物を安楽死させます。
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Representative Results
創傷閉鎖に皮膚切開から営業時間 20 分であった。ステレオ顕微鏡することがなく手術が行えます。術後、毎日動物を監視しました。動物のどれもこの期間後痛みの形跡が見られたために、術後鎮痛が 2 日後終了しました。動物は術後後 2 日以内通常荷重をまた示した。全体の観察期間中に創感染は認められなかった。
放射線解析カルス組織破壊の橋渡し (図 4 a) の明白な形成を示した 2 週間後。5 週間後、破壊が癒されましたと骨膜のカルスはほぼ完全に改造 (図 4 b)。
カルスと 2 週間後の断層破砕帯の組織学的解析は、軟骨内軟骨軟骨処理中に構築とヒーリングの典型的な組織分布を示した骨 (図 5 a) を不織布と。5 週間後に軟骨組織が姿を消したし、編まれた骨は、正常解剖を再構成するために層状骨と骨 (図 5 b) の耐荷特性に変換されました。
生体力学的解析後 2 週間に 37% 対側のフラクチャされていない骨と比較して曲げ剛性が示されています。5 週間後曲げ剛性はほぼ 100% の完全治癒 (図 6) を示すだった。
図 1: インプラントします。A.髄内ネジ (直径 0.5 mm、長さ 17.2 mm)、円錐形の頭 (直径 0.8 mm、0.9 mm の長さ) 遠位と近位鼻 (直径 0.2 mm、0.4 mm 長さ) スレッド (直径 0.5 mm、4 mm)。B. (0.3/0.2 mm 径、長さ 10 cm) のガイド線。C. センタリング ドリル刃 (直径 0.5 mm)。D.手ドリル。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: エントリを示す大腿骨顆の模式図は、髄内ネジのポイントします。大腿骨顆顆間ノッチを前後の表示 (左) と矢状ビュー (右)。十字架 (左) 髄内ネジのエントリ ポイント、(右) の矢印が掘削を開始する大腿骨軸に対して 45 ° オフセットを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 横骨折と挿入したガイドワイヤー大腿骨レントゲン。レントゲン写真は、大腿骨 (矢印) とブリッジ骨折髄腔内ガイド ワイヤの骨幹部横骨折構成を示します。縮尺記号を表す 5 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 骨の治癒の 2 と 5 週間後のレントゲン写真です。A.明らかなカルス形成を示す 2 週間後ネジで安定した大腿骨のレントゲン解析。B. 5 週間後ネジで安定したカルスの改造と破壊のほぼ完全な治癒を示す大腿骨レントゲン解析。縮尺記号を表す 5 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 骨の治癒の 2 と 5 週間後組織学的セクション。A.大腿骨の軟骨内骨軟骨 (c) とカルス内の骨 (b) 組織の治癒の間に典型的な組織分布を示す 2 週間後にネジを使って安定化の組織学的解析。B. 5 週間後ネジで安定した層板骨にほぼ完全な改造を示す大腿骨の組織学的解析。ヒアリン方法に従って組織切片染色.スケール バーを表す 1000 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 生体力学的解析します。2 週間後に曲げ剛性の力学的解析 (白いバー、n = 9) と 5 週間 (黒いバー、n = 8)。曲げ剛性が対側非骨折大腿骨に % で与えられます。データは、平均 ± 標準誤差平均 (SEM) として与えられている * p < 2 週間対 0.05。正規分布 (コルモゴロフ-スミルノフ検定) と等しい分散 (F 検定) のための仮定を証明した後 Student´s t 検定を用いて 2 つの実験群間の比較を行った。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
外科的処置の重要なステップのリーマの骨軸に平行大腿骨顆顆間ノッチだけでなく、針の最適な方向の真ん中にネジ注入の正しいエントリ ポイントを見つけることが、髄腔。不適切なエントリの位置を避けるためには、外科医が最適な表示を達成するまで切り込みを準備しなければなりません。リーマ加工中には方向を制御するため、マウスの大腿骨を安定した位置に指で負うべき。さらに重要なステップだ大腿骨にネジの挿入ガイドワイヤー ガイドワイヤー脱臼骨折の近位骨片から抜け出すことができます。この場合、外科医は骨片を再度、スレッドしようことができますが、この演習がほとんど成功しないと動物は、研究から除外する必要があります。
さらに、手術は、いくつかの合併症を開発可能性があります。たとえば、乳歯に最適なビューを取得する横方向にシフトされている膝蓋靱帯が破裂します。スクリュー挿入後、靭帯の縫合が必要です。乳歯の骨を開くと髄腔リーマの間に乳歯がバーストします。この場合、ネジは遠位端で適切に修正できないし、破壊の圧縮効果が得られないため、トラブルシューティングの可能性はないです。別の合併症は、挿入したガイドワイヤーまたは骨から不適切な位置の転位。この合併症は、手術中に正しい配置を確認する挿入後レントゲン解析によって、注意して取り扱うことにより削減できます。さらに、外科医は注意を払う必要がネジの突起がマウスの移動を制限するまたは破壊圧縮を減らすため完全にねじを挿入します。したがって、x 線装置、手術のために必須。手術の最後にレントゲン写真を確認した後動物だけが研究プロトコルに含まれます。
ネジの頭は、特別な除去器に接続ことができますまたは、代わりに、ネジはニードル ホルダーも削除できますので、任意の困難もなく実験の終わりに髄内ネジの除去を実行できます。
