Summary
Her beskriver vi en detaljert protokoll for invasiv målinger av hemodynamic parametere inkludert portalen press, splanchnic blodstrøm og systemisk hemodynamics for å karakterisere portalen Hypertensiv syndrom i rotter.
Abstract
Dette er en detaljert protokoll som beskriver invasiv hemodynamic mål i cirrhotic rotter karakterisering av portalen Hypertensiv syndrom. Portal hypertensjon (ft) på grunn av skrumplever er ansvarlig for de mest alvorlige komplikasjonene hos pasienter med leversykdom. Hele bildet av portalen Hypertensiv syndrom er preget av økt portalen Press (PP) på grunn av økt intrahepatic vascular motstand (IHVR), hyperdynamic sirkulasjon og økt splanchnic blodstrøm. Progressiv splanchnic arteriell vasodilatasjon og økt cardiac utgang med forhøyet hjertefrekvens (HR) men arteriell lavtrykk karakteriserer portalen Hypertensiv syndromet.
Romanen terapi for tiden blir utviklet som mål å redusere PP av enten målretting IHVR eller økt splanchnic blodstrøm- men bivirkninger på systemisk hemodynamics kan oppstå. Dermed en detaljert karakterisering av portalen venøs, splanchnic og systemisk hemodynamic parametere, blant annet måling av PP, portalen venøs blodstrøm (PVBF), hvem arteriell blod flyte, mener arterieblodtrykk (kart) og HR er nødvendig for prekliniske evaluering av effekten av romanen behandlinger for ft. Vår video artikkel gir leseren en strukturert protokoll for utfører invasiv hemodynamic mål i cirrhotic rotter. Spesielt vi beskrive catheterization femoral arterien og portalen blodåre via en ileocolic stemning og måling av portalen venøs og splanchnic blodstrøm via perivascular Doppler-ultralyd flyt sonder. Representant resultatene av ulike rotte modeller av ft vises.
Introduction
FT defineres som pathologically økt blodtrykk i portalen venøse systemet som kan føre til alvorlige komplikasjoner i pasienter med cirrhose som variceal blødning og ascites1. Mens pre hepatisk (f.eks, portal venetrombose) og etter hepatisk (f.eksBudd-Chiari syndrom) ft sjeldne, intrahepatic ft på grunn av skrumplever representerer den vanligste årsaken til ft2.
Leveren skrumplever, er PP hovedsakelig økt som følge av opphøyet IHVR3. I avanserte stadier, ft er forverret av den økte PVBF på grunn av økt cardiac output og redusert systemisk og splanchnic vascular motstand-definere portalen Hypertensiv syndrom4. Ohms lov (ΔP = Q * R) innebærer at IHVR og blod strømmen er proporsjonal med PP5. Hos pasienter er direkte måling av PP risikabelt og ikke rutinemessig utført; i stedet, hepatic venous press gradient (HVPG) brukes som en indirekte PP6,7. HVPG beregnes ved å trekke gratis hepatic venous press (FHVP) fra det klemt fast hepatic venous presset (WHVP), som er målt bruk en ballong kateter plasseres i hepatic blodåre8. Den fysiologiske HVPG varierer mellom 1 – 5 mmHg, mens en HVPG ≥10 mmHg definerer klinisk signifikant portal hypertensjon (CSPH) og angir økt risiko for ft-relaterte komplikasjoner, som variceal blødning, ascites og hepatisk encefalopati9 . Selv om PP (dvs.HVPG) er den viktigste parameteren for ft alvorlighetsgrad, informasjon om andre komponenter av ft, inkludert alvorlighetsgraden av hyperdynamic sirkulasjon (HR, kart) er splanchnic/hvem arteriell blod flyte og IHVR, avgjørende for få et konstitusjonelt forståelse av forskjellige underliggende mekanismen ft.
Dermed, i motsetning til indirekte målinger av PP hos mennesker, introduserte metodikken for rotter tilbyr fordelen av en direkte måling av PP og gjør opptak av flere hemodynamic parametre som karakteriserer portalen Hypertensiv syndromet. I tillegg direkte måling av PP er en utmerket integrerende avlesning av leveren fibrose (en viktig determinant av IHVR) og overvinner visse begrensninger for fibrose kvantifisering relatert til leveren vev tilfeldige.
Den mest brukte gnager modeller av cirrhotic ft inkluderer kirurgisk galle duct ligatur (BDL), gift-indusert leverskade (dvs., carbon tetrachloride, thioacetamide eller dimethylnitrosamine administrasjonen) og kosthold-indusert metabolske leveren sykdom modeller. Prehepatic (ikke-cirrhotic) ft kan indusert ved delvis portalen blodåre ligatur (PPVL)10.
Små gnagere er godt egnet for metoden presentert, inkludert mus, hamstere, rotter og kaniner, og er forbundet med relativt lave vedlikeholdskostnader. Til tross for det er alle hemodynamic vurderinger er mulig å utføre i mus, bedre nøyaktighet og reproduserbarhet resultater sett med rotter eller større gnagere på grunn av den åpenbare fordelen av dyr størrelse. I tillegg for mikro-instrument og enheter å oppnå lignende hemodynamic parametere i mus. Endelig rotter er mer robust med lavere tilknyttede sykelighet og dødelighet og dermed skolegangen er sannsynligvis lavere i rotter enn i mus.
