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Developmental Biology

अलगाव और Arrhythmogenic Cardiomyopathy रोगियों के Endomyocardial Bioptic नमूनों से कार्डियक Mesenchymal Stromal कोशिकाओं के लक्षण वर्णन

Published: February 28, 2018 doi: 10.3791/57263
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 3, 3, 3, 2,3, 1,2, *3, *1
1Vascular Biology and Regenerative Medicine Unit, Centro Cardiologico Monzino-IRCCS, 2Department of Clinical Sciences and Community Health, Università degli Studi di Milano, 3Heart Rhythm Center, Centro Cardiologico Monzino-IRCCS
* These authors contributed equally

Summary

इस लेख में, arrhythmogenic cardiomyopathy रोगियों के endomyocardial bioptic नमूनों से कार्डियक mesenchymal stromal कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक विधि प्रदान की गई है । उनके लक्षण वर्णन और प्रोटोकॉल उनके adipogenic भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए वर्णित हैं ।

Abstract

एक सामांय वयस्क दिल कई विभिंन प्रकार के सेल, जो बीच में कार्डियक mesenchymal stromal कोशिकाओं एक प्रचुर मात्रा में जनसंख्या का प्रतिनिधित्व से बना है । इन कोशिकाओं के अलगाव हृदय रोगों में उनकी भागीदारी का अध्ययन करने की संभावना प्रदान करता है, और इसके अलावा, जैविक तंत्र की जांच करने के लिए एक उपयोगी प्राथमिक सेल मॉडल प्रदान करता है ।

इधर, arrhythmogenic cardiomyopathy मरीजों के bioptic नमूनों से सी-एमएससी के अलगाव के लिए विधि बताई गई है । endomyocardial बायोप्सी नमूना सही वेंट्रिकुलर इलेक्ट्रो-संरचनात्मक मानचित्रण द्वारा visualized निशान करने के लिए आसंन क्षेत्रों में निर्देशित है । collagenase में बायोप्सी के पाचन और संस्कृति माध्यम में एक प्लास्टिक डिश पर उनके चढ़ाना सी एमएससी वृद्धि की अनुमति वर्णित है । अलग कोशिकाओं कई मार्ग के लिए संस्कृति में विस्तारित किया जा सकता है । उनके mesenchymal phenotype की पुष्टि करने के लिए इंयूनो-phenotypical लक्षण वर्णन का विवरण प्रदान किया गया है । सी-एमएससी adipocytes, chondrocytes, और osteoblasts जैसे कई कोशिका प्रकार में अंतर करने में सक्षम हैं: ACM के संदर्भ में, रोगियों के दिलों में adipocyte जमा की विशेषता, सी के adipogenic भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल-एमएससी और लिपिड छोटी बूंद संचय के लक्षण वर्णन कर रहे हैं ।

Introduction

Mesenchymal Stromal कोशिकाओं (एमएससी) कई ऊतकों में एक महत्वपूर्ण सहायक समारोह के साथ वयस्क कोशिकाओं रहे हैं1. अस्थि मज्जा एमएससी के ऐतिहासिक स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन वे अपरा, वसा ऊतक, गर्भनाल रक्त, जिगर, और दिल1,2सहित विभिन्न ऊतकों से अलग किया जा सकता है ।

२००६ में, सेलुलर थेरेपी के लिए इंटरनेशनल सोसायटी (ISCT) निर्दिष्ट, पहली बार के लिए, ंयूनतम मानदंड मानव एमएससी3को परिभाषित करने के लिए । खास तौर पर एमएससी में प्लास्टिक का पालन करने की क्षमता होनी चाहिए । वे विशिष्ट सतह एंटीजन व्यक्त: CD44, CD105, CD29, और CD90 mesenchymal मार्करों के लिए धनात्मकता, और CD14, CD45, CD34, CD31 टेम और endothelial मार्करों के लिए नकारात्मकता एमएससी की विशेषताएं । एचएलए की कमी की अभिव्यक्ति के कारण-डॉ, एमएससी alloreactivity ट्रिगर करने में असमर्थ हैं । इसके अलावा, वे adipogenic, chondrocyte, और osteoblast वंश1,3की ओर अंतर करने की क्षमता के साथ multipotent कोशिकाओं रहे हैं ।

कार्डिएक सेलुलर संरचना पर ध्यान केंद्रित, कार्डियक mesenchymal stromal कोशिकाओं (सी-एमएससी) एक सामान्य वयस्क दिल में प्रचुर मात्रा में हैं4,5. वे दोनों सामांय हृदय समारोह और रोग की स्थिति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । जबकि, शारीरिक, सी-एमएससी एक microenvironment कि मायोकार्डियम के संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता का समर्थन करता है प्रदान करते हैं, हृदय रोगों में वे दिल की चोट के जवाब में सक्रिय कर रहे हैं घाव भरने में भाग लेने और fibrotic remodeling6 ,7.

हाल ही में, arrhythmogenic cardiomyopathy (ACM) वसा प्रतिस्थापन में सी-एमएससी के शामिल होने से8का प्रदर्शन किया गया है । विशेष रूप से, ACM एक आनुवंशिक विकार मुख्य रूप से desmosomal जीन में परिवर्तन की वजह से है कि रोधगलन fibro-फैटी प्रतिस्थापन के लिए सीसा, मुख्य रूप से सही निलय9में है । इस प्रतिस्थापन, epicardium से endocardium तक का विस्तार, एक गैर प्रवाहकीय सब्सट्रेट है कि प्रगतिशील दिल की विफलता को बढ़ाता है और वेंट्रिकुलर अतालता, जो नेतृत्व कर सकते हैं बिगड़ जाती है बनाता है, गंभीर मामलों में, अचानक मौत के लिए. Sommariva एट अल. ACM मरीजों के explanted हृदय वर्गों में उपस्थित पूर्व adipocytes के mesenchymal मूल का प्रदर्शन किया. इसके अलावा, सी-एमएससी ACM दिल desmosomal जीन एक्सप्रेस के endomyocardial बायोप्सी से अलग है और इसलिए उनके उत्परिवर्तनों से प्रभावित किया जा सकता है । विशेष रूप से, adipogenic शर्तों के तहत, ACM सी एमएससी नियंत्रण दिल से उन से अधिक लिपिड जमा । इस सबूत के निष्कर्ष है कि सी-एमएससी दोनों रोग रोगजनन में एक सक्रिय भूमिका है और ACM का अध्ययन करने के लिए एक वैध सेल मॉडल का प्रतिनिधित्व करने की ओर जाता है ।

