Summary
I denne artikkelen gis en metode for å isolere cardiac mesenchymal stromal celler fra endomyocardial bioptic prøver av arrhythmogenic kardiomyopati pasienter. Deres karakterisering og protokollen for å øke deres adipogenic differensiering er beskrevet.
Abstract
Et vanlig voksen hjerte består av flere ulike celletyper, hvorav cardiac mesenchymal stromal cellene representerer en rikelig befolkning. Isolasjon av disse cellene tilbyr muligheten til å studere deres engasjement i hjerte sykdommer, og i tillegg gir en nyttig primære celle modell for å undersøke biologiske mekanismer.
Her beskrives metoden for isolering av C-MSC fra arrhythmogenic kardiomyopati pasienter bioptic prøver. Endomyocardial biopsi prøvetaking styres i høyre ventrikkel områdene ved siden arret visualisert ved electro-anatomiske kartlegging. Fordøyelsen av biopsier collagenase og deres plating på en plast rett i kultur medium slik at C-MSC veksten er beskrevet. Isolert cellene kan utvides i kultur for flere passasjer. For å bekrefte deres mesenchymal fenotype, tilbys beskrivelsen av immuno-phenotypical karakterisering. C-MSC er kjøpedyktig skille ut flere celletyper som adipocytter, chondrocytes og osteoblasts: i forbindelse med ACM, preget av adipocyte innskudd i pasientenes hjerter, protokollene for adipogenic differensiering av C-MSC og karakteristikk av lipid slippverktøy akkumulering er beskrevet.
Introduction
Mesenchymal Stromal celler (MSC) er en viktig støttende funksjon i mange vev1voksen celler. Benmarg representerer MSC historiske kilden, men de kan være isolert fra ulike vev inkludert morkaken, fettvev, ledningen blod, lever og hjerte1,2.
I 2006 spesifisert International Society for mobilnettet terapi (ISCT) for første gang, minimal kriteriene som definerer menneskelige MSC3. Spesielt må MSC ha muligheten til å overholde plast. De uttrykke bestemt overflaten antigener: positivitet for CD44, CD105, CD29 og CD90 mesenchymal markører og negativitet for CD14, CD45, CD34, CD31 blodkreft og endothelial markører karakterisere MSC. På grunn av manglende uttrykk for HLA-DR, MSC er ikke utløse alloreactivity. Dessuten, de er multipotent celler til å skille mot adipogenic, chondrocyte og osteoblast linjene1,3.
Fokusere på cardiac mobilnettet komposisjon, er hjerte mesenchymal stromal celler (C-MSC) rikelig i en normal voksen hjertet4,5. De spiller en avgjørende rolle både i normal hjertefunksjon og patologiske forhold. Stund, fysiologisk C-MSC gir en microenvironment som støtter strukturelle og funksjonelle integriteten i myokard, i hjertesykdommer de aktiveres svar på hjertet skader deltar i sårheling og fibrotiske remodeling6 ,7.
Involvering av C-MSC i arrhythmogenic kardiomyopati (ACM) adipose erstatning har nylig vært demonstrert8. Spesielt er ACM en genetisk lidelse hovedsakelig forårsaket av mutasjoner i desmosomal gener som fører til hjerteinfarkt fibro fatty erstatning, hovedsakelig i høyre ventrikkel9. Denne erstatningen, strekker seg fra epicardium til endocardium, oppretter et ikke-ledende substrat som utløser progressiv hjertesvikt og forverres ventrikulær arytmi, som kan føre, i alvorlige tilfeller, plutselig død. Sommariva et al. vist mesenchymal opprinnelsen til før adipocytter i ACM pasienter explanted hjertet deler. Videre C-MSC isolert fra endomyocardial biopsies av ACM hjerter express desmosomal gener og dermed kan påvirkes av deres mutasjoner. Særlig under adipogenic forhold, ACM C-MSC samle mer lipider enn de fra kontroll hjerter. Dette bevis fører til konklusjonen at C-MSC både har en aktiv rolle i patogenesen sykdom og representerer en gyldig celle modell å studere ACM.
For å lette fremtidig forskning i denne sammenheng eller andre hjertesykdommer som en cardiac biopsi er angitt, vises en detaljert protokoll for isolering av C-MSC fra små fragmenter av endomyocardial vev, deres ekspansjon, deres immuno-phenotypical karakterisering og adipogenic differensiering.
Protocol
Denne tilnærmingen oppfyller erklæring i Helsinki og samlingen av høyre ventrikkel prøver ble godkjent (07/06/2012) av "Centro Cardiologico Monzino IRCCS" etikk.
1. løsninger
- Gjør TMES medium for C-MSC kultur med Iscoves endret Dulbecco Medium (IMDM), med 20% fosterets Bovine Serum (FBS), 10 ng/mL grunnleggende fibroblast vekstfaktor, 10.000 U/mL Penicillin, 10.000 µg/mL Streptomycin og 0,02 M L-glutamin. Filtrere TMES mediet bruker en 0.22 µm sterilt filter enhet og lagre på 4 ° C.