Presentert metodikken er velegnet for å evaluere spesifikke behandlinger på leversykdom (dvs., anti-fibrotiske eller anti-inflammatoriske legemidler) eller romanen farmakologiske tilnærminger som innflytelse vaskulær tone og/eller endothelial biologi; og derfor sannsynlig effekt hemodynamic parametere i ft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av den etiske komiteen av medisinsk Universität Wien og østerrikske departementet for vitenskap, forskning og økonomi (BMWFW). Prosedyrer må utføres i aseptiske forhold i en operasjon rom eller lignende ren arbeidsområdet siden hemodynamic målingene representerer kirurgiske inngrep. Vanligvis anbefales arbeider i sterile forhold. Når du bruker en innånding anestesi, vurdere ventilasjon kirurgi rommet for sikkerhet. En periode på 40-50 min/dyr har vurderes i tilfelle alle hemodynamic readouts presentert i denne protokollen.
1. pre-kirurgisk forberedelser
- Slå på og kalibrere elektronisk flerkanals opptakeren inkludert press måleomformerne i henhold til produsentens instruksjoner.
- Koble ultralyd flyt sonder (1 mm og 2 mm) til broen forsterkeren.
- Forberede et reservoar av sterile fysiologisk saltløsning, som oppvarmet til kroppstemperatur, 37 ° C, fukte vev eller gasbind komprimerer.
- Post dyr kroppsvekten vekt-justert anestesi og normalisering av hemodynamic parametere etter kroppsvekten.
- Forbered alt utstyr til en innånding anestesi.
Merk: Hvis innånding anestesi og/eller utstyret ikke på området eller gjennomførbart, deretter injeksjon anestesi ketamin og xylazine kan brukes (80-100 mg/kg ketamin med 5-10 mg/kg xylazine i fysiologisk saltløsning, intraperitoneal (IP)). Et nytt dosering av ketamin (redusert dose av 20-30 mg/kg, intramuscular (IM)) etter 30 – 45 min er nødvendig å indusere kontinuerlig kirurgisk-plane anestesi. - Sette dyret under kortsiktige isoflurane anestesi bruker en induksjon boks for innånding anestesi (5 min, 5% v/v isoflurane, 3-4 L O2-flyt). Nøye vippe boksen og sjekk dybden av anestesi ved ubevegelighet status for dyret.
-
Intubate rotte med en egnet Self-Made endotracheal tube.
Merk: For personell som er nye til intubasjon teknikk, analgesi/anestesi (trinn 1,10) kan gis rett etter kortsiktige innånding anestesi gir ekstra tid for intubasjon. Et annet alternativ er en dyr-spesifikke ansiktsmaske for innånding anestesi.- Bruk en Self-Made endotracheal tube fra en modifisert perifert venekateter (14 G). Avskåret håndtering vingene og feste en selvklebende tape loop for bakre fiksering til rottas kinnet å hindre forvridning av endotracheal tube (figur 1A).
- Bruke en Self-Made guide wire enhet fra en modifisert arteriell kanyle som en guide wire holder og en passende Butt-tipped wire (figur 1B).
- Bruk egnet intubasjon skrivebord for riktig plassering av dyret. Plassere dyret i supine posisjon med hodet i vinklet posisjon.
Merk: Hvis ingen intubasjon er tilgjengelig, er det mulig å plassere dyret i supine posisjon med halsen nøye strukket over tabellen kanten. Denne fremgangsmåten anbefales imidlertid ikke på grunn av økt risiko for skader. - Fikse en Sutur bak fortenner på én side av rotte, og forsiktig strekke dyr hals ved å knytte suture på den andre siden (figur 1 c).
- Belyse pre tracheal ventrale krage området av en fokuserte lysstrålen. Spesielt i albino dyr, sikre at stemmebåndene er opplyst gjennom huden for forbedret visualisering og rask intubasjon.
Merk: Bruk en dyr-spesifikke laryngoskop for intubasjon pigmentert dyr. - Ta tungen og trekk det forsiktig ved å bruke to fingre.
- Bruk en bomullspinne behandlet av lidocaine (pumpe spray) å nøye bedøve recurrens området.
- Intubate dyr ved å sette inn den endotracheal tuben mellom de vokale foldene og inn i luftrøret, med støtte fra guide ledningen enheten (figur 1 d).
- Fjerne veiledning ledningen enheten.
- Koble røret til ventilen.
- Starter ventilen bruker riktige innstillinger for dyret (1 L/min O2-flyt, Auto Flow = 90/min; Inspiratorisk Press: 18 mmHg; PIP: 3 mmHg, jeg / E = 1:2) og se etter riktig intubasjon.
Merk: Hvis inflasjonen av magen er kjent, fjerne røret og prøv på nytt. I tillegg sammenligner åndedretts aktiviteten til ventilen rytmen eller plassere to fingre på magen veggen rett over magen å vurdere potensiell økning av magen.
- Starte isoflurane anestesi på 0,5 til 1,0% v/v og 1 L/min O2-Flow umiddelbart etter vellykket intubasjon (figur 2A).
- Løse den endotracheal tuben] ved en transbuccal Sutur gjennom kinnet og festet teip loop av røret.
- Administrere flere anestesi og analgesi av to 1 mL sprøyter, f.eks, ketamin (100 mg/kg) IP (23 G kanyle) [eller im distribuere injisert volumet (dose) i bilaterale injeksjoner i caudal lår muskel (30 G kanyle)] og piritramide (2 mg/kg) av (SC) injeksjon (23 G kanyle). Merk det maksimale volumet i im injeksjoner per injeksjonsstedet (figur 2B).
- Bruk øye ointment. Klipp kroppshår mageregionen og begge indre lår. Desinfiser huden.
Merk: Begge innsiden av lårene bør være barbert for å tillate bruk kontralateral femoral arterien for HR og kart mål i tilfelle catheterization av arteria femoral mislyktes på én side. Barbering på et senere tidspunkt kan forårsake hår forurense kirurgiske feltet. - Fix dyret i supine posisjon på en varmeputen (38 ° C) med teip (figur 2C).