इस संदर्भ में या अंय हृदय रोग है जिसके लिए एक हृदय बायोप्सी संकेत दिया है में भविष्य के अनुसंधान की सुविधा के लिए, एक विस्तृत प्रोटोकॉल endomyocardial ऊतक के छोटे टुकड़े से सी-एमएससी के अलगाव के लिए प्रस्तुत किया जाता है, उनके विस्तार, उनके इंयूनो-phenotypical लक्षण वर्णन, और adipogenic भेदभाव ।

Protocol

यह दृष्टिकोण हेलसिंकी की घोषणा का अनुपालन करता है और सही वेंट्रिकुलर नमूनों के संग्रह को "Centro Cardiologico Monzino IRCCS" एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित (07/06/2012) किया गया ।

1. समाधान

  1. Iscove के संशोधित Dulbecco के माध्यम (IMDM) के साथ सी-एमएससी कल्चर के लिए TMES मीडियम बनाओ, 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 10 एनजी/एमएल बेसिक fibroblast ग्रोथ फैक्टर, १०,००० यू/एमएल पेनिसिलिन, १०,००० µ g/एमएल Streptomycin, और ०.०२ एम एल-Glutamine के साथ पूरक है । फ़िल्टर TMES मध्यम एक ०.२२ µm बाँझ फिल्टर इकाई का उपयोग कर, और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
  2. collagenase समाधान तैयार करने के लिए, 3 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता के साथ एक अंतिम समाधान प्राप्त करने के लिए IMDM माध्यम में collagenase NB4 मिश्रण reसस्पेंड । भंवर धीरे पाउडर भंग करने के लिए, और एक ०.२ µm सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर collagenase समाधान फिल्टर । Aliquot 2 मिलीलीटर बाँझ ट्यूबों में 1 मिलीलीटर मात्रा और स्टोर में-20 ° c जब तक उपयोग के लिए आवश्यक है ।
  3. टी. ADIPO मीडियम तैयार करने के लिए, IMDM मध्यम के साथ adipogenic मध्यम बनाएं 10% FBS, ०.५ मिमी 3-isobutyl-1-methylxanthine (dimethyl sulfoxide में पूर्व पतला ०.५ मीटर की एकाग्रता पर और में रखा-20 ° c का उपयोग तक), 1 DMSO एम µ (पूर्व पतला DMSO में १०० mm और आगे बाँझ आसुत पानी में 10 मिमी करने के लिए और पतला में रखा-20 ° c का उपयोग तक) और ०.१ mM indomethacin (पूर्व ०.५ मीटर की एकाग्रता पर DMSO में पतला और में रखा-20 ° c उपयोग तक) । एक ०.२२ µm बाँझ फिल्टर इकाई का उपयोग कर टी. ADIPO मध्यम फ़िल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
  4. फॉस्फेट-बफर खारा ०.००६७ एम पीओ4 (पंजाब), ethylenediamine टेट्रा एसिटिक एसिड (EDTA) 5 मिमी, और 5% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर से बना वाशिंग बफर तैयार करें ।
  5. ६०% isopropanol में 1% ओरो पाउडर भंग करके तेल लाल ओ (ओरो) काम समाधान तैयार, 2 एच के लिए मिश्रण है, और एक ०.२२ µm फिल्टर इकाई का उपयोग करने के लिए हालाs हटाने फ़िल्टरिंग । कमरे के तापमान (आरटी) में काम समाधान स्टोर ।

