Summary
本协议描述了一种微创内固定技术, 采用髓内螺钉规范化稳定股骨骨折, 可用于分析软骨骨愈合的小鼠。
Abstract
骨愈合模型是必要的分析骨折愈合的复杂机制, 以改善临床骨折治疗。在过去的十年中, 在骨科研究中增加了老鼠模型的使用, 这很可能是因为老鼠模型提供了大量的基因改良菌株和特殊的抗体来分析骨折愈合的分子机制。为了控制生物力学条件, 具有良好特征的内固定技术是强制性的, 也在小鼠。在这里, 我们报告的设计和使用闭合骨愈合模型, 以稳定股骨骨折的小鼠。采用医用不锈钢制成的髓内螺钉, 通过与主要使用的简单髓内针相比, 可提供轴向和旋转稳定性, 这表明完全缺乏轴向和旋转稳定性。用髓内螺钉实现的稳定性可以分析软骨愈合。大量的愈伤组织, 在与螺钉稳定后接受, 提供了理想的条件, 以收获组织的生物化学和分子分析。螺钉使用的另一个好处是, 螺钉可以用微创技术插入股骨, 而不会引起软组织损伤。总之, 螺钉是一种独特的植入物, 最好能用于闭合性骨折愈合模型, 提供标准化的生物力学条件。
Introduction
由于广泛的抗体和基因改良的动物, 小鼠的骨愈合研究是非常需要的。这些事实允许研究骨骼愈合的分子机制1。在过去的几年中, 不同的骨骼愈合模型的小鼠已经开发了2。这些模型可以分为开放模型, 其中骨骼是 osteotomized 使用开放的外侧手术方法和封闭模型, 其中骨是骨折的基础上, 由 Bonnares 和埃霍恩介绍的断裂模型3。使用这种技术, 一个标准化的横向骨折可以由一个3点弯曲装置和髓内植入物可以插入通过一个小的内侧 parapatellar 切口的微创技术, 以避免重大软组织创伤。
髓内螺钉可用于小鼠闭合性骨折的稳定。螺杆提供旋转和轴向稳定性。这是通过断开压缩通过近端线程和远端头4实现的。螺钉的进一步优点是手术技术简单, invasivity 低, 种植体重量低, 最显著的是, 与其他髓内固定相比, 提供标准化和可控制的生物力学条件的稳定性更高。植入5。事实上, 在最闭合的断裂模型中, 碎片只通过简单的针脚稳定, 这与完全缺乏旋转和轴向稳定性以及高的针脚风险和断裂脱位有关。这会明显影响愈合过程, 这可能导致延迟愈合或非联合形成。
众所周知, 骨折固定的稳定性对愈合过程有巨大影响6,7。高刚性固定的结果膜内愈合, 而不刚性固定, 这可能允许 micromovements 在骨折间隙, 导致软骨愈合。骨折与髓内螺钉的稳定主要表现为软骨愈合与大量的愈伤组织, 特别是经过2周的骨折愈合。收获大量愈伤组织的可能性可以通过不同的技术分析多种参数。
本文报道了小鼠髓内螺钉的设计和应用, 以及在正常软骨骨愈合实验研究中的优缺点。
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Protocol
所有的程序都是根据国家卫生研究院关于使用实验动物的指导方针进行的, 并遵循机构指南 (Landesamt Verbraucherschutz、Zentralstelle Amtstierärztlicher Dienst、萨尔布吕肯、德国)。
1. 外科器械和植入物的制备
- 选择手术刀刀片 (大小 15), 小拭子, 细钳, 27 克针, 非可吸收5-0 缝合, 剪刀和针持有人从显微外科仪器盒。
- 解锁髓内螺钉、导丝 (直径 0.3/0.2 毫米、10厘米长)、定心钻头 (0.5 毫米直径) 和手钻 (图 1; 请参阅材料表)。
注: 髓内螺钉 (0.5 毫米直径, 17.2 毫米长度) 是由医疗级不锈钢制成, 用于逆行植入股骨。该螺钉有一个近端螺纹 (直径0.5 毫米, 4 毫米长度) 与鼻子 (0.2 毫米直径, 0.4 毫米长度) 在尖端和远端锥形头 (0.8 毫米直径, 0.9 毫米长度), 以实现骨折压缩以及轴向和旋转稳定性。 - 将植入物和所有手术器械暴露在消毒液中 (96% 酒精) 5 分钟或消毒 (蒸汽灭菌, 130 摄氏度, 25 分钟)。消毒或灭菌后, 将仪器放置在操作布上。将操作布直接放置在小动物操作桌旁。
2. 动物、麻醉和镇痛
- 根据所讨论的研究问题, 选择小鼠的应变、年龄和性别。
注: 本研究使用 12-至14周的雄性 CD-1 小鼠。适当的体重使用髓内螺钉是在25-35 克之间。 - 麻醉小鼠腹腔注射15毫克/千克甲苯噻嗪和75毫克/千克氯胺酮。通过脚趾夹来确认麻醉。使用眼部润滑剂, 以保护动物的眼睛在麻醉期间的干燥。麻醉后, 将鼠标置于散热器下, 保持体温恒定。在手术过程中, 动物受到反复脚趾捏的监测, 以确保适当的麻醉面。
- 应用盐酸曲马多在饮用水 (1.0 毫克/毫升) 镇痛从1天之前的手术, 直到3天手术后。