- For å forberede collagenase løsning, resuspend collagenase NB4 blandingen i IMDM medium å få en endelig løsning med en konsentrasjon av 3 mg/mL. Vortex forsiktig å oppløse pulveret og filtrere collagenase løsningen bruker filtere 0,2 µm sprøyten. Aliquot 1 mL volum 2 mL steril rør og butikk på 20 ° C til trenges for bruk.
- Å forberede T. ADIPO medium, gjøre adipogenic medium med IMDM medium supplert med 10% FBS, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (pre fortynnet i dimethyl sulfoxide (DMSO) i en konsentrasjon på 0,5 M og holdt på 20 ° C før bruk), 1 µM hydrocortisone (pre utvannet i DMSO 100 mM og lengre utvannet til 10 mM sterilt destillert vann og holdt på 20 ° C før bruk) og 0,1 mM indomethacin (pre fortynnet i DMSO i en konsentrasjon på 0,5 M og holdt på 20 ° C før bruk). Filtrere T. ADIPO mediet bruker en 0.22 µm sterilt filter enhet og lagre på 4 ° C.
- Forberede vaske bufferen består av fosfat-bufret saltvann 0.0067 M PO4 (PBS), ethylenediamine tetra eddiksyre (EDTA) 5 mM, og 5% bovin serum albumin, og butikken på 4 ° C.
- Klargjør olje røde O (ORO) fungerende løsning ved oppløsning 1% ORO pulver i 60% isopropanol miksing for 2t og filtrering bruker en 0.22 µm filter enhet for å fjerne precipitates. Lagre arbeider løsningen ved romtemperatur (RT).
2. isolering av Cardiac Mesenchymal Stromal celler
-
CARDIAC biopsi samling og bearbeiding
Merk: før du starter, pass på at collagenase løsningen og TMES medium klar.- Sette ACM endomyocardial biopsi (vanligvis ca 5 mg av vev) i et sterilt rør fylt med TMES og frakte den til laboratoriet.
Merk: ACM biopsier er samlet i operasjonsstuen elektrofysiologi, ifølge tidligere rapporter10. Kort, integrering av elektro-anatomiske kartlegging og intracardiac echocardiography i høyre ventricle (se Video 1) brukes til å veilede endomyocardial biopsi (se Video 2, fluoroscopy) i korrespondanse til sonen av den syke myokard. Sunn kontroll (HC) prøver er levert av en vev bio-bank, fra høyre ventrikkel gratis veggen cadaveric givere innen 24 timer av død (utilsiktet død, friske). Under transport og før disseksjon, lagre biopsy i TMES på 4 ° C. Begrense tiden mellom biopsi samling og vev behandling (maks 24 h). - Definer den biologiske sikkerhetskabinett kabinett med nødvendige løsninger til fremgangsmåten til enzymatisk fordøyelsen.
- Sette sterilisatoren under panseret og slå på apparatet 15 min. før bruk før temperaturen stiger 200-250 ° C.
- Sterilisere saks og pinsett for 10 s. gjør at steriliserte instrumenter er kaldt før bruk. Forberede disponibel sterilt skalpeller.
- Plass rør med biopsy i sterilt panseret. Åpne røret og overføre biopsy i et sterilt plate.
- Vask den høyre ventrikkel biopsi to ganger med 3 mL steril PBS. Hvis du vil ta et bilde av biopsy i mikroskopet.
- Overføre den høyre ventrikkel biopsy, ved hjelp av sterile pinsett, inn i et sterilt 2 mL rør som inneholder 1 mL av collagenase løsningen.
- Kutt prøven i 0,5 - 1 mm3 stykker med sterilt saks.
- Inkuber 1.5 h på 37 ° C kontinuerlig roterende agitasjon.
- Sentrifuge fordøyd løsningen på 400 x g i 10 min på RT.
- Fjern nedbryting og tilsett 1 mL steril PBS å vaske pellet.
- Sentrifuger 400 x g i 10 min på RT.
- Fjern nedbryting og resuspend pellet i 1 mL av TMES medium.
- Plate innhentet suspensjon på sterilt 60 mm vev kultur behandlet plate og legge TMES medium til siste bind i 3 mL. Inkuber platen i en celle kultur inkubator på 37 ° C med 5% CO2.
Merk: Et høyere antall medium kan hindre riktig vedheft av en fordøyd biopsi. - Etter 24 timer, kan du forkaste medium for å fjerne ikke-tilhenger celler og rusk.
Merk: Dissosiert mesenchymal enkeltceller kan feste til plast overflaten og gi opphav til kloner; også kan ufordøyd liten biopsi fragmenter feste på plast maten og la celle spirende. - Vaske platen to ganger med 5 mL steril PBS, og legge 3 mL frisk TMES medium.