2. कार्डियक Mesenchymal Stromal कोशिकाओं का अलगाव

  1. कार्डिएक बायोप्सी संग्रह और प्रसंस्करण
    नोट:     प्रारंभ करने से पहले, collagenase समाधान और TMES माध्यम तैयार करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    1. ACM endomyocardial बायोप्सी रखो (आमतौर पर के बारे में 5 ऊतक के मिलीग्राम) TMES से भरा एक बाँझ ट्यूब में और यह प्रयोगशाला के लिए परिवहन.
      नोट: ACM बायोप्सी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी ऑपरेटिंग कमरे में एकत्र कर रहे हैं, पिछली रिपोर्टों के अनुसार10। संक्षेप में, इलेक्ट्रो के एकीकरण-संरचनात्मक मानचित्रण और intracardiac इकोकार्डियोग्राफी सही निलय में ( वीडियो 1देखें) endomyocardial बायोप्सी मार्गदर्शन करने के लिए उपयोग किया जाता है (देखें वीडियो 2, प्रतिदीप्तिदर्शन) के सीमा क्षेत्र को पत्राचार में रोगग्रस्त मायोकार्डियम । स्वस्थ नियंत्रण (एचसी) के नमूनों की आपूर्ति एक ऊतक बायो-बैंक द्वारा की जाती है, cadaveric दाताओं की मृत्यु के 24 घंटे के भीतर सही वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार से प्राप्त (आकस्मिक मृत्यु, स्वस्थ विषयों) । परिवहन के दौरान और विच्छेदन करने से पहले, 4 डिग्री सेल्सियस पर TMES में बायोप्सी की दुकान । बायोप्सी संग्रह और ऊतक प्रसंस्करण (अधिकतम 24 एच) के बीच का समय सीमित करें ।
    2. एंजाइमी पाचन के लिए प्रक्रिया को पूरा करने के लिए आवश्यक समाधानों के साथ जैविक सुरक्षा कैबिनेट स्थापित करें ।
    3. डाकू के तहत बंध्याकरण रखो और साधन पर बारी 15 मिनट का उपयोग करने से पहले जब तक तापमान उगता है २००-२५० ° c ।
    4. 10 एस के लिए कैंची और चिमटी निष्फल. सुनिश्चित करें कि उपयोग करने से पहले निष्फल उपकरणों ठंडा कर रहे हैं । प्रयोज्य बाँझ नश्तर तैयार करें ।
    5. बाँझ डाकू में बायोप्सी के साथ ट्यूबों रखें । ट्यूब खोलें और एक बाँझ थाली में बायोप्सी हस्तांतरण.
    6. सही निलय बायोप्सी दो बार बाँझ पंजाबियों के 3 मिलीलीटर के साथ धो लें । यदि आप माइक्रोस्कोप पर बायोप्सी की एक तस्वीर लेना चाहते हैं ।
    7. सही निलय बायोप्सी स्थानांतरण, बाँझ चिमटी का उपयोग कर, एक बाँझ 2 मिलीलीटर collagenase समाधान के 1 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में.
    8. ०.५-1 मिमी3 टुकड़ों में बाँझ कैंची के साथ नमूना काट ।
    9. निरंतर घूर्णन आंदोलन के तहत ३७ डिग्री सेल्सियस पर १.५ ज के लिए मशीन ।
    10. ४०० पर पचा समाधान केंद्रापसारक 10 के लिए एक्स जी में मिनट ।
    11. supernatant निकालें और गोली धोने के लिए बाँझ पंजाबियों की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    12. ४०० आरटी पर 10 मिनट के लिए एक्स जी में केंद्रापसारक
    13. supernatant निकालें और TMES मध्यम के 1 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
    14. प्लेट बाँझ ६०-mm ऊतक संस्कृति इलाज प्लेट पर प्राप्त निलंबन और 3 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा के लिए TMES माध्यम जोड़ें । 5% CO2के साथ ३७ ° c में एक सेल संस्कृति मशीन में थाली मशीन ।
      नोट: मध्यम की एक उच्च मात्रा एक पचा बायोप्सी टुकड़ों के सही आसंजन को रोकने सकता है ।
    15. 24 घंटे के बाद, गैर अनुयाई कोशिकाओं और मलबे को हटाने के लिए मध्यम त्यागें ।
      नोट: एकल असंबद्ध mesenchymal कोशिकाओं प्लास्टिक की सतह के लिए संलग्न कर सकते है और क्लोन को जंम दे; इसके अलावा, अपच छोटे बायोप्सी टुकड़े प्लास्टिक पकवान को संलग्न कर सकते है और सेल अंकुरण की अनुमति ।
    16. प्लेट दो बार बाँझ पंजाबियों के 5 मिलीलीटर के साथ धोने, और ताजा TMES मध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें ।
    17. TMES मध्यम तीन बार एक सप्ताह की जगह जब तक कोशिकाओं ८०% धाराप्रवाह हैं ।
      नोट: संलग्न कोशिकाओं की संख्या गुणवत्ता पर निर्भर करता है, ऊतक की मात्रा, और पाचन की क्षमता पर.

3. सेल विस्तार

नोट: शुरू करने से पहले TMES मध्यम तैयार है सुनिश्चित करें ।

  1. जब कोशिकाओं ८०% धाराप्रवाह कर रहे हैं, एक नया बाँझ ६० मिमी ऊतक संस्कृति इलाज थाली में पचा छोटे bioptic नमूनों हस्तांतरण, और ताजा TMES माध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें.
    नोट: bioptic नमूने आगे सी-एमएससी अलगाव के लिए फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है । यह इस कार्यविधि को दोहराने जब तक कि वहां अलग कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या है संभव है ।
  2. संलग्न कोशिकाओं को दो बार बाँझ पंजाबियों के 3 मिलीलीटर के साथ धो लें । trypsin-EDTA समाधान जोड़ें (६० मिमी पकवान के लिए ०.५ मिलीलीटर), और 3-5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी सेल टुकड़ी की अनुमति के लिए ।
  3. कोशिकाओं प्लेट की सतह से अलग कर रहे हैं, trypsin निष्क्रिय करने के लिए बाँझ FBS की ०.५ मिलीलीटर जोड़ने और एक नया ५० मिलीलीटर बाँझ ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा ।
  4. शेष कोशिकाओं को एक ही ट्यूब में जोड़ने के लिए बाँझ पंजाब के 5 मिलीलीटर के साथ दो बार प्लेट धो लें ।
  5. आरटी में 10 मिनट के लिए ४०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक ।
  6. supernatant निकालें और TMES मध्यम के 1 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
  7. सेल के निलंबन कक्ष में सेल सस्पेंशन के 10 µ एल का लोड ।
    नोट: यदि कोशिकाओं को भी ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, पंजाब में प्रारंभिक निलंबन 1:10 पतला और सेल गिनती कक्ष में पतला कोशिकाओं के 10 µ एल लोड ।
  8. माइक्रोस्कोप के तहत, 3 बड़े चौकों में और उनके पक्ष के दो की तर्ज पर कोशिकाओं की गणना और कोशिकाओं की औसत संख्या की गणना.
    नोट: प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं की संख्या/एमएल, गिनती कोशिकाओं का औसत 10 से गुणा है4, सेल गिनती चैंबर के कमजोर पड़ने कारक । यदि कोशिकाओं को और अधिक पतला किया गया है, कमजोर पड़ने कारक के लिए गुणा । कोशिका संख्या के बीच का अनुपात बीज और कोशिका एकाग्रता (कोशिकाओं/एमएल) की संख्या से मेल खाती है (एमएल में) प्रारंभिक निलंबन के अगले चरण (बिंदु ३.९) के लिए चढ़ाया जा करने के लिए खंड ।
  9. प्लेट बाँझ १००-mm ऊतक संस्कृति पर निलंबन ५,००० के अंतिम एकाग्रता में प्लेटों का इलाज किया-१०,००० कोशिकाओं/सेमी2 और 8 मिलीलीटर के अंतिम खंड में TMES माध्यम जोड़ें । एक सेल संस्कृति मशीन में थाली मशीन ।
    नोट: सेल विस्तार प्रक्रिया को दोहराएँ जब कोशिकाओं ७०-८०% धाराप्रवाह हैं. हर मार्ग (पी) में, यह कोशिकाओं के भाग cryopreserve और शेष राशि प्लेट की सिफारिश की है । p या पी 4 और फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल सॉर्टर (FACS) विश्लेषण (धारा 4) और adipogenic भेदभाव (धारा 5) के लिए उपयोग तक कोशिकाओं का विस्तार करें ।
  10. टुकड़ी के बाद cryopreservation के लिए, आरटी में 10 मिनट के लिए ४०० x g पर कोशिकाओं को केंद्रापसारक ।
  11. वर्णित के रूप में कक्षों की गणना (चरण ३.७-३.८) और 1 x 106 कोशिकाओं को reसस्पेंड ९०० में µ l बाँझ FBS की. एक बाँझ क्रायो-शीशी में स्थानांतरण और बाँझ DMSO और मिश्रण के १०० µ एल जोड़ें.
  12. जल्दी से कम 2 दिनों के लिए-८० ° c में एक फ्रीजिंग कंटेनर में क्रायो-शीशियों की दुकान और फिर शीशियों तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरण ।

