Summary
I denna artikel föreskrivs en metod för att isolera hjärt mesenkymala stromaceller från endomyokardiella bioptic prover av Högerkammarfunktion kardiomyopati patienter. Deras karakterisering och protokollet till öka deras adipogena differentiering beskrivs.
Abstract
En normal vuxen hjärtat består av flera olika celltyper, bland vilka hjärt mesenkymala stromaceller representerar en riklig befolkning. Isolering av dessa celler erbjuder möjligheten att studera deras deltagande i hjärtsjukdomar, och dessutom ger en användbar primär cell modell för att undersöka biologiska mekanismer.
Här beskrivs metoden för isolering av C-MSC från Högerkammarfunktion kardiomyopati patienternas bioptic prover. Endomyokardiella biopsi provtagningen styrs i områdena höger kammare intill ärret visualiseras av electro-anatomisk kartläggning. Nedbrytning av biopsier i kollagenas och deras plätering på en plast skålen i odlingsmedium för att C-MSC tillväxt beskrivs. De isolerade cellerna kan utökas i kulturen för flera passager. För att bekräfta deras mesenkymala fenotyp, tillhandahålls beskrivningen av immuno-fenotypiska karakteriseringen. C-MSC är kunna differentieras till flera celltyper som adipocyter, kondrocyter och osteoblaster: i samband med ACM, kännetecknas av fettceller insättningar i patienters hjärtan, protokollen för adipogena differentiering av C-MSC och karakterisering av lipid droplet ackumulering beskrivs.
Introduction
Mesenkymala stromaceller celler (MSC) är vuxna celler med en viktig stödjande funktion i många vävnader1. Benmärgen utgör historiska källan till MSC, men de kan isoleras från olika vävnader inklusive placenta, fettvävnad, navelsträngsblod, levern och hjärtat1,2.
I 2006 anges den internationella föreningen för cellulära terapi (ISCT), för första gången, minimal kriterier för att definiera mänskliga MSC3. I synnerhet måste MSC ha möjlighet att ansluta sig till plast. De uttrycker specifika ytantigener: positivitet för CD44, CD105, CD29 och CD90 mesenkymala markörer, och negativitet för CD14, CD45, CD34, CD31 hematopoetiska och endotelceller markörer karakterisera MSC. På grund av brist på uttrycket av HLA-DR, MSC är oförmögna att utlösa alloreaktivitet. Dessutom är de multipotenta celler med potential att differentiera mot adipogena, chondrocyte och osteoblast härstamningar1,3.
Fokusera på hjärt cellulära sammansättningen, är hjärt mesenkymala stromaceller (C-MSC) rikligt i en normal vuxen hjärtat4,5. De spelar en avgörande roll både i normal hjärtfunktion och sjukliga tillstånd. Tag, fysiologiskt, C-MSC ger en närmiljön som stödjer hjärtmuskeln strukturella och funktionella integritet, i hjärtsjukdomar de aktiveras som svar på hjärt-skada som deltar i sårläkning och fibrotiska remodeling6 ,7.
Nyligen har C-MSC engagemang i Högerkammarfunktion kardiomyopati (ACM) fett substitution varit visat8. I synnerhet är ACM en genetisk sjukdom som främst orsakas av mutationer i desmosomal gener som leder till hjärtinfarkt fibro-fettsyror replacement, främst i höger kammare9. Denna substitution, sträcker sig från epicardium till endocardium, skapar ett icke-ledande substrat som framkallar progressiv hjärtsvikt och förvärrar ventrikulära arytmier, vilket kan leda, i svåra fall, till plötslig död. Sommariva o.a. visade de före adipocyter mesenkymala ursprung i ACM patienternas explanterad hjärtat sektioner. Dessutom C-MSC isolerade från endomyokardiella biopsier av ACM hjärtan express desmosomal gener och därför kan påverkas av deras mutationer. I synnerhet under adipogena förhållanden, ACM C-MSC ackumulera mer lipider än de från kontroll hjärtan. Detta bevis leder till slutsatsen att C-MSC både har en aktiv roll i sjukdomen patogenesen och representerar en giltig cell modell att studera ACM.