- Erstatte TMES mediet tre ganger i uken til cellene er 80% confluent.
Merk: Antall tilknyttede celler avhenger av kvaliteten, mengden vev, og effektiviteten av fordøyelsen.
- Sette ACM endomyocardial biopsi (vanligvis ca 5 mg av vev) i et sterilt rør fylt med TMES og frakte den til laboratoriet.
3. celleutvidelse
Merk: Pass på at TMES medium klar før du starter.
- Når cellene er 80% confluent, overføring fordøyd liten bioptic prøvene til en ny sterilt 60 mm vev kultur behandlet plate, og legge 3 mL frisk TMES medium.
Merk: Bioptic eksemplene kan være re-anvendt for ytterligere C-MSC isolasjon. Det er mulig å gjenta denne prosessen til det er et betydelig antall isolerte celler. - Vask tilknyttede cellene to ganger med 3 mL steril PBS. Legg trypsin-EDTA løsning (0,5 mL for et 60 mm fat), og ruge ved 37 ° C i 3-5 minutter å tillate celle avdeling.
- Når cellene er løsrevet fra overflaten av platen, kan du legge til 0,5 mL steril FBS å deaktivere trypsin og samle celler i en ny 50 mL steril tube.
- Vaske platen to ganger med 5 mL steril PBS legge de resterende cellene til samme rør.
- Sentrifuge cellene på 400 x g i 10 min på RT.
- Fjern nedbryting og resuspend pellet i 1 mL av TMES medium.
- Laste inn 10 µL av cellen suspensjon i cellen teller kammer.
Merk: Hvis cellene for konsentrert, fortynne den første suspensjon 1:10 i PBS og laste 10 µL utvannet cellene i cellen teller kammer. - Under mikroskopet, telle celler i 3 store ruter og på linjene i to av sine sider og beregne gjennomsnittlig antall celler.
Merk: For å få antall celler/mL, gjennomsnittet av telles cellene multipliseres med 104, fortynningsfaktoren for cellen teller kammer. Hvis cellene har blitt mer utvannet, multiplisere for fortynning factor. Forholdet mellom hvor cellen å frø og celle konsentrasjonen (antall celler/mL) tilsvarer volumet (i mL) av første suspensjon å være belagt for neste trinn (punkt 3.9). - Plate rørets på sterilt 100 mm vev kultur behandlet plater i en siste konsentrasjon av 5000-10.000 celler/cm2 og legge TMES medium til det siste bindet 8 mL. Inkuber platen i en celle kultur inkubator.
Merk: Gjenta celle utvidelse når cellene ikke er 70-80% confluent. På hver passage (P), er det anbefalt å cryopreserve del av celler og plate restbeløpet. Utvid cellene til P3 eller P4 og bruke fluorescerende-aktivert cellen sorter (FACS) analyse (del 4) og adipogenic differensiering (del 5). - For kryonisk bevaring etter avdeling, sentrifuge cellene på 400 x g i 10 min på RT.
- Telle celler som beskrevet (trinn 3.7-3.8) og resuspend 1 x 106 celler i 900 µL av sterile FBS. Overføre til sterilt cryo-ampuller og legge 100 µL av sterile DMSO og bland.
- Raskt store cryo-ampullene i en fryser beholder-80 ° c i minst 2 dager og deretter overføre ampullene i flytende nitrogen.
4. karakterisering av Cardiac Mesenchymal Stromal celler av flowcytometri
Merk: Før du starter, pass på at cellen dissosiasjon reagens, vaske bufferen og spesifikke antistoffer forberedt.
- Når de celle nummeret når minst 3 x 10 vask6 (teller cellene som beskrevet i 3.7-3.8), 100 mm platen to ganger med 10 mL steril PBS.
- Legge til 5 mL av en celle dissosiasjon reagens og vente 7-10 minutter til RT å tillate celle løsrivelse.
- Når cellene er løsrevet fra overflaten av platen, legge til 15 mL steril vaske bufferen og samle suspensjon i en ny 50 mL steril tube.
- Vaske platen to ganger med 10 mL vaske bufferen og legge de resterende cellene til samme rør.
- Sentrifuge cellene på 400 x g i 10 min på RT og resuspend pellet i 1 mL av vaske bufferen.
- Telle celler som beskrevet (trinn 3.7-3.8), og overføre 3 x 106 celler i en ny sterilt tube og legge vaske bufferen til det siste bindet 1,5 mL.
Merk: Hvor totalt-cellen og det totale volumet av vaske bufferen, avhenger av antall valgte markører brukes for analyse (3 x 105 celler i 100 µL for hver FACS polystyren rør). - Distribuere 100 µL av mobilnettet suspensjon i 12 ulike FACS polystyren rør, og legge til spesifikke antistoffer på konsentrasjonen i produkt-datablad.