4. हृदय Mesenchymal Stromal कोशिकाओं के प्रवाह Cytometry द्वारा लक्षण वर्णन

नोट: शुरू करने से पहले, सेल पृथक्करण रिएजेंट, वाशिंग बफर, और विशिष्ट एंटीबॉडी तैयार करने के लिए सुनिश्चित करें ।

  1. जब कक्ष संख्या तक पहुंच से कम 3 x 106 ) (३.७-३.८ में वर्णित के रूप में कोशिकाओं की गणना), १०० मिमी प्लेट दो बार बाँझ पंजाब के 10 मिलीलीटर के साथ धो.
  2. एक सेल पृथक्करण रिएजेंट के 5 मिलीलीटर जोड़ें और आरटी पर 7-10 मिनट प्रतीक्षा करने के लिए सेल टुकड़ी की अनुमति ।
  3. जब कोशिकाओं प्लेट की सतह से अलग कर रहे हैं, बाँझ धोने बफर के 15 मिलीलीटर जोड़ने और एक नया ५० मिलीलीटर बाँझ ट्यूब में निलंबन इकट्ठा ।
  4. धोने बफर के 10 मिलीलीटर के साथ दो बार प्लेट धोने और एक ही ट्यूब के लिए शेष कोशिकाओं को जोड़ने ।
  5. आरटी में 10 मिनट के लिए ४०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक और धोने बफर के 1 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
  6. वर्णित के रूप में कोशिकाओं गिनती (चरण ३.७-३.८), और स्थानांतरण 3 x 106 कोशिकाओं को एक नए बाँझ ट्यूब में और वाशिंग बफर जोड़ने के अंतिम खंड के लिए १.५ मिलीलीटर.
    नोट: कुल कक्ष संख्या और वॉशिंग बफ़र की कुल मात्रा विश्लेषण (3 x 105 कक्षों में प्रत्येक FACS polystyrene ट्यूब के लिए १०० µ l) के लिए उपयोग किए गए चयनित मार्करों की संख्या पर निर्भर करती है ।
  7. 12 विभिन्न FACS polystyrene ट्यूबों में सेलुलर निलंबन के १०० µ एल वितरित, और उत्पाद डेटा पत्रक में इंगित एकाग्रता पर विशिष्ट एंटीबॉडी जोड़ें.
    नोट: सी के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी-एमएससी लक्षण वर्णन कर रहे हैं CD34, CD105, CD45, CD29, CD90, CD44, CD31, CD14, और एचएलए-डॉ (तालिका 1) । यह संकेत की विशिष्टता की जाँच करने के लिए isotype नियंत्रण के साथ दाग reसस्पैंड कोशिकाओं के १०० µ एल से बना एक नियंत्रण नमूना तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  8. अंधेरे में 15 मिनट के लिए नमूने की मशीन ।
  9. प्रत्येक ट्यूब को बाँझ धोने बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें प्रतिक्रिया को रोकने के लिए ।
  10. आरटी में 10 मिनट के लिए ४०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक ।
  11. supernatant निकालें और २५० µ में गोली reसस्पेंड धोने बफर के एल ।
  12. सी के लिए आगे बढ़ें-cytometry प्रवाह के साथ एमएससी लक्षण वर्णन ।

5. कार्डियक Mesenchymal Stromal कोशिकाओं का Adipogenic विभेद

नोट: शुरू करने से पहले, ADIPO मध्यम और ओरो काम समाधान तैयार किया है सुनिश्चित करें ।

  1. ADIPO मीडियम में कल्चर
    1. अनुभाग 3 में बताए गए अनुसार कक्षों को अलग और गिनना ।
    2. प्लेट 3 एक्स 105 एक बाँझ 6-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति ADIPO मध्यम के 2 मिलीलीटर में थाली इलाज के प्रत्येक कुआं पर कोशिकाओं ।
    3. सी-एमएससी ७२ एच या 1 सप्ताह के लिए टी ADIPO माध्यम में अंतर, मध्यम हर 2-3 दिन बदल रहा है ।
  2. तेल लाल हे दाग
    नोट:     C-MSC में लिपिड संचय का परीक्षण करने के लिए तेल लाल ओ (ओरो) का उपयोग करें ।
    1. 6-वेल टिशू कल्चर को plateunder हुए धुएं के हुड पर लगाएं ।
    2. adipogenic मीडियम को निकालें और दो बार पंजाबियों की 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
    3. प्रत्येक कुआं को कवर करने के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) की पर्याप्त मात्रा जोड़ें । आरटी पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करें ।
    4. पीएफए त्यागें और दो बार पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
    5. आरटी में 1 एच के लिए ओरो काम कर समाधान के साथ तय कोशिकाओं की मशीन, पर्याप्त मात्रा का उपयोग करने के लिए एक अच्छी तरह से कवर ।
      नोट: नहीं रखने के 6-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट ओरो मशीन के दौरान धुएं हुड के तहत ओरो काम समाधान के वाष्पीकरण से बचने के लिए ।
    6. सभी ओरो काम समाधान निकालें और पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ धो 3-5 बार जब तक थाली पूरी तरह से साफ है; बहाकर छोड़ दें । धुल बंद करो जब पंजाबियों का इस्तेमाल किया स्पष्ट है और जब आप देख नहीं है, खुर्दबीन के नीचे, विशिष्ट कोशिकाओं से बाहर धुंधला ।
    7. एक अच्छी तरह से उल्टे ऊतक संस्कृति चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए 20X आवर्धन पर 20 छवियों पर कब्जा ।
    8. छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम के साथ चित्रों को खोलने के लिए सेल ओरो संचय यों तो ।
    9. २५५-red चैनल में केवल चमकदारता को बढ़ाता है क्रम में "विभाजित चैनल" समारोह के माध्यम से विभिन्न रंग चैनलों अलग.
    10. नाभिक की गणना करके प्रत्येक चित्र के लिए कक्षों की संख्या गिनना. कक्ष संख्या पर ओरो संकेत तीव्रता को सामान्य.
    11. एक ही नमूने के प्रत्येक चित्र के लिए प्राप्त परिणामों के औसत की गणना ।