注: 镇痛和感染预防应符合国家和机构在进行实验的相关指导方针。
3. 外科手术和髓内螺钉植入术
- 手术前, 剃掉整条右后腿, 涂上脱毛膏。5分钟后, 取出奶油, 用清水清洁腿部。然后, 使用96% 酒精消毒液。Betadine 或洗必泰可以添加到酒精, 以确保完全无菌。
- 在无菌条件下, 将鼠标放在小动物操作台上的仰卧位上。弯曲右膝, 允许前路髁膝。使用手术刀刀片在右膝上执行5毫米内侧 parapatellar 切口。
- 用手术刀刀片和拭子仔细地调动髌骨韧带。然后, 用细钳将髌骨侧面移位, 以暴露股骨髁间凹槽。
- 在两个髁之间, 在股骨中部完全打开髁间凹槽。请确保钻孔的深度不要超过1.0 毫米。
- 使用 0.5 mm 定心钻头和手钻 (图 1C和D,图 2), 以慢速和45°偏移腹部到股骨轴进行手动钻孔。在钻探过程中, 持续减少角度到0°偏移 (平行与骨轴的股骨)。当达到1.0 毫米深度时, 停止钻孔。
- 在髁间凹槽处打开骨后, 将27克针插入髓内腔, 使其在股骨的全长。通过27克针的旋转运动, 手动将股骨髓内腔固定。向前推针, 以穿孔的皮质骨在大转子下部。
- 取出27克针, 并将导丝通过股骨远端。
- 用手术刀刀片 (尺寸 15) 在导丝上进行皮肤切口, 并将导丝向前推, 直到导丝两端都在外面。请务必把导丝放到位。
- 使用断头台创建定义闭合的断裂。
- 将鼠标放在断头台下的右腿位置。确保股骨的骨干部分放在断头台的中间。
- 将重量 (200 克) 从所定义的25.5 厘米的距离中除去。
- 使用 x 射线设备控制断开的配置和断开位置以及导丝 (图 3) 的位置 (请参阅材料表)。
- 将髓内螺钉与远端的鼻部连接至0.2 毫米导丝, 并在连续压力下将其插入股骨, 并顺时针旋转。
- 当达到足够扭矩时, 驱动轴的剪切。
- 卸下导丝下部。
- 用5-0 合成、单丝、美容整形聚丙烯缝合术, 将髌骨重新定位, 用一条缝合固定髌骨肌腱。使用相同的材料和大小的单一缝合闭合伤口。使用 x 射线设备控制碎片和螺钉位置放射学上的减少 (请参阅材料表)。
- 把动物放在散热器下, 直到他们从麻醉中恢复。不要离开动物无人看管, 直到他们恢复足够的意识, 以保持腹卧床。把动物送到动物设施的单人笼子里。在头24小时内, 不要将动物送回其他动物的公司, 即使他们已经完全从麻醉中恢复过来。
- 每天仔细监视动物。在头三天内用1.0 毫克/毫升的饮用水维持术后镇痛。继续镇痛如果, 在手术后的4天, 动物仍然显示疼痛的证据, 如发声, 躁动, 缺乏机动性, 没有新郎, 异常的姿势, 和缺乏正常的环境兴趣。当动物无痛时, 终止镇痛。
- 实验结束时, 弄死的巴比妥过量。
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Representative Results
从皮肤切口到伤口闭合的手术时间为20分钟。手术可以在没有立体显微镜的情况下进行。术后每天对动物进行监测。术后镇痛在2天后终止, 因为没有动物在这个时间段后显示疼痛的证据。在手术后2天内, 动物也显示正常的负重。在整个观察期内未观察到伤口感染。
2周后的放射性分析表明, 愈伤组织的形成, 弥合骨折间隙 (图 4A)。5周后, 骨折愈合, 骨膜愈伤组织几乎完全改建 (图 4B)。
2周后愈伤组织和骨折区的组织学分析表明, 在软骨过程和梭织骨中建立的软骨组织软骨愈合的典型组织分布 (图 5A)。5周后, 软骨组织消失, 梭织骨被转换成片状骨, 以重建骨骼的正常解剖和承载特性 (图 5B)。
2周后的生物力学分析表明, 与对侧断开骨相比, 弯曲刚度为37%。5周后, 弯曲刚度几乎为 100%, 表示完全愈合 (图 6)。
图 1: 植入.A.髓内螺钉 (直径0.5 毫米, 17.2 毫米长度), 螺纹 (0.5 毫米直径, 4 毫米长度) 和鼻子 (0.2 毫米直径, 0.4 毫米长度) 近端和圆锥状头 (0.8 毫米直径, 0.9 毫米长度) 远端。B.导丝 (直径 0.3/0.2 毫米, 10 厘米长)。C. 中心钻头 (直径0.5 毫米)。D.手钻。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 股骨髁的示意图, 指示髓内螺钉的入口点.股骨髁的髁间凹槽在前后视 (左) 和矢状视图 (右)。十字 (左) 表示髓内螺钉的入口点, 箭头 (右) 表示要开始钻孔的股骨轴的45°偏移量。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 带横向骨折的股骨的射线照相和插入的导丝.x 线显示股骨 (箭头) 骨干部分的横向骨折结构, 以及髓内腔内连接骨折的导丝。