Merk: Antistoffer brukes for C-MSC karakteristikk er CD34, CD105, CD45, CD29, CD90, CD44, CD31, CD14 og HLA-DR (tabell 1). Det er viktig å forberede en kontroll prøven består av 100 µL resuspended celler med kontrollen isotype sjekke spesifisiteten av signalet. - Inkuber prøvene i 15 min i mørket.
- Legg 1 mL steril vaske bufferen til hver tube å stoppe reaksjonen.
- Sentrifuge cellene på 400 x g i 10 min på RT.
- Fjern nedbryting og resuspend pellet i 250 µL vaske bufferen.
- Gå til C-MSC karakterisering med flowcytometri.
5. Adipogenic differensiering av Cardiac Mesenchymal Stromal celler
Merk: Før du starter, må du ha forberedt T. ADIPO medium og ORO fungerende løsning.
-
Kultur i T. ADIPO medium
- Løsne og telle celler som beskrevet i del 3.
- Plate 3 x 105 celler på hver brønn av et sterilt 6-og vev kultur behandlet plate i 2 mL av T. ADIPO medium.
- La C-MSC skille T. ADIPO medium for 72 h eller 1 uke, endre medium hver 2-3 dager.
-
Olje Red O flekker
Merk: bruk olje Red O (ORO) flekker test lipid akkumulering i C-MSC.- Plass 6-og vev kultur plateunder i avtrekksvifte.
- Fjerne adipogenic mediet og vask cellene to ganger med 2 mL PBS.
- Legg nok volumet på 4% paraformaldehyde (PFA) å dekke hver godt. Fastsette celler for 5 min på RT.
- Forkaste PFA og vask cellene to ganger med 2 mL PBS.
- Inkuber fast cellene med ORO fungerende løsning 1t på RT, bruker nok volum for å dekke hver godt.
Merk: Ikke Oppbevar 6-og vev kultur plate under avtrekksvifte under ORO inkubasjonen å unngå fordampning av ORO fungerende løsning. - Fjerne alle ORO fungerende løsning og vask med 2 mL PBS 3 - 5 ganger til platen er helt renset; Forkast vasker. Stopp vasker når PBS brukes er klart og når du ikke ser, under mikroskopet, uspesifikke farging av cellene.
- Ta 20 bilder på 20 X forstørrelse for hver brønn av invertert vev kultur kontrast mikroskopet.
- Åpne bilder med behandlingsprogram for image å kvantifisere cellen ORO akkumulering.
- Skille ulike fargekanalene gjennom funksjonen "split kanaler" for å kvantifisere bare lystettheten i 255-røde channel.
- Tell antall celler hvert bilde ved å telle kjerner. Normalisere ORO signal intensiteten på hvor cellen.
- Beregne gjennomsnittet av resultatene for hvert bilde av samme utvalget.
Representative Results
Cardiac stromal celler isolasjon: C-MSC isolasjon fra endomyocardial biopsier prosedyre summeres i figur 1.
Cardiac stromal celler mesenchymal karakterisering: Som er fastsatt av International Society for mobilnettet terapi (ISCT), minimal kriteriene for å definere multipotent mesenchymal stromal celler inneholder deres immuno-fenotypiske karakterisering3. Spesielt for å bekrefte deres mesenchymal avstamning, er celler ruges med riktig FITC/PE/APC-konjugerte antistoffer og analysert av flowcytometri. Alle antistoffer brukes i C-MSC karakterisering er oppført i Tabellen for materiale.
Som illustrert i figur 2, er C-MSC fra biopsier positivt for de bestemte mesenchymal overflaten antigener CD29, CD44 og CD105. Andelen CD90 positive celler er variabel, som rapportert tidligere11. Den endothelial (CD31, CD34), monocyte/macrophage (CD14), blodkreft (CD45) markører og store histocompatibility kompleks (HLA-DR) er ikke uttrykt (figur 2).
Cardiac mesenchymal stromal celler adipogenic differensiering: For å be sine adipogenic differensiering, C-MSC innhentes fra pasienter påvirket av ACM og HC må være dyrket i T. ADIPO medium (se løsninger-delen). Cellene blir vedlikeholdt i kultur for 72 h eller 1 uke, erstatte mediet to ganger i uken.
Akkumulering av intracellulær lipid dråper er dokumentert av ORO flekker (Figur 3). Forskjeller i evnen og grad av differensiering, kan observeres mellom cellene ACM og HC. Som vist i representant bilder, akkumuleres ACM C-MSC mer lipid dråper enn HC C-MSC etter 72 h kultur i adipogenic medium (Figur 3). Disse forskjellene opprettholdes også når cellene er utsatt for adipogenic differensiering betingelser for en lengre periode (1 uke) (Figur 3).