Representative Results

कार्डिएक stromal कोशिकाओं अलगाव: सी endomyocardial बायोप्सी प्रक्रिया से एमएससी अलगाव चित्रा 1में संक्षेप है ।

कार्डिएक stromal कोशिकाओं mesenchymal लक्षण वर्णन: के रूप में सेलुलर थेरेपी (ISCT) के लिए इंटरनेशनल सोसायटी द्वारा स्थापित, multipotent mesenchymal stromal कोशिकाओं को परिभाषित करने के लिए ंयूनतम मानदंड उनके इंयूनो-phenotypic लक्षण वर्णन3शामिल हैं । विशेष रूप से, उनके mesenchymal वंश की पुष्टि करने के लिए, कोशिकाओं को उचित FITC/पीई/APC-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ गर्मी और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं । सी-एमएससी लक्षण वर्णन में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के सभी सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं ।

जैसा कि चित्रा 2में सचित्र, सी-एमएससी बायोप्सी से प्राप्त विशिष्ट mesenchymal सतह एंटीजन CD29, CD44, और CD105 के लिए सकारात्मक हैं । CD90 धनात्मक कक्षों का प्रतिशत चर है, जैसा कि पहले11बताया गया है । endothelial (CD31, CD34), monocyte/मैक्रोफेज (CD14), टेम (CD45) मार्कर, और प्रमुख histocompatibility परिसर (एचएलए-DR) व्यक्त नहीं कर रहे है (चित्रा 2) ।

कार्डियक mesenchymal stromal कोशिकाओं adipogenic विभेद: उनके adipogenic विभेद, सी-एमएससी ACM और एचसी द्वारा प्रभावित रोगियों से प्राप्त करने के लिए टी ADIPO मध्यम में संस्कृति होना है (समाधान अनुभाग देखें) । कोशिकाओं ७२ ज या 1 सप्ताह के लिए संस्कृति में बनाए रखा है, मध्यम दो बार एक सप्ताह की जगह ।

intracellular लिपिड बूंदों के संचय ओरो धुंधला (चित्रा 3) द्वारा सबूत है । क्षमता में अंतर, साथ ही साथ भेदभाव की डिग्री में, ACM और HC से प्राप्त कोशिकाओं के बीच मनाया जा सकता है । के रूप में प्रतिनिधि छवियों में दिखाया गया है, ACM सी-एमएससी adipogenic माध्यम में संस्कृति के ७२ एच के बाद एचसी सी-एमएससी से अधिक लिपिड बूंदों जमा (चित्रा 3) । ये अंतर तब भी बनाए जाते है जब कक्षों को लंबी अवधि (1 सप्ताह) (चित्र 3) के लिए adipogenic भिंनता शर्तों से अवगत कराया जाता है ।

Video 1
वीडियो 1: electroanatomical नक्शा आणि intracardiac इकोकार्डियोग्राफी का एकीकरण. Endocardial एकध्रुवीय electroanatomical सही निलय के नक्शे (पूर्वकाल टेढ़ा और सही पूर्वकाल टेढ़ा विचार) एक रोगी जो endomyocardial बायोप्सी (कम पैनलों) से गुजरना में छोड़ दिया । सीमित क्षेत्रों में कम वोल्टेज (लाल हरे रंग की) शीर्ष पर दिखाई दे रहे हैं । Endomyocardial bioptic नमूने (सर्कल के रूप में चिह्नित) रोगग्रस्त मायोकार्डियम और interventricular पट को पत्राचार में एकत्र कर रहे हैं । वास्तविक समय intracardiac इकोकार्डियोग्राफी लक्ष्य क्षेत्र (ऊपरी पैनल) पर bioptome की सही स्थिति की जांच की अनुमति देता है । इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Video 2
वीडियो 2: सही पूर्वकाल टेढ़ा दृश्य में प्रतिदीप्तिदर्शन वीडियो । bioptome एक लंबे समय से विक्षेपित म्यान के माध्यम से डाला और निलय में उंनत है । मायोकार्डियम के साथ bioptome संपर्क की एक सावधानी से जांच के बाद, जबड़े और फिर मजबूती से नमूना इकट्ठा करने के लिए बंद कर दिया जाता है । इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Figure 1
चित्र 1: कार्यविधि ड्राफ़्ट. endomyocardial bioptic नमूना एक bioptome कैथेटर, एक छोटे से दोमुखी के आकार काटने के साधन का उपयोग कर एकत्र किया जाता है । प्राप्त बायोप्सी का वजन लगभग 5 मिलीग्राम (A) है । endomyocardial bioptic नमूना ०.५-1 मिमी3 टुकड़ों में कीमा बनाया हुआ है, बाँझ कैंची (बी) के साथ, और collagenase समाधान जोड़ा जाता है. नमूना एक ३७ डिग्री सेल्सियस में एक घूर्णन मंच मिक्सर पर १.५ के लिए पाचन के एच (ग) रखा जाता है । पचा समाधान केंद्रापसारक और एक प्लास्टिक की डिश में TMES में चढ़ाया जाता है (डी) । सी-एमएससी उनके प्लास्टिक पालन संपत्तियों के लिए धंयवाद प्राप्त कर रहे है या तो एकल कोशिकाओं या क्लोन, या छोटे से अपच bioptic टुकड़े (ई) से अंकुरित । सी-एमएससी तो फ्लो cytometry (च) की विशेषता है । सी-एमएससी में चढ़ाया जाता है adipogenic मध्यम और लिपिड छोटी बूंद संचय तेल लाल ओ धुंधला (G) द्वारा परीक्षण किया जाता है । स्केल बार्स संकेत ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सी-एमएससी के प्रतिनिधि cyto-fluorimetric प्रोफाइल । प्रत्येक हिस्टोग्राम संकेत चैनल में प्रतिदीप्ति की तीव्रता बनाम सेल गिनती से पता चलता है (पीई: phycoerythrin; APC: allophycocyanin; FITC: fluorescein-isothyocyanate) । प्रत्येक ग्राफ में isotype नियंत्रण (सफेद) और विशिष्ट कोशिका सतह मार्कर एंटीबॉडी (लाल) के साथ एक नमूना संयुग्मित दिखाया जाता है. सी-एमएससी के लिए पॉजिटिव हैं mesenchymal सरफेस एंटीजन CD29, CD44, CD105 और, आंशिक रूप से, CD90 के लिए, जबकि वे CD31, CD34, CD14, CD45, और एचएलए को व्यक्त नहीं करते-डॉ. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सी-एमएससी के Adipogenic विभेद। ACM और कोर्ट सी के प्रतिनिधि छवियां-एमएससी, ७२ ज और 1 सप्ताह के लिए adipogenic माध्यम में संस्कृति, ओरो के साथ सना हुआ (बाएं चित्र; n = 3) । सही रेखांकन में, ठहराव के २५५-लाल चैनल धुंधला के चमकदार की रिपोर्ट है: तीव्रता मनमाना इकाइयों (A.U.) में व्यक्त की है । ACM सी-एमएससी नियंत्रण से अधिक लिपिड बूंदें जमा । विद्यार्थी का T-परीक्षण उपयोग किया गया था, *: p < ०.०५ । स्केल बार्स संकेत ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