- Overvåke kroppstemperaturen av dyr kontinuerlig, f.eksved hjelp av en endetarms temperatur probe (figur 2D).
- Vurdere anestesi dybden av lokket nedleggelse refleks og tå-knipe-test før eventuelle inngrep eller kirurgi.
2. måling av HR og kart
- Incise huden på indre lår (Velg én side) over antatte plasseringen av arteria femoral ved å løfte huden av tissue tang og fjerne en hudpleie område av ca 2 cm lengde av Mayo saks (figur 3A).
- Avdekke og rett ut dissekere arterie-vene-nerve komplekset som inkluderer arteria femoral fra bindevev (adventitia) ved å åpne flere ganger en hemostat langs komplekset.
- Dissekere arterie-vene-nerve komplekset fra de omkringliggende vev langs ~1–1.5 cm (figur 3B).
- Eventuelt fjerne subkutan/perivascular fett for en bedre oversikt og disseksjon.
Merk: Vær forsiktig når du fjerner subkutan/perivascular fett av cuticle saks, siden skadet blodårene forårsake bleedings. Hvis blødningen er kjent, legge press på blødning området ved hjelp av en liten gasbind eller stoppe blødningen av en hemostat. - Skille arteria femoral fra femur vene og nerve med to høy presisjon 45° vinkel bred punkt tang (anser som femur venen er mest mediale strukturen og arteria femoral ligger mer lateral) (Figur 3 c-F).
- Plasser en ligatur på arteria femoral som distale som mulig og bruke en buet klemme på suture bruke mild langsgående trekkraft arteria femoral.
- Plassere en andre forhåndsinstallert knotted (men ikke lukket knute) Sutur på arteria femoral som proksimale som mulig (Figur 3 g).
- Forberede en egnet kateter (PE-50 for rotte femoral arterien) med en skråstilt (~ 45°) cut-off tips rødmer med heparinized sterilt fysiologisk saltløsning (5 mL sprøyte og 23 G sløv kanyle). Kontroller at ingen luftbobler er innenfor kateter som de hemmer arterielle presset og HR avlesning (Figur 3 H).
- Komprimere arteria femoral ved den proksimale enden av synlige delen bruke en mikro klemme midlertidig stoppe arteriell blodstrøm (figur 3I).
- Perforere arterieveggen på en distale plasseringen av dissekert inndelingen ved å bruke en bøyd kanyle (23 G) mens plassere støtte mikro metall spatula under arteria femoral (figur 3J).
- Nøye catheterize arteria femoral gjennom perforering skråstilt spissen av kateter vendt oppover. Forhånd kateter til mikro klemmen er rundet (Figur 3 K).
Merk: Ved mislykket catheterization av arteria femoral på første forsøk, en mer proksimale andre forsøk kan utføres (Start trinn 2.8). Hvis det oppstår arterien brudd eller alvorlig blødning, ligate eller klemme arteria som proksimale som mulig for å hindre ytterligere blodtap. Hvis blodtap er minimal, prøve catheterizing kontralateral femoral arterien (Start trinn 2.1). - Åpne mikro klemme og sjekk for pulsatile arteriell blod strømning inn kateter (Figur 3 L).
- Forhindre ytterligere tilførsel av blod til kateter ved å blokkere utstrømming av kateter.
- Fastsette kateter i intraluminal plassering ved å lukke forberedt proksimale ligatur rundt femoral arterien og introduserte kateter (Figur 3 M).
- Gjentatte ganger skyll og Sug opp kateter i arteria femoral å vurdere riktig intravascular plassering. Arterial pulsering i kolonnen aspirerede blod bør være lett merkbar.
- Fastsette kateter posisjonen langs fartøyet bruker endene av den distale ligaturen å hindre forvridning og sikre en langsgående plasseringen av kateter (figur 3N).
- I tillegg bånd kateter nær dyret på kirurgisk bordet for å sikre den og forhindre utilsiktet forvridning.
- Koble kateter fylt med fysiologisk saltløsning til trykktransduceren samtidig unngå dannelse av luftbobler.
- Starte innspillingen av HR og kartet med digitalt grensesnitt (figur 3O).
- Dekk eksponert område på indre lår med en liten fuktet gasbind komprimere (Figur 3 P).
- Beregne hyperdynamic (HD) indeksen: HD = kart/HR.
Merk: I Avansert ft, HD indeksen er opphøyet i forhold til eksternt Hypertensiv dyr. Men kan en økning i HD indeks under operasjonen også bety blødning, hypovolemia eller smerte. Hvis innspilte kart er svært lav men signalet er bra og pulsatile flyt oppdages i kateter, sjekk for nivået av anestesi og potensielt redusere nivået av anestesi. Ikke helt stopp isoflurane anestesi, siden dette kan føre til utilstrekkelig anestesi dybde dyrevelferd og god vitenskapelig praksis.
3. overlegen hvem arterien blodstrøm (SMABF)
-
Utføre en median laparotomy (figur 4A-C)
- Løft huden laget med tissue tang 5-6 cm under xiphoid og fjern en tynn stripe av huden med en Mayo scissor over linea alba til xiphoid er nådd.
- Midt i huden snitt, løfte muskel laget av tissue tang langs linea alba lage avstanden mellom bukveggen og splanchnic organer.
- Åpne bukhulen ved incising bukveggen med skalpell på linea alba. Utvide åpningen mens du løfter bukveggen av tissue tang med en Metzenbaum scissor langs linea alba over samme avstand som huden lag.