För att underlätta framtida forskning i detta sammanhang eller andra hjärtsjukdomar som en hjärt biopsi indikeras, presenteras ett detaljerat protokoll för isolering av C-MSC från små fragment av endomyokardiella vävnad, deras expansion, deras immuno-fenotypiska karakterisering och adipogena differentiering.
Protocol
Detta tillvägagångssätt överensstämmer med Helsingforsdeklarationen och höger kammare provtagning var godkänt ”Centro Cardiologico Monzino IRCCS” etikkommittén (07/06/2012).
1. lösningar
- Gör TMES medium för C-MSC kultur med Iscoves modifierade Dulbecco's Medium (IMDM), kompletterat med 20% fetalt bovint Serum (FBS), 10 ng/mL basic fibroblast tillväxtfaktor, 10.000 U/mL Penicillin, 10 000 µg/mL Streptomycin och 0,02 M L-glutamin. Filtrera TMES mediet med hjälp av en steril filterenhet 0,22 µm och förvaras vid 4 ° C.
- För att förbereda kollagenas lösning, att resuspendera kollagenas NB4 mixen i IMDM medium att få en slutlig lösning med en koncentration på 3 mg/mL. Vortexblanda försiktigt för att lösa upp pulvret och filtrera kollagenas lösningen med ett 0,2 µm spruta filter. Alikvotens 1 mL volym in i 2 mL sterilt rör och förvaras vid-20 ° C tills den behövs för användning.
- Att förbereda T. ADIPO medium, göra adipogena medium med IMDM medium kompletteras med 10% FBS, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (pre utspätt i dimetyl sulfoxid (DMSO) till en koncentration av 0,5 M och förvaras vid-20 ° C fram till användning), 1 µM hydrokortison (spädas före i DMSO på 100 mM och ytterligare utspädd till 10 mM i sterilt destillerat vatten och förvaras vid-20 ° C fram till användning) och 0,1 mM indometacin (pre utspätt i DMSO till en koncentration av 0,5 M och förvaras vid-20 ° C fram till användning). Filtrera T. ADIPO medium med en 0,22 µm sterila filterenheten och förvaras vid 4 ° C.
- Förbereda tvätt buffert består av fosfatbuffrad saltlösning 0.0067 M PO4 (PBS), etylendiamin tetra ättiksyra (EDTA) 5 mM, och 5% bovint serumalbumin och förvaras vid 4 ° C.
- Förbereda olja röd O (ORO) fungerande lösning genom filtrering med hjälp av en 0,22 µm filterenhet att ta bort fällningar, upplösning 1% ORO pulvret i 60% isopropanol och blandning för 2 h. Lagra den fungerande lösningen vid rumstemperatur (RT).
2. isolering av hjärt mesenkymala stromaceller
-
Hjärt biopsi insamling och bearbetning
Obs: innan du börjar, se till att ha kollagenas lösningen och det TMES mediet redo.- Sätta ACM endomyokardiella biopsi (vanligtvis ca 5 mg vävnad) i ett sterilt rör fyllda med TMES och transportera det till laboratoriet.
Obs: ACM biopsier insamlas elektrofysiologi operationssalen, enligt tidigare rapporter10. Kort, integrationen av electro-anatomisk kartläggning och intrakardiellt ekokardiografi i höger kammare (se Video 1) används för att vägleda endomyokardiella biopsi (se Video 2, fluoroskopi) i skrivelser till gränszonen för den sjuka hjärtmuskeln. Friska Control (HC) prover levereras av bio-vävnadsbank, erhålls från höger kammare gratis väggen av avlidna givare inom 24 timmar efter döden (dödsfall, friska försökspersoner). Under transport och innan dissektion, lagra biopsi i TMES vid 4 ° C. Begränsa tiden mellan biopsi insamling och vävnad behandling (max 24 h). - Ställa in biologisk säkerhet skåp med krävs lösningar att genomföra förfarandet fram till enzymatisk nedbrytning.
- Sätta autoklaven under huven och slå på instrumentet 15 min innan användning tills temperaturen stiger 200-250 ° C.
- Sterilisera sax och pincett för 10 s. göra säker de steriliserade instrument är kallt före användning. Förbereda disponibel steril skalpeller.
- Placera rören med biopsi i sterila huven. Öppna tuben och överföra biopsi till en steril platta.
- Tvätta höger kammare biopsi två gånger med 3 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Om du vill ta en bild av biopsi på mikroskopet.