刻度条表示5毫米.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 2 和5周的骨骼愈合后的射线照相.a. 2 周后用螺钉稳定的股骨的影像学分析, 显示明显的愈伤组织形成。B. 5 周后用螺钉固定的股骨的影像学分析, 表明骨折愈合与愈伤组织的重建几乎完全相同。刻度条表示5毫米.请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 在骨骼愈合2和5周后组织学切片.a. 2 周后用螺钉稳定股骨的组织学分析, 表明软骨骨愈合过程中的典型组织分布 (c) 及愈伤组织内的骨骼 (b)。B.在5周后用螺钉稳定股骨的组织学分析, 表明对板层骨的几乎完全重塑。组织学切片根据三色方法染色。刻度条代表1000µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 生物力学分析.2周后弯曲刚度的生物力学分析 (白条、n=9) 和5周 (黑条、n=8)。弯曲刚度的百分比给对侧非骨折股骨。数据作为平均值的标准误差 (SEM), * p < 0.05 vs 2 周。在证明了正态分布 (柯尔莫哥洛夫斯米尔诺夫试验) 和等方差 (F 检验) 假设后, 采用 Student´s t 检验法对两组实验进行了比较。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
手术步骤的关键步骤是找到正确的入口点的螺钉植入在股骨中部髁在髁间凹槽, 以及最佳方向平行的针骨轴为扩孔髓内腔。为了避免输入位置不正确, 外科医生应该准备好切口, 直到达到最佳的视野。为了控制扩孔过程中的定位, 应将小鼠的股骨固定在手指的稳定位置。另一个关键步骤是将螺钉插入到股骨上方的导丝上, 因为导丝可以从近端骨碎片中滑出, 导致骨折脱位。在这种情况下, 外科医生可以尝试再次线程的骨头碎片, 但这一动作大多是不成功的, 和动物, 然后被排除在研究。
此外, 手术过程可能会产生一些并发症。例如, 髌骨韧带, 这是横向转移, 以获得最佳的看法, 髁, 可能会破裂。这需要在螺钉插入后缝合韧带。在打开髁骨和扩髓内腔时, 髁可能爆裂。在这种情况下, 不存在故障排除的可能, 因为螺钉在远端无法充分固定, 并且无法实现对骨折的压缩。另一种并发症是插入的导丝的脱位或骨不正确的位置。这种并发症可以通过谨慎处理和植入后的影像分析来减少, 以确认手术中正确的放置。此外, 外科医生应该注意螺钉完全插入, 因为螺钉的凸出可以限制鼠标的移动或减少骨折的压缩。因此, 一个 x 射线设备是强制性的外科手术。只有在手术结束后的影像证实的动物应纳入研究协议。
在实验结束时将髓内螺钉取出, 可以不碰到任何困难, 因为螺钉的头可以连接到特殊的移除仪上, 或者, 螺钉也可以与针架一起移除。
该技术的一个局限性是, 该公司提供的髓内螺钉只有一个尺寸, 长度为17.2 毫米, 因此必须考虑股骨的大小。对髓内螺钉使用的进一步限制是,体内微计算机断层扫描 (CT) 或磁共振成像 (MRI) 分析的愈合过程几乎是不可能的, 由于植入材料, 影响图像质量.因此, 这些分析只能在安乐死后进行, 并在研究期结束后摘除植入物。最后, 螺钉不能用于分析骨缺损愈合, 因为轴向稳定性是通过对骨碎片的近端螺纹和远端头部的压缩实现的。
骨骼愈合研究使用开放的8,9,10,11,1213,14或关闭4,15, 16,17骨骼愈合模型。开放性骨愈合模型允许更硬的片段固定与闭合骨愈合模型相比, 导致更高的膜内愈合量没有明显的愈伤组织形成。由于开放模型与小愈伤组织的形成有关, 这些模型可能不可取的实验, 需要大量的愈伤组织的生物化学和分子分析。开放模型的一个进一步缺点是需要一个侵入性侧向方法与主要软组织创伤。相比之下, 闭合模型的使用只需要一个较小的侵入性切口。直到现在只有几个闭合的模型在老鼠2中存在。
在闭合的骨头愈合模型, 主要使用一个简单的髓内针。然而, 这种技术有明显的缺点。最明显的是, 缺乏轴向和旋转的稳定性。这可能导致异类愈合响应5。虽然已知这一缺点影响实验结果18, 最近的研究, 打算分析骨骼愈合的机制, 仍然使用小鼠模型, 其中骨折是稳定的只有一个 pin 或甚至左 unstabilized7.我们认为, 稳定的接骨术技术, 可与临床实践中使用的方法相媲美, 也应用于小鼠。为实现轴向和旋转稳定性, 研制了髓内螺钉, 通过远端头和近端螺纹诱导骨折的压缩。有兴趣的是, 髓内螺钉的应用不产生刚性固定, 因此, 与骨折股骨相比, 带髓内螺钉稳定的骨折股骨的扭转刚度明显降低。由外固定架或锁定板5稳定。