- Nøye grave intestine bruke våt bomull knopper ved å starte med coecum og plassere den på en stor gasbind komprimere dynket i sterilt fysiologisk saltløsning ved snitt (Figur 4 d-F).
- Pakk tarmen i gasbind omslag og kontroller at det er fuktet sterilt fysiologisk saltløsning (figur 4G).
- Finn og utsette overlegen hvem arterien.
- Dissekere overlegen hvem arterien med to Self-Made sløv 'Schwabl'-kroker: Løft arteria med første kroken og prøver å plassere en andre gjennom samme vev tunnelen. Utsett overlegen hvem arterien langs 5 mm avstand å sikre flyt sonden (1 mm) kan plasseres rundt det (Figur 4 H-K).
Merk: Hvis foretrukket, en presisjon 45° vinkel bred punkt tang kan brukes å løfte arteria også. 'Schwabl'-kroker er forberedt fra 30 G cannulas med rett ut brutt tips bøyd i en krok figur. Hvis pant arterier omfattende, 'Schwabl'-kroker kan være tryggere som bleedings fra collaterals mens dissekerende overlegne hvem arterien kan unngås. Hvis blødning oppstår mens du forbereder overlegen hvem arterien, plassere en liten gasbind komprimere på blødning nettstedet for 1-2 min med lett press. Liten blødning stopper vanligvis raskt; alltid huske på å fukte vev regelmessig (trinn 1.12). Hvis overlegen hvem arterien selv er skadet, må hemodynamic vurderinger bli avsluttet. - Ultralyd gel gjelder ultralyd flyt sondens sensor og legge den til splanchnic hvem arterien. Juster naturlig ruten overlegen hvem arterien (Figur 4L-M).
- Lukk flyt sonden (1 mm), og om nødvendig forsiktig gjelder ekstra ultralyd gel på Doppler sensoren til bedre signalkvalitet. Gjøre ved å bruke en sprøyte (20 mL) fylt med ultralyd gel og en butt-tipped kanyle (18 G) (figur 4N-O).
Merk: Hvis flyt sonden ikke er godt justert langs naturlige fartøyet, spenning forårsake vaskulær innsnevring og dermed turbulente flyt, som reduserer nøyaktigheten av målene som flyt. Prøv å re-align retning av flyt sonden langs naturlige av fartøyet og deretter ordne tilstrekkelig flyt sonden i riktig stilling. - Mål på SMABF og vurdere samsvar av pulsatile flyt til systolisk toppene i femoral arterien innspillingen.
Merk: Hvis innspilte kart er svært lav men signalet er bra og pulsatile flyt oppdages i kateter, når på nivået av anestesi og redusere potensielt nivået av anestesi. Ikke helt stopp isoflurane anestesi, siden dette kan føre til utilstrekkelig dybdeskarpheten anestesi dyrevelferd og god vitenskapelig praksis. - Finne en stabil posisjon av flyt sonden (1 mm) og fikse kabelen til flyt sonden. Starte innspillingen SMABF uten ytterligere manipulasjon av flyt sonden (1 mm) (Figur 4 P).
4. PVBF
- Finn og utsette portalen blodåre på dorsal ansiktet til mesentery som er nær den lever hilum (figur 5A).
- Forsiktig dissekere portalen blodåre fra de omkringliggende vev ved hjelp av en høy presisjon 45° vinkel bred punkt pinsett: isolere portalen blodåre ved gjentatte ganger og forsiktig skyve tang under portalen blodåre opprette en vev tunnel (figur 5B).
Merk: Hvis en blødning oppstår fra periportal vev klargjøring portalen blodåre, bruke lett trykk på blødning nettstedet for 1-2 min med en bomullspinne; Dette stopper ofte blødningen. - Forstørre tunnelen ved å åpne høy presisjon 45° vinkel bred punkt tang sakte og utsette portalen blodåre langs en avstand på 5-6 mm at plasseringen av perivascular flyt sonden (2 mm) (figur 5C, D).
- Ultralyd gel gjelder ultralyd flyt sondens sensor og knytte den til portalen blodåre linje med naturlig ruten (figur 5E).
- Lukke flyt sonden (2 mm) og bruke ekstra ultralyd gel hvis nødvendig, som beskrevet tidligere (trinn 3.7) (figur 5F).
- Kontroller at flyten sonden er plassert i en ikke-konstriktiv vei rundt portalen blodåre (figur 5G).
Merk: Hvis flyt sonden ikke er godt justert langs naturlige fartøyet, spenning forårsake vaskulær innsnevring og dermed turbulente flyt, som reduserer nøyaktigheten av målene som flyt. Prøv å re-align retning av flyt sonden langs naturlige av fartøyet og deretter ordne tilstrekkelig flyt sonden i riktig stilling. - Finne en stabil posisjon av flyt sonden (2 mm) og fikse kabelen til flyt sonden. Deretter starte innspillingen PVBF (figur 5 H).
Merk: Hvis innspilte kart er svært lav men signalet er bra og pulsatile flyt oppdages i kateter, når på nivået av anestesi og redusere potensielt nivået av anestesi. Ikke helt stopp isoflurane anestesi, siden dette kan føre til utilstrekkelig dybdeskarpheten anestesi dyrevelferd og god vitenskapelig praksis.
5. PP
- Forberede et kateter (PE-50 for rotte hvem årer) med en skråstilt (ca 45°) cut-off tips som er spylt med sterilt fysiologisk saltløsning (5 mL sprøyte og sløv 23 G kanyle). Vær oppmerksom på at ingen luftbobler er inne kateter som de hindre PP avlesning (figur 6A).