- Överföra höger kammare biopsi, med steril pincett, till en steril 2 mL tub som innehåller 1 mL av lösningen kollagenas.
- Skär provet i 0,5 - 1 mm3 bitar med steril sax.
- Inkubera i 1,5 h vid 37 ° C under kontinuerlig roterande agitation.
- Centrifugera smält lösningen vid 400 x g i 10 min vid RT.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning att tvätta pelleten.
- Centrifugera vid 400 x g under 10 minuter vid RT.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 mL TMES medium.
- Tavla erhållna suspensionen på steril 60 mm vävnadsodling behandlas plattan och lägga TMES medium till slutvolymen av 3 mL. Inkubera plattan i en cell kultur inkubator vid 37 ° C med 5% CO2.
Obs: En högre volym av medium kan hindra korrekt vidhäftning av en smält biopsi fragment. - Efter 24 h, kassera medlet för att ta bort icke-anhängare celler och skräp.
Obs: Enstaka dissocierade mesenkymala celler kan bifoga till plastytan och ge upphov till kloner; också, osmält små biopsi fragment kan bifoga till plast skålen och låt cellen groning. - Tvätta plattan två gånger med 5 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning och Lägg 3 mL färsk TMES medium.
- Ersätta TMES medium tre gånger i veckan tills cellerna är 80% konfluenta.
Obs: Antalet bifogade celler beror på kvaliteten, mängden vävnad och effektiviteten i matsmältningen.
- Sätta ACM endomyokardiella biopsi (vanligtvis ca 5 mg vävnad) i ett sterilt rör fyllda med TMES och transportera det till laboratoriet.
3. cell Expansion
Obs: Innan du börjar se till att ha TMES medium redo.
- När cellerna är 80% konfluenta, överföring smält små bioptic proverna i en ny steril 60 mm vävnad kultur behandlas plattan och tillsätt 3 mL färsk TMES medium.
Obs: Bioptic proverna kan återanvändas för ytterligare C-MSC isolering. Det är möjligt att upprepa proceduren tills det finns ett betydande antal isolerade celler. - Tvätta två gånger med 3 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning bifogade cellerna. Lägg trypsin-EDTA-lösning (0,5 mL för en 60 mm maträtt) och inkubera vid 37 ° C för 3-5 min till tillåta cellen avlossning.
- När cellerna är fristående från ytan av plattan, tillsätt 0,5 mL steril FBS att inaktivera trypsin och samla celler in i en ny 50 mL sterilt rör.
- Tvätta plattan två gånger med 5 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning att lägga till de återstående cellerna i samma rör.
- Centrifugera cellerna vid 400 x g i 10 min vid RT.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 mL TMES medium.
- Ladda 10 µL cellsuspension i cellen räknar kammare.
Obs: Om cellerna är alltför koncentrerade, späd den inledande suspension 1:10 i PBS och ladda 10 µL utspädda cellerna i cellen räknar kammare. - Under mikroskopet, räkna celler i 3 stora torgen och på raderna i två av sina sidor och beräkna det genomsnittliga antalet celler.
Obs: För att få antalet celler/mL, multipliceras Genomsnittligt räknade celler 104, utspädningsfaktorn för cellen räknar kammare. Om cellerna har varit ytterligare utspädning, multiplicera för utspädningsfaktorn. Förhållandet mellan antalet cell till utsäde och cellkoncentrationen (antal celler/mL) motsvarar till volymen (i mL) av inledande suspension till vara klädd för nästa steg (punkt 3.9). - Tavla resuspension på steril 100 mm vävnadsodling behandlade plattorna med en slutlig koncentration på 5 000-10 000 celler/cm2 och lägga TMES medium till slutvolymen av 8 mL. Inkubera plattan i en cell kultur inkubator.
Obs: Upprepa förfarandet cell expansion när cellerna är 70-80% konfluenta. Vid varje passage (P) rekommenderas det att frysa en del av cellerna och plattan resterande belopp. Expandera cellerna tills P3 eller P4 och använda för lysrör-aktiverad cell sorterare (FACS) analys (avsnitt 4) och adipogena differentiering (avsnitt 5). - För frysförvaring efter avskildhet, Centrifugera cellerna vid 400 x g i 10 min vid RT.