然而, 要研究软骨骨愈合, 需要一种不太僵硬的固定方法, 因为只有较不刚性的固定, 才能使 micromovements 骨碎片, 从而引发软骨愈合过程。然而, 如前一例活体研究所示, 髓内螺钉产生明显的轴向和旋转稳定性。生物力学分析显示, 髓内螺钉的扭转刚度为 0.34 0.18 Nmm/°, 与传统引脚 (0.00 @ 0.00 Nmm/°)5相比, 这一结果显著提高。因此, 这里介绍的髓内螺钉是唯一的植入物, 可用于微创技术和提供标准化的生物力学条件的研究软骨骨折愈合的小鼠。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的财政利益。
Acknowledgments
这项工作得到了瑞士达沃斯 RISystem 股份公司的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse Screw | RISystem AG | 221,100 | |
| Guide wire | RISystem AG | 521,100 | |
| Centering bit | RISystem AG | 590,205 | |
| Hand drill | RISystem AG | 390,130 | |
| Cotton-Swab (150 mm, small head) | Fink Walter GmbH | 8822428 | |
| Suture (5-0 Prolene) | Ethicon | 8614H | |
| Forceps | Braun Aesculap AG &CoKG | BD520R | |
| Scissors | Braun Aesculap AG &CoKG | BC100R | |
| Needle holder | Braun Aesculap AG &CoKG | BM024R | |
| 27 G needle | Braun Melsungen AG | 9186182 | |
| Scalpel blade size 15 | Braun Aesculap AG &CoKG | 16600525 | |
| Heat radiator | Sanitas | 605.25 | |
| Depilatory cream | Asid bonz GmbH | NDXZ10 | |
| Eye lubricant | Bayer Vital GmbH | 2182442 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH | 1320422 | |
| Ketamine | Serumwerke Bernburg | 7005294 | |
| Tramadol | Grünenthal GmbH | 2256241 | |
| Disinfection solution (SoftaseptN) | Braun Melsungen AG | 8505018 | |
| CD-1 mice | Charles River | 22 | |
| X-ray Device | Faxitron MX-20, Faxitron X-ray Corporation | 2321A0988 | |
| Fracture device small | RISystem AG | 891,100 |
References
- Jacenko, O., Olsen, B. R. Transgenic mouse models in studies of skeletal disorders. J Rheumatol Suppl. 43, 39-41 (1995).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. J Orthop Res. 2 (1), 97-101 (1984).
- Holstein, J. H., et al. Development of a stable closed femoral fracture model in mice. J Surg Res. 153 (1), 71-75 (2009).
- Histing, T., et al. Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture. J Orthop Res. 27 (9), 1152-1156 (2009).