एमएससी और सी-एमएससी: MSC विभिंन वयस्क ऊतकों के stromal अंश में निवासी multipotent कोशिकाओं रहे हैं, जैसे अस्थि मज्जा, वसा ऊतक, उपास्थि, मस्तिष्क, त्वचा, भ्रूण एनेक्सी, और दिल12. विभिंन अध्ययनों को अलग और उंहें बुनियादी और शोधों अनुसंधान12,13में संभावित अनुप्रयोगों के लिए विशेषताएं प्रदर्शन किया गया है ।

स्वस्थ परिस्थितियों में एमएससी कम दर14पर quiescent, स्व-नवीनीकरण कर रहे हैं । वे पर्यावरणीय रोग परिवर्तन करने के लिए उजागर कर रहे हैं के बाद से, वे या तो प्रत्यक्ष transdifferentiation, मैट्रिक्स जमाव, या paracrine प्रभाव14के माध्यम से remodeling ऊतक को बढ़ावा देने प्रतिक्रिया.

कार्डिएक एमएससी (सी-एमएससी) दिल की एक बड़ी गैर myocyte सेल जनसंख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं4. वे epicardium से उत्पंन और उपकला-से-mesenchymal संक्रमण15की प्रक्रिया के दौर से गुजर मायोकार्डियम में विस्थापित । वे दोनों शारीरिक और रोग राज्यों में, cardiomyocytes और extracellular मैट्रिक्स homeostasis7,16के साथ बातचीत के माध्यम से, हृदय संरचना के यांत्रिक और विद्युत अखंडता के लिए योगदान करते हैं । हालांकि, सी-एमएससी के कार्यों की व्यापक रेंज अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आ रही है । दोनों शारीरिक और रोग की स्थिति में उनकी भूमिका का एक गहरा ज्ञान की सुविधा के द्वारा किया जा सकता है में इन विट्रो अध्ययन उनके अलगाव के बाद प्रदर्शन किया ।

सी-एमएससी मानव हृदय के विभिंन जिलों से प्राप्त किया गया है, जैसे अलिंद पीछे2,17 और दाएं निलय18।

हाल ही में, सी-एमएससी ह्यूमन राइट वेंट्रिकुलर endomyocardial bioptic नमूनों से8प्राप्त किया गया है, का प्रदर्शन है कि स्रोत ऊतक के रूप में के रूप में छोटा हो सकता है 3-5 मिलीग्राम.

संभावित अनुप्रयोग: इस पांडुलिपि में उल्लिखित विधि कुछ सरल मार्ग के साथ कोशिकाओं को प्राप्त करने की अनुमति देता है, ऐसे पाचन और प्लास्टिक पालन के लिए चयन के रूप में, बहुत छोटे दिल नमूनों से.

सी-एमएससी एक सेल मॉडल माना जा सकता है, क्योंकि वे बढ़ाना आसान कर रहे है और इन विट्रो मेंबनाए रखने, और mesenchymal वंश की कोशिकाओं में अंतर करने में सक्षम है (endothelium, osteocytes, और adipocytes) । इसके अलावा, रोगियों से सीधे कोशिकाओं को प्राप्त करने की संभावना का गठन एक महान इन विट्रो उपकरण के संदर्भ में यंत्रवत अध्ययन के लिए व्यक्तिगत/परिशुद्धता दवा. दरअसल, इन कोशिकाओं आनुवंशिक पृष्ठभूमि और अंततः दाताओं के विशिष्ट उत्परिवर्तनों ले, और इस तरह के नैदानिक स्थितियों, उंर, लिंग, जीवन शैली, और दवाओं के रूप में विशिष्ट रोगियों ' विशेषताओं, से प्रभावित हैं । इसके अलावा, उंहें अलग मार्करों के लिए छंटाई की संभावना विशिष्ट सी के अध्ययन-MSC सबसेट19सेट की अनुमति हो सकती है ।

सी-एमएससी के लिए विभिंन हृदय रोगों में सक्रिय खिलाड़ी, ज्यादातर दिल के प्रतिकूल remodeling की विशेषता जाना जाता है । इसलिए, वे8,20दिल रोगों प्रतिक्रिया करने के लिए उपंयास चिकित्सीय रणनीतियों के लिए उंमीदवार के लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