- Räkna celler som beskrivs (steg 3,7-3,8) och resuspendera 1 x 106 celler i 900 µL sterilt FBS. Överför till en steril cryo-injektionsflaska och tillsätt 100 µL sterilt DMSO och blanda.
- Snabbt lagra cryo-injektionsflaskorna i en frysning behållare vid-80 ° C i minst 2 dagar och sedan överföra injektionsflaskorna i flytande kväve.
4. karakterisering av hjärt mesenkymala stromaceller av flödescytometri
Obs: Innan du börjar, se till att ha cell dissociation reagens, tvättning buffert samt de specifika antikropparna beredd.
- När antalet cell når minst 3 x 10 tvätta6 (antal celler som beskrivs i 3,7-3,8), 100 mm plattan två gånger med 10 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
- Tillsätt 5 mL av en cell dissociation reagens och vänta 7-10 min på RT att tillåta cellen avskildheten.
- När cellerna är fristående från ytan av plattan, tillsätt 15 mL steril tvätt buffert och samla in fjädringen i en ny 50 mL sterilt rör.
- Tvätta plattan två gånger med 10 mL tvätt buffert och lägga till de återstående cellerna i samma rör.
- Centrifugera cellerna vid 400 x g i 10 min på RT och återsuspendera pelleten i 1 mL av tvätt buffert.
- Räkna celler som beskrivs (steg 3,7-3,8), och överför 3 x 106 celler till en ny steril tub och lägga till tvätt buffert i den avslutande volymen i 1,5 mL.
Obs: Antalet totala cell och den totala mängden tvätt buffert beror på antalet valda markörer används för analysen (3 x 105 celler i 100 µL för varje FACS polystyren rör). - Fördela 100 µL cellulära suspension i 12 olika FACS polystyren rören och Lägg den specifika antikroppen i koncentration som anges i produktdatabladet.
Obs: Antikroppar används för C-MSC karakterisering är CD34, CD105, CD45, CD29, CD90, CD44, CD31, CD14 och HLA-DR (tabell 1). Det är viktigt att förbereda ett kontrollprov som består av 100 µL återsuspenderad cellerna färgas med isotypen kontroll att kontrollera signalen specificitet. - Inkubera proverna för 15 min i mörker.
- Tillsätt 1 mL steril tvätt buffert i varje rör att stoppa reaktionen.
- Centrifugera cellerna vid 400 x g i 10 min vid RT.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 250 µL av tvätt buffert.
- Gå vidare till C-MSC karakterisering med flödescytometri.
5. adipogena differentiering av hjärt mesenkymala stromaceller
Obs: Innan du börjar, se till att ha förberett T. ADIPO medium och ORO fungerande lösning.
-
Kultur i T. ADIPO medium
- Lossa och räkna cellerna som beskrivs i avsnitt 3.
- Plate 3 x 105 celler till varje brunn av en steril 6-väl vävnad kultur behandlas plattan i 2 mL av T. ADIPO medium.
- Låt C-MSC skilja i T. ADIPO medium för 72 h eller 1 vecka, ändra medium varje 2-3 dagar.
-
Olja röd O färgning
Obs: Använd olja Red O (ORO) färgning för att testa lipid ackumulering i C-MSC.- Placera den 6-väl vävnadskultur plateunder i dragskåp.
- Ta bort det adipogena mediet och tvätta cellerna två gånger med 2 mL PBS.
- Tillsätt 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) att omfatta samtliga tillräckligt mängd väl. Fixa cellerna för 5 min vid RT.
- Kassera PFA och tvätta cellerna två gånger med 2 mL PBS.
- Inkubera fast cellerna med ORO fungerande lösning för 1 h på RT, med tillräckligt med volym för att täcka varje väl.
Obs: Förvara inte 6-väl vävnadsodling plattan under i dragskåp under ORO inkubation att undvika avdunstning av ORO fungerande lösning. - Ta bort alla ORO fungerande lösning och tvätta med 2 mL PBS 3 - 5 gånger tills plattan är helt rengjord; Kassera tvättar. Stoppa tvättarna när PBS används är klart och när du inte ser, under mikroskopet, ospecifik färgning ut ur cellerna.
- Ta 20 bilder på 20 X förstoring för varje brunn med hjälp av den inverterade vävnadsodling faskontrastmikroskop.