- Claes, L., Augat, P., Suger, G., Wilke, H. J. Influence of size and stability of the osteotomy gap on the success of fracture healing. J Orthop Res. 15 (4), 577-584 (1997).
- Histing, T., et al. Characterization of the healing process in non-stabilized and stabilized femur fractures in mice. Arch Orthop Trauma Surg. 136 (2), 203-211 (2016).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J Orthop Res. 20 (5), 1091-1098 (2002).
- Cheung, K. M., Kaluarachi, K., Andrew, G., Lu, W., Chan, D., Cheah, K. S. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21 (4), 685-690 (2003).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. J Biomech. 41 (8), 1689-1696 (2008).
- Histing, T., et al. An internal locking plate to study intramembranous bone healing in a mouse femur fracture model. J Orthop Res. 28 (3), 397-402 (2010).
- Garcia, P., et al. The LockingMouseNail-a new implant for standardized stable osteosynthesis in mice. J Surg Res. 169 (2), 220-226 (2011).
- Histing, T., Klein, M., Stieger, A., Stenger, D., Steck, R., Matthys, R., Holstein, J. H., Garcia, P., Pohlemann, T., Menger, M. D. A new model to analyze metaphyseal bone healing in mice. J Surg Res. 178 (2), 715-721 (2012).
- Histing, T., Menger, M. D., Pohlemann, T., Matthys, R., Fritz, T., Garcia, P., Klein, M. An Intramedullary Locking Nail for Standardized Fixation of Femur Osteotomies to Analyze Normal and Defective Bone Healing in Mice. J Vis Exp. (117), (2016).
- Hiltunen, A., Vuorio, E., Aro, H. T. A standardized experimental fracture in the mouse tibia. J Orthop Res. 11 (2), 305-312 (1993).
- Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. Characterization of a closed femur fracture model in mice. J Orthop Trauma. 18 (10), 687-695 (2004).
- Holstein, J. H., Menger, M. D., Culemann, U., Meier, C., Pohlemann, T. Development of a locking femur nail for mice. J Biomech. 40 (1), 215-219 (2007).
- Claes, L. E., et al. Effects of mechanical factors on the fracture healing process. Clin Orthop Relat Res. 355 Suppl, S132-S147 (1998).