Video 1: Integrering av electroanatomical kart og intracardiac echocardiography. Endocardial unipolar electroanatomical kart av høyre hjertekammer (venstre fremre skrå og rett fremre skrå visninger) i en pasient som gjennomgår endomyocardial biopsi (nedre panel). Begrenset er lav spenning (rød/grønn) synlig på toppen. Endomyocardial bioptic prøver (merket som sirkel) er samlet i korrespondanse til syke myokard og den interventricular septum. Sanntids intracardiac echocardiography kan sjekke riktig posisjon av bioptome ved målområdet (øvre panel). Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 2: Fluoroscopy video i riktig fremre skrå visning. Bioptome er satt gjennom en lang-deflectable skjede og avanserte i ventrikkel. Etter en grundig sjekk av bioptome kontakten med myokard, er jaws åpnet og deretter fast lukket for å samle prøven. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Figur 1: prosedyre utkast. Endomyocardial bioptic prøven samles ved hjelp av et bioptome kateter, en liten knipetangsmanøver-formet kutte instrument. Vekten av den fått biopsy er ca 5 mg (A). Endomyocardial bioptic prøven er hakket i 0,5 - 1 mm3 fragmenter, med sterilt saks (B) og collagenase løsning er lagt. Prøven er plassert i en 37 ° C inkubator på en roterende plattform mikser for 1,5 t fordøyelsen (C). Fordøyd løsningen er centrifuged og belagt i TMES i plast parabol (D). C-MSC er oppnådd takket være plast tilslutning egenskapene i enkeltceller eller kloner eller spirende fra små ufordøyd bioptic fragmenter (E). C-MSC er da preget av flowcytometri (F). C-MSC er belagt i adipogenic medium og lipid slippverktøy akkumulering er testet av olje Red O flekker (G). Skala stolper angir 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative cyto-fluorimetric profil av C-MSC. Hver histogrammet viser celletall vs intensiteten av fluorescens i den angitte kanalen (PE: phycoerythrin; APC: allophycocyanin; FITC: fluorescein-isothyocyanate). I hvert enkelt diagram isotype kontrollen (hvit) og et utvalg konjugert med bestemte cellen overflaten markør antistoff (rød) vises. C-MSC er positive for de mesenchymal overflaten antigener CD29, CD44, CD105 og, delvis, for CD90, mens de ikke uttrykke CD31, CD34, CD14, CD45 og HLA-DR. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Adipogenic differensiering av C-MSC. Representant bilder av ACM og HC C-MSC, kultivert i adipogenic medium for 72 h og 1 uke, beiset med ORO (venstre bilder, n = 3). Høyre grafene, kvantifisering av lystettheten til 255-røde channel flekker rapporteres: intensitet uttrykkes i vilkårlig enheter (A.U.). ACM C-MSC samle mer lipid dråper enn kontroller. Student T-test ble brukt, *: p < 0,05. Skala stolper angir 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
MSC og C-MSC: MSC er multipotent celler bosatt i stromal brøkdel av forskjellige voksen vev, som benmargen, fettvev, brusk, hjernen, hud, fosterets vedlegg og hjertet12. Forskjellige studier er utført for å isolere og karakteriserer dem for potensielle programmer i grunnleggende og translasjonsforskning12,13.
Sunt forhold, MSC er quiescent, selv fornyende lave14. Siden de er utsatt for miljømessig patologiske forandringer, reagerer de fremme vev remodeling gjennom direkte transdifferentiation, matrise deponering eller paracrine effekt14.
Cardiac MSC (C-MSC) representerer en stor ikke-myocyte celle befolkningen av hjertet4. De kommer fra epicardium og overføre til myokard gjennomgår prosessen epithelial til mesenchymal overgang15. Bidrar til mekaniske og elektriske integriteten av cardiac strukturen, både fysiologiske og patologiske tilstander, gjennom interaksjoner med cardiomyocytes og ekstracellulær matrix homeostase7,16. Bredt utvalg av C-MSC funksjonene er imidlertid fortsatt ikke helt forstått. En dypere kunnskap om deres rolle i fysiologiske og patologiske forhold kan bli lettere i vitro studier utført etter deres isolasjon.
C-MSC har vært innhentet fra forskjellige distrikter i menneskets hjerte, som atrial appendage2,17 og høyre ventrikkel18.
Nylig har C-MSC fra menneskelige høyre ventrikkel endomyocardial bioptic prøver er innhentet av8, demonstrere at kilde-vev kan være så lite som 3-5 mg.
Mulig programmer: Metoden skissert i dette manuskriptet kan få celler med noen enkle passasjer, for eksempel fordøyelsen og utvalg for plast etterlevelse, fra svært lite hjerte prøver.
C-MSC kan betraktes som en celle modell, siden de er enkle å forsterke og opprettholde i vitro, og er i stand til å skille ut celler av mesenchymal avstamning (endotelet, osteocytes og adipocytter). Dessuten, muligheten for å skaffe cellene direkte fra pasienter utgjør et flott i vitro verktøy for mekanistisk studier i sammenheng med personlig/presisjon medisin. Faktisk disse cellene bære genetisk bakgrunn og til slutt bestemte mutasjoner av givere, og påvirkes av bestemte pasientenes egenskaper, for eksempel klinisk betingelser, alder, kjønn, livsstil og medisiner. Muligheten for sortering dem for ulike markører kan videre studier av bestemte C-MSC delsett19.