- Håndtere tarmen med våt hansker og sted det spredt over fingre (figur 6B).
- Optimalisere visningen av hvem vaskulær sengen nær tynntarmen (figur 6C).
- Identifisere de viktigste venøse hvem fartøyene fører til portalen blodåre (vena ileocolica - vena mesenterica superior - vena portae).
- Finne en passende krysset av ileocolonic åre som er tilgjengelig for catheterization.
- Første stikke kateter inn i hvem vevet av perforating visceral peritoneum av mesentery nær vaskulær krysset valgt for catheterization.
- Nøye forhånd skråstilt spissen av kateter nærmere til et knutepunkt for ileocolic fotsporene til en liten inntrykk av fartøyet krysset er sett (figur 6D).
- Til slutt, catheterize det venøse systemet i tråd med begynte fartøyet ruten av perforating vaskulære veggen i krysset vinkel av fartøyene. (Figur 6E).
Merk: Hvis blødning skjer i catheterization i ileocolic venen, bruker en tommel trykk med en liten gasbind komprimere på blødning området. Dette presset bør opprettholdes i 1-2 min å stoppe blødningen. Etterpå Prøv å sette inn kateter på en mer proksimale gren av ileocolic venen. - Fremme kateter nøye videre langs viktigste venøs skipet til portalen blodåre uten perforating venen (figur 6F).
Merk: Holde kateter på nok avstand til flyt sonden plassert rundt den viktigste grenen av portalen blodåre å unngå gjenstander i flyt signalet og hindre perforering av portalen blodåre. - Koble kateter fylt med fysiologisk saltløsning til trykktransduceren samtidig unngå dannelse av luftbobler.
- Starte innspillingen PP.
- Registrere alle hemodynamic parametere samtidig under stabile forhold i flere min (figur 6G, H). Eventuelt portalen venekateter kan løses på plass ved hjelp av vev lim og tarmen kan finnes igjen i bukhulen.
Merk: Hvis innspilte kart er svært lav men signalet er bra og pulsatile flyt oppdages i kateter, når på nivået av anestesi og redusere potensielt nivået av anestesi. Ikke helt stopp isoflurane anestesi, siden dette kan føre til utilstrekkelig dybdeskarpheten anestesi dyrevelferd og god vitenskapelig praksis.
6. IHVR
- Etter ofre dyr, måle leveren vekten. Beregne IHVR: IHVR = PVBF/PP. normalisere PVBF verdien til vekten av leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Avhengig av dyr modellen og alvorlighetsgraden av leversykdom er graden av ft og alvorlighetsgraden av portalen Hypertensiv syndromet forskjellige (figur 7).
BDL modellen fører biliary skrumplever på grunn av cholestasis. Følgelig PP øker over tid og en hyperdynamic sirkulasjon utvikler, sett av en økning på HR og reduksjon av kart. I cirrhotic dyr øke SMABF, PVBF og IHVR også concordantly til nedsatt og hemodynamic endringer (figur 7A-F).
Derimot PPVL forårsaker prehepatic, ikke-cirrhotic ft, som er preget av en umiddelbar økning i PP og tilhørende endringer i systemisk hemodynamics (figur 7G-jeg). Men i tid-retters portosystemic collaterals utarbeide som kan redusere PP.
Hemodynamic verdiene humbug-opererte dyr fortsatt på fysiologiske nivåer og gir betydelige endringer ikke over tid. Portalen trykket i friske SO dyr er maksimalt 5 til 6 mmHg (figur 7J-L).
Figur 1: Self-Made intubasjon enheter: (A) Endotracheal tube. (B) Guide wire enhet (C) intubasjon skrivebord. (D) rør knyttet til guide ledningen enheten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: pre kirurgisk forberedelser: (A) intubasjon dyr. (B) Intramuscular og injeksjon for anestesi. (C) fiksering av dyr på varme mat. (D) Placing og fikse endetarms temperatur probe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: hjertefrekvens (HR) og gjennomsnittlig arterieblodtrykk (kart): (A) huden snitt. (B) utarbeidelsen av det femur vaskulær og nerve strukturer. (C-F) Disseksjon av arteria femoral. (G) distale Sutur og fiksering - proksimale knute pre proksimale Sutur. (H) utarbeidelse av femur kateter. (jeg) plassering av vaskulær mikro klemmen. (J) perforering av arteria femoral med en sving nål. (K) Catheterization av arteria femoral. (L) åpning av mikro klemmen for vurdering av puls. (M) proksimale fiksering av kateter. (N) distale fiksering av kateter. (O) måling av kart og HR. (P) dekker kirurgiske feltet med gjennomvåt liten gasbind komprimere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: overlegen hvem arteriell blod flyte (SMABF): (En-C) Median laparotomy. (D) utgravning av coecum. (E-F) Utgravningen av tarmen. (G) innpakning av tarmen i fuktet gasbind omslag. (H-K) Utarbeidelse av arteria splanchnic hvem med sløv kanyle kroker. (L, M) Vedlegg av flyt sonden. (N) anvendelse av ultralyd gelé sonde flowsensoren. (O) riktige 'ikke-konstriktiv' plasseringen av den av flyt sonden. (P) måling av SMABF. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Portal venøs blodstrøm (PVBF): (A) optimalisert dorsal Vis i portalen blodåre (B) Disseksjon av portalen blodåre fra hvem fettvev. (C) opprette en vev tunnel for portalen blodåre flyt sonden. (D, E) Vedlegg av flyt sonden til portalen blodåre. (F) anvendelse av ultralyd gelé sonde flowsensoren. (G), riktig plassering 'ikke-konstriktiv' av flyt sonden. (H) måling av PVBF. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Portal Press (PP): (A) utarbeidelse av kateter. (B) utarbeidelse av tarmen. (C) optimalisert Vis er viktigste hvem venøs blodkar. (D) perforering visceral peritoneum og fremme av kateter nærmere egnet vaskulær grenen. (E) Catheterization av ileocolic fotsporene i krysset vinkel mellom den viktigste grenen og en side-gren. (F) fremme kateter tips i portalen blodåre nærmere til leveren hilum. (G, H) Måling av SS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: representant resultater: Gang løpet av (A) PP, (B) kart og (C) HR i BDL rotter. Følgelig er endringer i (D) SMABF, (E) PVBF og (F) IHVR observert. I PPVL, er hemodynamic endringer (G) PP, (H) kart og (jeg) HR tydeligst i de tidlige dagene etter operasjonen. I opererte sunn humbug-(så) dyr, (J) PP, (K) kart og (L) HR holde seg innenfor fysiologiske verdier og ikke endres over tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PP er parameteren viktigste utfallet for evaluering av portalen Hypertensiv syndromet og gjenspeiler alvorlighetsgraden av underliggende skrumplever. Både matrix avsettelse (dvs., fibrose) og sinusformet vasokonstriksjon (skyldes økt hepatic uttrykk for vasoconstrictors og redusert respons til vasodilatorer) føre til økt IHVR. Betydningen av PP og dens innvirkning på kronisk leversykdom har vært vist i flere prekliniske11,12,13,14 og kliniske studier15,16, 17 , 18. derfor i cirrhotic pasienter, PP er vanskelig utfallet parameter, og dens reduksjon anbefales av behandling retningslinjer19,20 og forskning mål gjeldende hepatology. Omfattende dyremodeller for å karakterisere og oversette16,21 romanen behandlingstilbud ft22. Denne protokollen presenterer metodikken nødvendig for detaljert hemodynamic karakteristikk, inkludert vurdering av portalen press, hyperdynamic sirkulasjon, splanchnic vasodilatasjon og intrahepatic motstand. For å oppnå en representant og full hemodynamic datasett fra gnager modeller, er erfaring og opplæring av operatoren resultater av største betydning.
Forebygging og kontroll av alvorlig bleedings er spesielt viktige ferdigheter. Sløv og presis forberedelser av vaskulær delene av interesse er avgjørende for å unngå cannulation feil og alvorlige bleedings. Betydelig blodtap har en innvirkning på hemodynamics og utelukker nøyaktige målinger av PP eller kan også føre i døden av laboratoriet dyret. Dokumentet bleedings som har oppstått under målene på protokollene og karakterisere alvorlighetsgraden og plasseringen av blødning.
Av notatet, bruker perivascular ultralyd flyt sonder for å vurdere blodstrøm genererer beregnet og kan bli utsatt for lesing feil, ulike fartøy størrelser og feil sonde justering. En annen teknikk for å måle blodstrøm og spesielt blodstrøm distribusjon (inkludert beregningen av portosystemic skifting) er farget microsphere teknikk23. Men hele organer må være høstet oppløst og analysert, og dette utelater muligheten til å utføre histologiske eller uttrykk analyse. Derfor ultralyd teknikken støtter prinsippene om de tre Rs i Forsøksdyrutvalget (redusere, forbedre og erstatte) av Russell og Burch24. I tillegg er flyt sonder egnet til å overvåke splanchnic blodstrøm i sanntid og parallelt med andre hemodynamic parametere, mens farget microsphere teknikken krever integrere organ (hvem) blodstrøm over tid. Videre farget mikrosfærer, som vanligvis har en diameter på 15 µm, krever en normalfordeling av mikro-fartøy med en diameter < 15 µm i det respektive organer å unngå å bli fanget og immobile, som kan være ikke tilfelle i cirrhotic lever.
Den viktigste begrensningen av denne metoden er behovet for en tilstand av bevisstløshet og anestesi under hemodynamic karakterisering av ft syndromet i dyr. Den vanligste og brukte injeksjon anestesi ketamin/xylazine krever ofte redosing etter 30-45 minutter å få en nødvendig dybdeskarphet anestesi25,26; Dette legger tidspress spesielt hvis feilsøking er nødvendig. Bruke innånding bedøvelse involverer mange fordeler, men spesielt utstyr er nødvendig, og sikkerhet forskrifter relatert til flyktige bedøvelse må følges. Dybden av anestesi kan tilpasses raskt uten å forstyrre kirurgi prosedyrer ved å justere anestesi konsentrasjonen. Den cuffed endotracheal tuben sikrer airways spesielt etter aktivering av frelse av ketamin og ventilasjonen sikrer tilstrekkelig oksygenering og ventilasjon av dyret til å redusere risikoen for anestesi narkotikainduserte dødsfall27. Mens ketamin/xylazine er fortsatt mye forårsaker brukt, lav dose isoflurane anestesi ingen betydelige endringer av hemodynamic eller hjerte i rotter28,29.