सी-एमएससी स्टेम गुणों की तरह है और उनके महत्वपूर्ण immunogenicity की कमी कार्डियक अपक्षयी दवा के लिए सेल थेरेपी में अपने संभावित आवेदन पता चलता है । वास्तव में, अस्थि मज्जा या अंय स्रोतों से एमएससी की तरह, सी-एमएससी संभवतः दोनों ऑटोलॉगस में और allogenic सेटिंग्स में इस्तेमाल किया जा सकता है, दाता और प्राप्तकर्ता21के बीच मिलान के लिए की आवश्यकता के बिना ।

इसके अलावा, सी-एमएससी, सीधे दिल के ऊतकों से अलग किया जा रहा है, कार्डियक माइक्रो पर्यावरण और epigenetic प्रोफ़ाइल द्वारा वातानुकूलित होने का लाभ है । कार्डियक अपक्षय चिकित्सा के संदर्भ में, यह विशेष रूप से सफल परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है ।

तिथि करने के लिए, reअपक्षय चिकित्सा के नैदानिक अध्ययन सी-एमएससी और उनके paracrine गतिविधि में उपयोगी चिकित्सीय क्षमता की पहचान की18,22,23। महत्वपूर्ण बात, नैदानिक परीक्षण जिसमें सेल स्रोत दिल है या तो cardiosfere-व्युत्पन्न कोशिकाओं के साथ या सी के उपजनसंख्याों के साथ चल रहे हैं-एमएससी13,24,25. हालांकि, अस्थि मज्जा-एमएससी प्राप्त करने के लिए, विभिन्न प्रोटोकॉल नैदानिक ग्रेड सी-एमएससी26प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है.

ACM में सी-एमएससी: प्रस्तुत प्रोटोकॉल ज्यादातर विकृतियों के अध्ययन के लिए उपयुक्त है जिसके लिए एक endocardial बायोप्सी दर्शाई गई है । ACM रोगियों नैदानिक प्रयोजनों के लिए bioptic प्रक्रियाओं से गुजरना27. उनके मायोकार्डियम धीरे-adipocytes और फाइब्रोसिस से बना निशान ऊतक, एक विद्युत निष्क्रिय ऊतक द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है । आदेश में bioptic नमूना क्षेत्र है, जहां नैदानिक उपज अधिक से अधिक नमूने के लिए मार्गदर्शन करने के लिए, endomyocardial मानचित्रण10,28,29प्रयोग किया जाता है । इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किए गए नमूनों को रोगग्रस्त मायोकार्डियम के सीमा क्षेत्र में ले जाया जाता है ।

Sommariva एट अल. हाल ही में ACM8के रोगजनन में सी-एमएससी के एक निर्णायक भूमिका को परिभाषित किया है, का प्रदर्शन है कि सी-एमएससी ACM हार्ट adipogenesis में सक्रिय खिलाड़ी हैं, के बाद से उन दिलों में preadipocytes mesenchymal मूल के हैं । इसके अलावा, सी-एमएससी ACM ' रोगियों बायोप्सी से वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ अलग दोनों लिपिड संचय और नियंत्रण से adipogenesis के लिए और अधिक प्रवृत्ति दिखाई । इस कारण से, इन कोशिकाओं ACM के आणविक तंत्र के कुछ पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यंत्रवत अध्ययन के लिए एक सेल मॉडल के रूप में अपनी उपयुक्तता साबित9।

सीमाएं और महत्वपूर्ण चरण: रोगियों से सी-एमएससी सीधे प्राप्त करने के लाभ के बावजूद (पैरा "संभव अनुप्रयोगों" देखें), इस प्रोटोकॉल अलग सीमाओं के अधीन है ।

सबसे पहले, हृदय bioptic प्रक्रिया आक्रामक है और अक्सर अगर सख्ती से आवश्यक नहीं बचा । दरअसल, हृदय ऊतक नमूने दोनों नैतिकता की दृष्टि से और तकनीकी रूप से समस्याग्रस्त है । एक हृदय बायोप्सी प्रदर्शन के लिए कारण विभेदक निदान में cardiomyopathies के संदर्भ में एक निश्चित निदान की उपलब्धि हो सकती है, हृदय प्रत्यारोपण की स्थिति की निगरानी, या एक दिल ट्यूमर की उपस्थिति का पता लगाने30. इसलिए, केवल रोगियों जिसके लिए एक endomyocardial बायोप्सी आम सहमति कथन द्वारा संकेत दिया जाता है31 C-MSC पर अनुसंधान के लिए नामांकित किया जा सकता है । इसके अलावा, हृदय bioptic प्रक्रिया नैदानिक जटिलताओं, cardiomyopathic दिलों में सब से ऊपर हो सकता है । इसलिए, electrophysiologist के नमूने हमेशा सतर्क रहे है और bioptic नमूनों बहुत छोटा हो सकता है, कोशिकाओं के अलगाव समझौता । भविष्य के प्रयोगों collagenase एकाग्रता या पाचन के समय ट्यूनिंग द्वारा इस मुद्दे पर काबू पाने सकता है ।

सी-एमएससी, सभी प्राथमिक मानव कोशिकाओं के रूप में, सभी phenotypes में विभिन्न विषयों के बीच एक उच्च परिवर्तनशीलता दिखाएँ. वास्तव में, विभिंन विषयों से कोशिकाओं को न केवल आनुवंशिक रूप से अलग हैं, लेकिन यह भी चर पर्यावरण कंडीशनिंग के अधीन । विशेष रूप से, इस प्रयोग के भीतर, कोशिका अलगाव, विकास, और adipogenic विभेद में एक उच्च परिवर्तनशीलता मनाया जाता है ।

वर्तमान प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम को स्वीकार करना होगा । यदि bioptic नमूना केशिकाओं शामिल हैं, वे endothelial कोशिकाओं है, जो सी-एमएससी संस्कृति दूषित हो सकता है के समानांतर अलगाव से बचने के लिए हटाया जाना चाहिए, और FACS विश्लेषण (CD31 के लिए धनात्मकता) द्वारा सबूत हो सकता है । एक कुशल adipogenic भेदभाव प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं को एक सक्रिय विकास के दौर में होना चाहिए । संगम की डिग्री भी लिपिड संचय को प्रभावित कर सकते हैं ।