- Öppna bilder med bild bearbetningsprogram att kvantifiera cellen ORO ackumulering.
- Skiljer de olika färgkanalerna genom funktionen ”split kanaler” för att kvantifiera endast luminansen i 255-röd kanal.
- Räkna antalet celler för varje bild genom att räkna kärnorna. Normalisera ORO signal intensiteten på cell nummer.
- Beräkna medelvärdet för de resultat som erhålls för varje bild på samma prov.
Representative Results
Hjärt stromal celler isolering: C-MSC isolering från endomyokardiella biopsier förfarande sammanfattas i figur 1.
Hjärt stromal celler mesenkymala karakterisering: Som fastställts av den internationella föreningen för cellulära terapi (ISCT), innehåller minimivillkoren för att definiera multipotenta mesenkymala stromaceller deras immuno-fenotypisk karakterisering3. I synnerhet för att bekräfta deras mesenkymala härstamning, cellerna inkuberas med lämpliga FITC/PE/APC-konjugerade antikroppar och analyseras med flödescytometri. Alla de antikroppar som används i C-MSC karakterisering listas i Tabell av material.
Som illustreras i figur 2, är C-MSC erhållits från biopsier positiva för specifika mesenkymala ytantigener CD29, CD44 och CD105. Andelen CD90 positiva celler är variabel, som tidigare rapporterats11. Den endothelial (CD31, CD34), monocyt/makrofag (CD14), hematopoetiska (CD45) markörer och stora histocompatibility komplex (HLA-DR) är inte uttryckt (figur 2).
Hjärt mesenkymala stromaceller adipogena differentiering: Du uppmanas deras adipogena differentiering, C-MSC från patienter som drabbats av ACM och HC måste vara odlade i T. ADIPO medium (lösningar avsnitt). Cellerna finns kvar i kultur för 72 h eller 1 vecka, ersätta mediet två gånger i veckan.
Ansamling av intracellulära lipid droppar framgår av ORO färgning (figur 3). Förmåga, liksom i graden av differentiering, skillnader mellan de celler som erhållits från ACM och HC. I de representativa bilderna visas ackumuleras ACM C-MSC mer lipid droppar än HC C-MSC efter 72 h av kultur i adipogena medium (figur 3). Dessa skillnader bibehålls även när celler utsätts för adipogena differentiering förhållanden under en längre period (1 vecka) (figur 3).
Video 1: Integrering av electroanatomical karta och intrakardiellt ekokardiografi. Endokardiella unipolär electroanatomical kartor av höger kammare (vänster främre sneda och höger främre sneda visningar) hos en patient som genomgår endomyokardiella biopsi (lägre paneler). Begränsade områden av låg spänning (röd/grön) är synliga vid spetsen. Endomyokardiella bioptic prover (märkta som cirkel) samlas i korrespondens till sjuka hjärtmuskeln och interventricular septum. Realtid intrakardiellt ekokardiografi kan kontrollera rätt position för bioptome på målområdet (övre panel). Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 2: fluoroskopi video i höger främre sneda se. Bioptome sätts genom en lång-deflectable slida och avancerade in i ventrikeln. Efter en noggrann kontroll av den bioptome kontakten med hjärtmuskeln, Käkarna öppnas och sedan ordentligt stängd för att samla in provet. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Figur 1: förfarande utkast. Endomyokardiella bioptic provet samlas med en bioptome kateter, en liten pincett-formade skärande instrument. Den erhållna biopsin väger cirka 5 mg (A). Endomyokardiella bioptic provet mals till 0,5 - 1 mm3 fragment, med steril sax (B), och kollagenas lösning tillsätts. Provet placeras i en inkubator på 37 ° C på en roterande plattform mixer för 1,5 h för matsmältningen (C). Smält lösningen centrifugeras och klädd i TMES i en plast skål (D). C-MSC erhålls tack vare sin plast följsamhet egenskaper antingen i enstaka celler eller kloner eller GRO från små osmält bioptic fragment (E). C-MSC kännetecknas då av flödescytometri (F). C-MSC är klädd i adipogena medium och lipid droplet ackumulering är testade av olja röd O färgning (G). Skala staplarna visar 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa cyto-fluorimetriskt profil av C-MSC. Varje histogrammet visar celltalet