Lokal erfaring og reguleringer gir stateoftheart anbefalinger og beste praksis for anestesi, og forskerne må kontinuerlig revurdere typen bedøvelse brukes til å utføre disse hemodynamic vurderinger30. Senere eksperimenter kan bruke telemetri med implantert trådløse press transdusere som vil overvinne de gjeldende begrensninger knyttet til generell anestesi og la hemodynamic karakteristikk av bevisst dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker veterinærer, sykepleiere og dyr voktere ved Center for Biomedical Research for deres kontinuerlig støtte under våre forskningsprosjekter. Forfatterne bekrefter viktig innspill alle korrekturlesere i denne protokollen. Noen av forskningen ble finansiert av "Young Science Award" østerrikske samfunnet av gastroenterologi og Hepatology (ÖGGH) til PS og "Skoda Award" av den østerrikske Society of Internal Medicine til TR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| LabChart 7 Pro software | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | - | Software |
| ML870 PowerLab 8/30 | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | - | Electronic multichannel recorder |
| MLT0380/D | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | - | Pressure transducer (x2: for Portal Pressure and Arterial Pressure) |
| ML112 Quad Bridge Amplifier | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | - | Bridge amplifier |
| TS420 | Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA | - | Flowmeter module |
| Biological Research Apparatus 7025 | UGO BASILE S.R.L., Comerio, Italy | - | Ventilator |
| Vapor 2000 | Dräger Medical AG & Co. KG, Lübeck, Germany | - | Isofluran Vaporizer |
| Perivascular probes (rat) for Transonic systems (Superior Mesenteric Artery) | Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA | #MA1PRB | Ultrasonic flow probe (1mm) |
| Perivascular probes (rat) for Transonic systems (Portal Vein) | Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA | #MA2PSB | Ultrasonic flow probe (2mm) |
| 1st for intubation & 2nd for clean skin incisions | - | - | Mayo scissor [x2] |
| Metzenbaum scissor | - | - | - |
| Cuticle scissor | - | - | - |
| e.g. Adson Brown tissue forceps | - | - | Tissue Forceps |
| High precision 45° angle broad point forceps [x2] | - | - | - |
| Hemostat [x4] | - | - | - |
| e.g. Mikulicz peritoneal clamp | - | - | Curved clamp |
| e.g. Dieffenbach clamp | - | - | Micro clamp |
| e.g. micro spatula with flat ends, width 4 mm, | - | - | Micro metal spatula |
| for transbuccal suture at intubation | - | - | Needle holder |
| Scalpel grip | - | - | - |
| selfmade | - | - | Intubation desk |
| blut, flexible and with a suitable diameter for arterial cannula and venflow | - | - | Blunt steel wire |
| modified arterial line 20G with Flowstich | Becton Dickinson, Farady Road, Swindon, UK | #682245 | Arterial line |
| Heating pad | - | - | - |
| Rectal temerature probe | - | - | - |
| Saline heater | - | - | - |
| Laryngoscope (specific for animal size, e.g. rat) | - | - | - |
| Inductionbox for inhalation anesthesia | - | - | - |
| Scale (able to measure mg) | - | - | - |
| Hair clipper | - | - | - |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| e.g. modified BD Venflon Pro Safety 14GA | Becton Dickinson Infusion Therapy, AB, SE251 06 Helsingborg, Sweden | #393230 | Peripheral venous catheter (14G) |
| Fine-Bore Polyethylene Tubing, ID 0.58mm, OD 0.96mm, Portex, | Smiths Medical International Ltd., Kent, UK | #800/100/200 | Catheter tube (PE-50) |
| e.g. Omnifix-F Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | #9161406V | Syringe 1mL |
| e.g. Injekt Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | #4606051V | Syringe 5mL |
| e.g. Injekt Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | #4606205V | Syringe 20mL |
| e.g. BD Microlance 3, 18G - 1 1/2" | Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain | #304622 | Cannula (18G) |
| e.g. BD Microlance 3, 23G - 1" | Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain | #300800 | Cannula (23G) |
| e.g. BD Microlance 3, 30G - 1/2" | Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain | #304000 | Cannula (30G) |
| e.g. Leukoplast S | BSN medical GmbH, Hamburg, Germany | #47619-00 | Adhesive tape |
| e.g. Gazin RK Mullkompressen (18x8cm) | Lohmann & Rauscher, Vienna, Austria | #10972 | Gauze compress (small) |
| e.g. Gazin RK Mullkompressen (5x5cm) | Lohmann & Rauscher, Vienna, Austria | #10961 | Gauze compress (big) |
| Silk Braided black, USP 4/0, EP 1.5 | SMI AG, St. Vith, Belgium | #2021-04 | Suture (Silk 4/0, EP 1.5) |
| e.g. Mersilk, 2-0 (3 Ph. Eur.), PS-1 Prime | Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Germany | #EH7552 | Transbuccal suture |
| e.g. Cottonbuds (2.2mm, 15cm) | Paul Hartmann AG, Heidenheim, Germany | #967936 | Cotton buds |
| e.g. Vue Ultrasoundgel | Optimum Medical Limited, UK | #1157 | Ultrasound gel |
| e.g. Glubran 2 | Gem srl, Viareggio, Italy | #G-NB2-50 | Tissue glue |
| e.g. Surgical scalpell knife Nr. 10 - carbon steel | Swann-Morton, England, B.S. | #202 | Scalpel Knife |
| Heparin, 5000 i.E./mL (Natriumheparin) | Medicamentum Pharma GmbH, Allerheiligen im Mürztal, Austria | - | Heparin |
| Florane | Aesica Queenborough Ltd., Queenborough, UK | - | Isoflurane |
| OeloVital (5g) | Fresenius Kabi Austira Gmbh, Graz, Austria | - | Eye gel |
| Ketasol | aniMedica GmbH, Senden-Bösensell, Germany | - | Ketamine |
| Rompun | Bayer Austria Ges.m.b.H., Vienna, Austria | - | Xylazine |
| Xylocain 10% Pumpspray | AstraZeneca Österreich GmbH, Vienna, Austria | - | Lidocaine pump spray |
| Dipidolor | Jansen-Cilag Pharma GmbH, Vienna, Austria | - | Piritramide |
| NaCl 0.9% Fresenius, 1L | Fresenius Kabi Austira GmbH, Graz, Austria | #13LIP132 | Physiological saline solution |
References
- Ripoll, C., et al. Hepatic venous pressure gradient predicts clinical decompensation in patients with compensated cirrhosis. Gastroenterology. 133 (2), 481-488 (2007).