विधि का महत्व: mesenchymal stromal कोशिकाओं के अलगाव के पिछले तरीकों के संबंध में, यह पहली बार है जहां मानव वेंट्रिकुलर bioptic नमूनों से सीधे सी एमएससी प्राप्त करने का विवरण विस्तार में प्रस्तावित है । हालांकि इस विधि ACM रोगी के नमूनों के प्रसंस्करण के लिए सुझाव दिया है, यह संभवतः सभी रोगियों जिसके लिए एक हृदय बायोप्सी इंगित है करने के लिए लागू है ।

इस प्रोटोकॉल कोशिकाओं है कि बड़े कार्डियक नमूने३२, जो अक्सर इकट्ठा करने के लिए मुश्किल है की आवश्यकता के प्राप्य के लिए पिछले तरीकों के एक उपयोगी कार्यांवयन का प्रतिनिधित्व करता है ।

इसके अलावा, नमूना स्रोत एक दिलचस्प नवाचार का गठन किया । जबकि वेंट्रिकुलर बायोप्सी आमतौर पर पट३३पर किया जाता है, इस प्रोटोकॉल खाते में सही वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार से प्राप्त नमूनों में लेता है । वेंट्रिकुलर जिले से प्राप्त कोशिकाओं के रोग की स्थिति के अधिक प्रतिनिधि हो सकता है RV शामिल आर. एस.

इसके अलावा, वर्तमान प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया एजेंट के कुछ अंय सी के संबंध में अलग है-एमएससी अलगाव और भेदभाव विधियों३२। उदाहरण के लिए, इस पांडुलिपि में प्रस्तावित collagenase के प्रकार proteolytic गतिविधियों के एक संतुलित अनुपात के साथ कक्षा मैं और कक्षा द्वितीय collagenases का मिश्रण है । इसके अलावा, पाचन समाधान collagenase एक ही बेसल मध्यम (IMDM) सी-एमएससी संस्कृति माध्यम की तैयारी के लिए इस्तेमाल में भंग मिश्रण से बना है, अलग सी की अनुमति-एमएससी भविष्य के विकास की स्थिति के लिए अनुकूल है ।

इसके अलावा, हालांकि छंटाई प्रक्रियाओं सेल बैच मानकीकरण सकता है, पूरे सी-एमएससी जनसंख्या का उपयोग कर, केवल इन कोशिकाओं के प्लास्टिक पालन संपत्ति के माध्यम से पृथक, immunophenotypic फेरबदल के बिना एक सरलीकरण का गठन सी के लक्षण-एमएससी । इस पांडुलिपि में प्रस्तावित ADIPO की संरचना adipogenic विभेद करने के लिए नेतृत्व करने में सक्षम है, इंसुलिन जैसे अन्य घटकों द्वारा प्रेरित चयापचय dysregulation से परहेज.

इसके अलावा, लिपिड संचय ठहराव, जो ओरो वर्णमिति तीव्रता के मूल्यांकन पर आधारित है की प्रस्तावित विधि, संचित लिपिड की मात्रा के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करता है, यदि केवल प्रतिशत पर आधारित तरीकों के साथ तुलना की कोशिकाओं ओरो धुंधला करने के लिए सकारात्मक । अक्सर लिपिड संचय isopropanol के साथ कोशिकाओं द्वारा शामिल ओरो निकालने और इसके अवशोषण को मापने के द्वारा quantified है । हालांकि, इस विधि और अधिक मार्ग की आवश्यकता है और isopropanol वाष्पीकरण के कारण परिवर्तनशीलता के अधीन है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित किया गया था, Ricerca Corrente को Centro Cardiologico Monzino-IRCCS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IMDM Gibco by Life Technologies  12440053
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F2442
PENICILLIN STREPTOMYCIN Life Technologies Italia 15140122
Collagenase NB4 Serva 17454.02
Basic fibroblast growth factor Peprotech 100-18B
L-glutammine Sigma-Aldrich G7513
PBS Lonza 17-516F
Tryple select 1X (cell dissociation reagent) Gibco 12563029
EDTA Sigma-Aldrich EDS
Trypsin-EDTA solution  Sigma-Aldrich T6689
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma-Aldrich I5879
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
Indomethacin Sigma-Aldrich I7378
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516
Paraformaldehyde (PFA) Solution 4% in PBS D.b.a. Italia S.r.l. sc-281692
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 276855
Antibody CD14-FITC (MφP9) Becton Dickinson 345784
Antibody Integrin β1 (CD29)-PE (clone MAR4) Becton Dickinson 561795
Antibody PECAM-1 (CD31)- APC  (clone 9G11) R&D Systems FAB3567A
Antibody Hematopoietic progenitor cell antigen (CD34)-APC (clone 581) Thermo Fisher Scientific  CD34-581-05
Antibody H-CAM (CD44)-PE  (clone G44-26) Becton Dickinson 561858
Antibody L-CA (CD45)-APC (clone HI30) Thermo Fisher Scientific MHCD4505-4
Antibody THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10) Becton Dickinson 561969
Antibody Endoglin (CD105)-APC (clone 266) Becton Dickinson 562408
Antibody HLA-DR-FITC (clone L243) Becton Dickinson
347400
Gima Quick Plus sterilizer Gima  35642
Bench centrifuge Sigma 3-16K Sigma Centrifuges 10330
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific  5100-0001
AxioVert 200M microscope  Zeiss B 40-080 e 03/01
FACS Gallios Beckman Coulter  773231AF
ImageJ (image processing program) NIH
Stericup filter units Merck S.P.A.  SCGPU05RE
Conical Tubes, 50 mL Eppendorf 30122178
Conical Tubes, 15 mL Eppendorf 30122151
Safe-Lock Tubes, 2 mL Eppendorf 30120094
100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Corning 430167
60 mm TC-Treated Cell Culture Dish Corning 430166
6 well TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3516
Polystyrene Round-Bottom Tubes, 5 mL BD Falcon 352058
BRAND counting chamber BLAUBRAND Bürker-Türk Sigma-Aldrich BR719520

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