技術の 1 つの制限は、髄内ネジは定義された長さ 17.2 mm の 1 サイズだけで会社によって提供したがって、大腿骨のサイズを考慮しなければならないことです。髄内ねじの使用にさらに制限が生体内でマイクロが計算された断層レントゲン写真撮影 - (CT)、治癒過程の磁気共鳴画像 (MRI) 解析が画像に影響を与えるインプラント材料のためにほとんど不可能品質。したがって、これらの分析は、安楽死と研究期間の終わりにインプラントの除去後にのみ実行できます。最後に、ネジは近位の糸と遠位部の頭部によって骨片の圧縮による軸の安定性を実現するため、骨欠損の治癒を分析する使用できません。
骨治療の研究を使用していずれか8,9,10、11,12,13,14閉じたり4,15、 16,17骨モデルをヒーリングします。開いて骨治癒モデルは、閉じた骨治癒モデル、顕著なカルス形成を伴わない癒しの膜内の多量の結果と比較してフラグメントのより厳格な固定を許可します。オープン モデルは小さなカルス形成に関連付けられて、ために、これらのモデルは生化学と分子解析のカルス組織の大きな金額を必要とする実験に好まれない可能性があります。オープン モデルのそれ以上の不利な点は主要な軟部組織の外傷と侵襲的外側アプローチの必要性です。これに対し、クローズド モデルの使用わずかに少ない侵襲切開を必要があります。今までいくつかのクローズド モデルはマウス2に存在します。
閉じた骨モデルを癒し、大抵単純な髄内ピンを使用しています。ただし、この手法には、明確な欠点があります。特に、軸と回転の安定性の欠如。異種癒し応答5の可能性があります。骨の治癒のメカニズムを分析しようとする最近の研究がまだマウスモデル骨折だけピンで安定した、または不安定7 が出るを使用18実験結果に影響を与えるこの不利な点は知られているが、.マウスでも使用安定した骨接合技術、臨床練習で使用されるに匹敵するべきであると考えています。軸と回転安定性を達成するために髄内ねじによって開発された圧縮破壊を誘発する頭遠位と近位スレッド。関心の髄内ネジの適用は厳格な固定を作り出さないし、したがって、髄内ネジで安定した骨折大腿骨のねじれ剛性は骨折大腿骨のそれに比較して有意に低い創外固定器またはロック プレート5によって安定化されました。ただし、以下の剛性固定は軟骨内骨の治癒、勉強のみ以下の剛性固定により、軟骨内の癒しのプロセスを引き起こす骨の断片の micromovements です。それにもかかわらず、ex vivo 研究以前のように髄内ネジは異なる軸と回転の安定を生成します。生体力学的解析は 0.34 ± 0.18 のねじり剛性を実現した髄内ねじ明らかに Nmm/° と比較して有意に高値である従来のピンと達成 (0.00 ± 0.00 Nmm/°)5。したがって、ここで紹介した髄内ネジは、低侵襲技術で使用できる、マウスの研究軟骨骨折治癒のための標準化された生体力学的条件を提供する唯一のインプラントです。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、RISystem AG は、スイスのダボスによって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse Screw | RISystem AG | 221,100 | |
| Guide wire | RISystem AG | 521,100 | |
| Centering bit | RISystem AG | 590,205 | |
| Hand drill | RISystem AG | 390,130 | |
| Cotton-Swab (150 mm, small head) | Fink Walter GmbH | 8822428 | |
| Suture (5-0 Prolene) | Ethicon | 8614H | |
| Forceps | Braun Aesculap AG &CoKG | BD520R | |
| Scissors | Braun Aesculap AG &CoKG | BC100R | |
| Needle holder | Braun Aesculap AG &CoKG | BM024R | |
| 27 G needle | Braun Melsungen AG | 9186182 | |
| Scalpel blade size 15 | Braun Aesculap AG &CoKG | 16600525 | |
| Heat radiator | Sanitas | 605.25 | |
| Depilatory cream | Asid bonz GmbH | NDXZ10 | |
| Eye lubricant | Bayer Vital GmbH | 2182442 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH | 1320422 | |
| Ketamine | Serumwerke Bernburg | 7005294 | |
| Tramadol | Grünenthal GmbH | 2256241 | |
| Disinfection solution (SoftaseptN) | Braun Melsungen AG | 8505018 | |
| CD-1 mice | Charles River | 22 | |
| X-ray Device | Faxitron MX-20, Faxitron X-ray Corporation | 2321A0988 | |
| Fracture device small | RISystem AG | 891,100 |
References
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