vs. intensiteten av fluorescens i angivna kanalen (PE: fykoerytrin; APC: allophycocyanin; FITC: fluorescein-isothyocyanate). I varje diagram isotypen kontroll (vit) och ett prov konjugerat med specifika cellen visas surface markör antikropp (röd). C-MSC är positivt för mesenkymala ytantigener CD29, CD44, CD105 och, delvis, för CD90, medan de inte uttrycker CD31, CD34, CD14, CD45 och HLA-Dr vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: adipogena differentiering av C-MSC. Representativa bilder av ACM och HC C-MSC, odlade i adipogena medium för 72 h och 1 vecka, målat med ORO (vänster bilder; n = 3). I rätt grafer, kvantifiering av luminansen på 255-röd kanal färgningen rapporteras: intensiteten uttrycks i godtyckliga enheter (A.U.). ACM C-MSC ackumulera mer lipid droppar än kontroller. Students T-test användes, *: p < 0,05. Skala staplarna visar 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
MSC och C-MSC: MSC är multipotenta celler bosatt i stromaceller fraktionen av olika vuxna vävnader, såsom benmärg, fettvävnad, brosk, hjärna, hud, fostrets bilagorna och hjärtat12. Olika studier har utförts för att isolera och karakterisera dem för potentiella tillämpningar i grundläggande och translationell forskning12,13.
I sunda förhållanden är MSC quiescent, själv förnya lågt14. Eftersom de utsätts för patologiska förändringar i miljön, reagerar de främja vävnad remodeling genom antingen direkt transdifferentiation, matrix nedfall eller parakrin effekt14.
Hjärt MSC (C-MSC) representerar en stor icke-myocyt cell befolkningen av hjärtat4. De härstammar från epicardium och migrera till hjärtmuskeln som genomgår processen för epitelial-till-mesenkymala övergången15. De bidrar till hjärt struktur, både i fysiologiska och patologiska stater, genom interaktioner med hjärtmuskelceller och extracellulär matrix homeostas7,16mekaniska och elektriska integritet. Men funktionerna breda utbud av C-MSC är fortfarande inte helt förstått. En djupare kunskap om deras roll som både fysiologiska och patologiska förhållanden kan underlättas genom in vitro- studier utförs efter deras isolering.
C-MSC har erhållits från olika distrikt i det mänskliga hjärtat, såsom förmak bihang2,17 och höger kammare18.
Nyligen, C-MSC från mänskliga höger kammare endomyokardiella bioptic prover har erhållits8, visar att källa vävnaden kunde vara så lite som 3-5 mg.
Möjliga tillämpningar: Den metod som anges i detta manuskript kan få celler med några enkla stycken, såsom matsmältning och urval för plast följsamhet, från mycket små hjärtat exemplar.
C-MSC kan betraktas som en cell modell, eftersom de är lätta att förstärka och underhålla i vitro, och kan skilja i celler av mesenkymala härstamning (endotel, osteocyter och adipocyter). Dessutom utgör möjligheten att erhålla celler direkt från patienter en stor in vitro- verktyg för mekanistiska studier i samband med personlig/precision medicin. Faktiskt, dessa celler bär den genetiska bakgrunden och så småningom specifika mutationer av givarna, och påverkas av särskilda patienternas kännetecken, såsom kliniska tillstånd, ålder, kön, livsstil och mediciner. Dessutom kan möjligheten att sortera dem för olika markörer studiet av specifika C-MSC delmängder19.
C-MSC är kända för att vara aktiva spelare i olika hjärt-kärlsjukdomar, främst kännetecknas av negativa omdaning av hjärtat. De representerar därför kandidat mål för nya terapeutiska strategier för att motverka hjärtsjukdomar8,20.
C-MSC stem-liknande egenskaper och deras brist på betydande immunogenicitet antyder deras potentiella tillämpning i cell-terapi för hjärt regenerativ medicin. Verkligen, som MSC från benmärg eller andra källor, C-MSC kan potentiellt användas såväl i autologa prövningar inställningar, utan behov för matchning mellan givare och mottagare21.
C-MSC, isoleras direkt från hjärtat vävnad, har dessutom fördelen av att vara kopp av hjärt mikro-miljö- och epigenetiska profil. I samband med hjärt regenerativ medicin, kan detta vara särskilt viktigt att få lyckade resultat.