C-MSC er kjent for å være aktive spillere i ulike hjerte-karsykdommer, hovedsakelig preget av negative ombygging av hjertet. Derfor representerer de kandidat mål for romanen strategier mot hjertesykdommer8,20.
C-MSC stilk-lignende egenskaper og deres mangel på betydelig immunogenisitet foreslår deres potensielle anvendelse i cellen terapi for cardiac regenerativ medisin. Faktisk, som MSC fra benmarg eller andre kilder, C-MSC kan potensielt brukes både i autologous og allogenic innstillinger, uten behov for giver og mottaker21.
Tillegg har C-MSC, blir isolert direkte fra hjerte vev, fordelen av å være preconditioned av cardiac mikro-miljø og epigenetic profil. I forbindelse med hjerte regenerativ medisin, kan dette være spesielt viktig å få vellykkede resultater.
Hittil identifisert prekliniske studier av regenerativ medisin nyttig terapeutiske potensialet i C-MSC og deres paracrine aktivitet18,22,23. Viktigere, er kliniske studier som er cellen hjertet i gang med cardiosfere-avledet celler eller med subpopulasjoner av C-MSC13,24,25. Men som for bein margtransplantasjon-avledet MSC, kan forskjellige protokoller være nødvendig å få kliniske klasse C-MSC26.
C-MSC i ACM: Presentert protokollen er mest egnet for studiet av patologi som en endocardial biopsi er angitt. ACM pasienter gjennomgår bioptic prosedyrer for diagnoseformål27. Deres myokard er gradvis erstattet av arrvev, en elektrisk inert vev består av adipocytter og fibrose. For å lede bioptic prøvetaking arr området, der diagnostiske avkastningen er maksimal, er endomyocardial kartlegging brukt10,28,29. Eksemplene i denne protokollen er tatt sonen av syke myokard.
Sommariva et al. har nylig definert en sentral rolle i C-MSC i patogenesen av ACM8viser at C-MSC er aktive spillere i ACM hjertet adipogenesis, ettersom preadipocytes i de hjertene er mesenchymal opprinnelsesland. Tillegg isolert C-MSC med nåværende protokollen fra ACM pasienter biopsier viste flere tilbøyelighet til både lipid akkumulering og adipogenesis enn kontroller. Derfor kan disse cellene brukes til å bekrefte noen av molekylære mekanismer ACM, bevise deres egnethet som celle modell for mekanistisk studier9.
Begrensninger og avgjørende skritt: Til tross for fordelene ved å få C-MSC direkte fra pasienter (se avsnittet "Mulig programmer"), er denne protokollen utsatt for ulike begrensninger.
Først av alt kardial bioptic prosedyren er invasiv og ofte unngås hvis ikke strengt nødvendig. Faktisk er prøvetaking hjerte vev både etisk og teknisk problematisk. Grunner for å utføre en cardiac biopsi hende oppnåelse av en bestemt diagnose i sammenheng med cardiomyopathies differensialdiagnose, overvåking av statusen til hjerte transplantasjoner eller konstatere tilstedeværelsen av en hjertet svulst30. Derfor kan bare pasienter som en endomyocardial biopsi angis av konsensus uttalelse31 være registrert for forskning på C-MSC. Videre kan cardiac bioptic prosedyren har klinisk komplikasjoner, fremfor alt i cardiomyopathic hjerter. Derfor electrophysiologist's prøvetaking er alltid forsiktig og bioptic eksempler kan være veldig små, at isolering av celler. Senere eksperimenter kunne overvinne problemet av tuning collagenase konsentrasjon eller tidspunktet for fordøyelsen.
C-MSC, viser som alle primære menneskelige celler, en høy variasjon blant ulike fag i alle fenotyper. Celler fra ulike fag er faktisk ikke bare genetisk forskjellig, men også utsatt til variabel miljømessige condition. Spesielt i dette eksperimentet, er en høy variasjon i celle isolasjon, vekst og adipogenic differensiering observert.
Avgjørende skritt av nåværende protokollen har å bli anerkjent. Hvis bioptic prøven inkluderer kapillærene, må de fjernes for å unngå parallelle isolering av endotelceller, som kan forurense C-MSC kulturen, og kan bevitnes av FACS analyse (positivitet for CD31). For å få en effektiv adipogenic differensiering, må cellene ligge i en aktiv vekstfase. Graden av samløpet kan også påvirke lipid akkumulering.