- Bosch, J., Groszmann, R. J., Shah, V. H. Evolution in the understanding of the pathophysiological basis of portal hypertension: How changes in paradigm are leading to successful new treatments. J Hepatol. 62, S121-S130 (2015).
- Blachier, M., Leleu, H., Peck-Radosavljevic, M., Valla, D. C., Roudot-Thoraval, F. The burden of liver disease in Europe: a review of available epidemiological data. J Hepatol. 58 (3), 593-608 (2013).
- Colle, I., Geerts, A. M., Van Steenkiste, C., Van Vlierberghe, H. Hemodynamic Changes in Splanchnic Blood Vessels in Portal Hypertension. Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 699-713 (2008).
- Laleman, W., Van Landeghem, L., Wilmer, A., Fevery, J., Nevens, F. Portal hypertension: from pathophysiology to clinical practice. Liver International. 25 (6), 1079-1090 (2005).
- Franchis, R. d Updating Consensus in Portal Hypertension: Report of the Baveno III Consensus Workshop on definitions, methodology and therapeutic strategies in portal hypertension. Journal of Hepatology. 33 (5), 846-852 (2000).
- Zardi, E. M., Di Matteo, F. M., Pacella, C. M., Sanyal, A. J. Invasive and non-invasive techniques for detecting portal hypertension and predicting variceral bleeding in cirrhosis: a review. Annals of medicine. 46 (1), 8-17 (2014).
- Kumar, A., Sharma, P., Sarin, S. K. Hepatic venous pressure gradient measurement: time to learn. Indian J Gastroenterol. 27 (2), 74-80 (2008).
- Tsochatzis, E. A., Bosch, J., Burroughs, A. K. Liver cirrhosis. Lancet. 383 (9930), 1749-1761 (2014).
- Abraldes, J. G., Pasarín, M., García-Pagán, J. C. Animal models of portal hypertension. World Journal of Gastroenterology : WJG. 12 (41), 6577-6584 (2006).
- Reiberger, T., et al. Sorafenib attenuates the portal hypertensive syndrome in partial portal vein ligated rats. Journal of Hepatology. 51 (5), 865-873 (2009).
- Schwabl, P., et al. Pioglitazone decreases portosystemic shunting by modulating inflammation and angiogenesis in cirrhotic and non-cirrhotic portal hypertensive rats. Journal of Hepatology. 60 (6), 1135-1142 (2014).
- Reiberger, T., et al. Nebivolol treatment increases splanchnic blood flow and portal pressure in cirrhotic rats via modulation of nitric oxide signalling. Liver International. 33 (4), 561-568 (2013).
- Schwabl, P., et al. The FXR agonist PX20606 ameliorates portal hypertension by targeting vascular remodelling and sinusoidal dysfunction. Journal of Hepatology. 66 (4), 724-733 (2017).
- Mandorfer, M., et al. Sustained virologic response to interferon-free therapies ameliorates HCV-induced portal hypertension. J Hepatol. 65 (4), 692-699 (2016).
- Schwabl, P., et al. Interferon-free regimens improve portal hypertension and histological necroinflammation in HIV/HCV patients with advanced liver disease. Aliment Pharmacol Ther. 45 (1), 139-149 (2017).
- Reiberger, T., Mandorfer, M. Beta adrenergic blockade and decompensated cirrhosis. Journal of Hepatology. 66 (4), 849-859 (2017).
- Reiberger, T., et al. Carvedilol for primary prophylaxis of variceal bleeding in cirrhotic patients with haemodynamic non-response to propranolol. Gut. 62 (11), 1634-1641 (2013).
- Reiberger, T., et al. Austrian consensus guidelines on the management and treatment of portal hypertension (Billroth III). Wiener klinische Wochenschrift. 129 (3), 135-158 (2017).
- de Franchis, R. Expanding consensus in portal hypertension. Journal of Hepatology. 63 (3), 743-752 (2015).
- Pinter, M., et al. The effects of sorafenib on the portal hypertensive syndrome in patients with liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma - a pilot study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 35 (1), 83-91 (2012).
- Schwabl, P., Laleman, W. Novel treatment options for portal hypertension. Gastroenterol Rep (Oxf). 5 (2), 90-103 (2017).
- Klein, S., Schierwagen, R., Uschner, F., Trebicka, J. Mouse and Rat Models of Induction of Hepatic Fibrosis and Assessment of Portal Hypertension. , (2017).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Langhans, W., Myrtha, A., Riediger, T., Lutz, T. A. Routine animal use procedures. , Institute of Veterinary Physiology, University of Zurich, Physiology and Behavior Laboratory, Institute of Food, Nutrition and Health, ETH Zurich. (2016).
- Animal Care and Use Program. Rat and Mouse anesthesia and analgesia: Formulary and General Drug Information. , The University of British Columbia. (2016).
- Davis, J. A. Current Protocols in Neuroscience. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. Effects of isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl on physiological variables continuously measured by telemetry in Wistar rats. BMC Veterinary Research. 10 (1), 198 (2014).
- Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Influence of anesthetic agent, depth of anesthesia and body temperature on cardiovascular functional parameters in the rat. Laboratory Animals. 48 (1), 6-14 (2014).
- Becker, K., et al. Statement on anesthesia methodologies: Recommondations on anaesthesia methodologies for animal experimentation in rodents and rabbits. , GV-SOLAS - German veterinary association for animal welfare. (2016).