Betydningen av metoden: Forhold til forrige metoder for isolering av mesenchymal stromal celler er dette første gang der beskrivelsen av C-MSC obtainment direkte fra menneskelige ventrikkel bioptic prøver foreslås i detalj. Selv om denne metoden er foreslått for behandling av ACM pasientprøvene, er det potensielt gjelder alle pasientene som en cardiac biopsi er angitt.
Denne protokollen representerer en nyttig implementering av metodene for obtainment av celler som krevde større hjerte prøver32, som er ofte vanskelig å samle.
Videre utgjør prøvekilden en interessant nyhet. Mens den ventrikkel biopsi er vanligvis utført på septum33, tar denne protokollen konto prøver innhentet fra høyre ventrikkel gratis veggen. Cellene stammer fra syke høyre ventrikkel district kan være mer representativt for patologisk status for sykdommer som involverer RV.
I tillegg er noen av reagensene i stede protokollen forskjellige forhold til andre C-MSC isolasjon og differensiering metoder32. For eksempel collagenase foreslått i dette manuskriptet er en blanding av klasse I og klasse II collagenases med et balansert forhold av proteolytisk aktiviteter. Videre består fordøyelsen løsningen av collagenase mix oppløst i samme basale medium (IMDM) brukes for utarbeidelse av C-MSC kultur medium, tillater isolert C-MSC å tilpasse fremtidig vekst forhold.
I tillegg om sortering prosedyrer kan standardisere celle bunke med hele C-MSC befolkningen, isolert gjennom egenskapen plast etterlevelse av disse cellene, utgjør en forenkling uten å endre immunophenotypic kjennetegner C-MSC. Sammensetningen av T. ADIPO foreslått i dette manuskriptet er kunne føre til adipogenic differensiering, unngå metabolske feilregulering indusert av andre komponenter som insulin.
Videre gir den foreslåtte metoden av lipid akkumulering kvantifisering, som er basert på vurderingen av ORO kolorimetrisk intensiteten, mer informasjon om antall akkumulerte lipider, hvis sammenlignet med metoder basert på prosent celler som er positive til den ORO flekker. Ofte lipid akkumulering er kvantifisert ved utpakking ORO innlemmet ved celler med isopropanol og måle sin absorbance. Men denne metoden krever mer passasjer og er utsatt for variasjon på grunn av isopropanol fordampning.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av italiensk Helsedepartementet, Ricerca Corrente til Centro Cardiologico Monzino-IRCCS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Gibco by Life Technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN | Life Technologies Italia | 15140122 | |
| Collagenase NB4 | Serva | 17454.02 | |
| Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B | |
| L-glutammine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Tryple select 1X (cell dissociation reagent) | Gibco | 12563029 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T6689 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Paraformaldehyde (PFA) Solution 4% in PBS | D.b.a. Italia S.r.l. | sc-281692 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Antibody CD14-FITC (MφP9) | Becton Dickinson | 345784 | |
| Antibody Integrin β1 (CD29)-PE (clone MAR4) | Becton Dickinson | 561795 | |
| Antibody PECAM-1 (CD31)- APC (clone 9G11) | R&D Systems | FAB3567A | |
| Antibody Hematopoietic progenitor cell antigen (CD34)-APC (clone 581) | Thermo Fisher Scientific | CD34-581-05 | |
| Antibody H-CAM (CD44)-PE (clone G44-26) | Becton Dickinson | 561858 | |
| Antibody L-CA (CD45)-APC (clone HI30) | Thermo Fisher Scientific | MHCD4505-4 | |
| Antibody THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10) | Becton Dickinson | 561969 | |
| Antibody Endoglin (CD105)-APC (clone 266) | Becton Dickinson | 562408 | |
| Antibody HLA-DR-FITC (clone L243) | Becton Dickinson | 347400 |
|
| Gima Quick Plus sterilizer | Gima | 35642 | |
| Bench centrifuge Sigma 3-16K | Sigma Centrifuges | 10330 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| AxioVert 200M microscope | Zeiss | B 40-080 e 03/01 | |
| FACS Gallios | Beckman Coulter | 773231AF | |
| ImageJ (image processing program) | NIH | ||
| Stericup filter units | Merck S.P.A. | SCGPU05RE | |
| Conical Tubes, 50 mL | Eppendorf | 30122178 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Eppendorf | 30122151 | |
| Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
| 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 60 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430166 | |
| 6 well TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3516 | |
| Polystyrene Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Falcon | 352058 | |
| BRAND counting chamber BLAUBRAND Bürker-Türk | Sigma-Aldrich | BR719520 |
References
- Brooke, G., et al. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells. Semin Cell Dev Biol. 18 (6), 846-858 (2007).
- Rossini, A., et al. Human cardiac and bone marrow stromal cells exhibit distinctive properties related to their origin. Cardiovasc Res. 89 (3), 650-660 (2010).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Doppler, S. A., et al. Cardiac fibroblasts: more than mechanical support. J Thorac Dis. 9, Suppl 1 36-51 (2017).
- Moore-Morris, T., Guimaraes-Camboa, N., Yutzey, K. E., Puceat, M., Evans, S. M. Cardiac fibroblasts: from development to heart failure. J Mol Med (Berl). 93 (8), 823-830 (2015).
- Jugdutt, B. I. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108 (11), 1395-1403 (2003).
- Brown, R. D., Ambler, S. K., Mitchell, M. D., Long, C. S. The cardiac fibroblast: therapeutic target in myocardial remodeling and failure. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 45, 657-687 (2005).
- Sommariva, E., et al. Cardiac mesenchymal stromal cells are a source of adipocytes in arrhythmogenic cardiomyopathy. Eur Heart J. 37 (23), 1835-1846 (2016).
- Sommariva, E., Stadiotti, I., Perrucci, G. L., Tondo, C., Pompilio, G. Cell models of arrhythmogenic cardiomyopathy: advances and opportunities. Dis Model Mech. 10 (7), 823-835 (2017).
- Casella, M., et al. Electroanatomical mapping systems and intracardiac echo integration for guided endomyocardial biopsy. Expert Rev Med Devices. 14 (8), 609-619 (2017).
- Beltrami, A. P., et al. Multipotent cells can be generated in vitro from several adult human organs (heart, liver, and bone marrow). Blood. 110 (9), 3438-3446 (2007).
- da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P. C., Nardi, N. B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119, Pt 11 2204-2213 (2006).
- Cencioni, C., et al. The double life of cardiac mesenchymal cells: Epimetabolic sensors and therapeutic assets for heart regeneration. Pharmacol Ther. 171, 43-55 (2017).
- Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
- Germani, A., Foglio, E., Capogrossi, M. C., Russo, M. A., Limana, F. Generation of cardiac progenitor cells through epicardial to mesenchymal transition. J Mol Med (Berl). 93 (7), 735-748 (2015).
- Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A.
- Di Maggio, S., et al. Non-oxidizable HMGB1 induces cardiac fibroblasts migration via CXCR4 in a CXCL12-independent manner and worsens tissue remodeling after myocardial infarction. Biochim Biophys Acta. , (2017).
- Czapla, J., et al. Human Cardiac Mesenchymal Stromal Cells with CD105+CD34- Phenotype Enhance the Function of Post-Infarction Heart in Mice. PLoS One. 11 (7), 0158745 (2016).
- Gambini, E., et al. C-kit+ cardiac progenitors exhibit mesenchymal markers and preferential cardiovascular commitment. Cardiovasc Res. 89 (2), 362-373 (2010).
- Gourdie, R. G., Dimmeler, S., Kohl, P. Novel therapeutic strategies targeting fibroblasts and fibrosis in heart disease. Nat Rev Drug Discov. 15 (9), 620-638 (2016).
- Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).
- Detert, S., et al. The Atrial Appendage as a Suitable Source to Generate Cardiac-derived Adherent Proliferating Cells for Regenerative Cell-based Therapies. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Miteva, K., et al. Human cardiac-derived adherent proliferating cells reduce murine acute Coxsackievirus B3-induced myocarditis. PLoS One. 6 (12), 28513 (2011).
- Bassetti, B., Capogrossi, M. C., Pompilio, G. Power Is Nothing Without Control: The Enduring Search for the Best Cell in Cardiac Cell Therapy at a Crossroads. Circ Res. 119 (9), 988-991 (2016).
- Nigro, P., et al. Cell therapy for heart disease after 15 years: Unmet expectations. Pharmacol Res. , (2017).
- Ikebe, C., Suzuki, K. Mesenchymal stem cells for regenerative therapy: optimization of cell preparation protocols. Biomed Res Int. 2014, 951512 (2014).
- Marcus, F. I., et al. Diagnosis of arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy/dysplasia: proposed modification of the task force criteria. Circulation. 121 (13), 1533-1541 (2010).
- Pieroni, M., et al. High prevalence of myocarditis mimicking arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy differential diagnosis by electroanatomic mapping-guided endomyocardial biopsy. J Am Coll Cardiol. 53 (8), 681-689 (2009).
- Casella, M., et al. Feasibility of combined unipolar and bipolar voltage maps to improve sensitivity of endomyocardial biopsy. Circ Arrhythm Electrophysiol. 8 (3), 625-632 (2015).
- Cooper, L. T., et al. The role of endomyocardial biopsy in the management of cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association, the American College of Cardiology, and the European Society of Cardiology Endorsed by the Heart Failure Society of America and the Heart Failure Association of the European Society of Cardiology. Eur Heart J. 28 (24), 3076-3093 (2007).
- Leone, O., et al. 2011 consensus statement on endomyocardial biopsy from the Association for European Cardiovascular Pathology and the Society for Cardiovascular Pathology. Cardiovasc Pathol. 21 (4), 245-274 (2011).
- Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circ Res. 121 (2), 113-124 (2017).
- From, A. M., Maleszewski, J. J., Rihal, C. S.