Hittills har identifierat prekliniska studier av regenerativ medicin användbar terapeutisk potential i C-MSC och deras parakrin aktivitet18,22,23. Ännu viktigare, pågår kliniska prövningar där cellen källan är hjärtat med cardiosfere-derived celler eller med subpopulations av C-MSC13,24,25. När det gäller ben-märg-härledda MSC, kan olika protokoll dock krävs för att uppnå klinisk grade C-MSC26.
C-MSC i ACM: Presenterade protokollet är mest lämplig för studier av patologier som en endokardiella biopsi indikeras. ACM patienter genomgå bioptic förfaranden för diagnostiska ändamål27. Deras hjärtmuskeln ersätts gradvis av ärr-vävnad, en elektriskt inert vävnad som består av adipocyter och fibros. För att vägleda bioptic provtagning till ärr-området, där det diagnostiska utbytet är maximal, är endomyokardiella mappning begagnade10,28,29. De prover som används i detta protokoll tas i gränsområdet sjuka hjärtmuskeln.
Sommariva et al. har nyligen definierat en nyckelroll för C-MSC i patogenesen av ACM8, visar att C-MSC är aktiva spelare i ACM hjärtat adipogenesis, eftersom Preadipocyter i dessa hjärtan av mesenkymala ursprung. Dessutom isolerade C-MSC med detta protokoll från ACM patienternas biopsier visade mer benägenhet att både lipid ackumulering och adipogenesis än kontroller. Därför kan dessa celler användas för att bekräfta några av de molekylära mekanismerna av ACM, bevisar deras lämplighet som cell modell för mekanistiska studier9.
Begränsningar och kritiska steg: Trots fördelarna för att få C-MSC direkt från patienter (se stycket ”möjliga tillämpningar”), utsätts detta protokoll för olika begränsningar.
Först och främst hjärt bioptic förfarandet är invasiv och ofta undvikas om inte absolut nödvändigt. Provtagning hjärtvävnad faktiskt såväl tekniskt som etiskt problematiskt. Skälen för att utföra en hjärt biopsi kan vara att uppnå en definitiv diagnos i samband med kardiomyopati i differentiell diagnos, övervakning av statusen för hjärt transplantationer eller att fastställa förekomsten av en hjärta tumör30. Därför kan endast patienter som en endomyokardiella biopsi indikeras av samförstånd uttalande31 registreras för forskning om C-MSC. Dessutom kan hjärt bioptic förfarandet ha kliniska komplikationer, framför allt i cardiomyopathic hjärtan. Därför electrophysiologist's provtagningar är alltid försiktig och bioptic prover kan vara mycket liten, att kompromissa med isolering av celler. Framtida experiment kunde övervinna problemet genom tuning kollagenas koncentration eller tidpunkten för matsmältningen.
C-MSC, Visa som alla primära mänskliga celler, en hög variabilitet mellan olika ämnen i alla fenotyper. Celler från olika ämnen är faktiskt inte bara genetiskt olika, men också betvingade till variabel miljö luftkonditionering. Specifikt inom detta experiment observeras en hög variation i isolering, tillväxt och adipogena celldifferentiering.
Kritiska steg i detta protokoll måste erkännas. Om bioptic provet innehåller kapillärer, måste de tas bort för att undvika parallella isolering av endotelceller, som kan förorena C-MSC kulturen, och som kan styrkas av den FACS analysen (positivitet för CD31). För att få en effektiv adipogena differentiering, måste celler i en aktiv tillväxtfas. Graden av sammanflödet kan också påverka lipid ackumulering.
Betydelse för metoden: Med avseende på tidigare metoder för isolering av mesenkymala stromaceller är detta första gången där beskrivningen av C-MSC obtainmenten direkt från mänskliga ventrikulära bioptic prover föreslås i detalj. Även om denna metod föreslås för bearbetning av ACM patientprover, är det potentiellt tillämpliga på alla patienter som en hjärt biopsi indikeras.
Detta protokoll utgör en användbar genomförandet av föregående metoder för obtainmenten av celler som krävs större hjärt prover32, som ofta är svåra att samla in.
Dessutom utgör provkällan en intressant innovation. Medan ventrikulära biopsi utförs vanligtvis på de septum33, tar detta protokoll in i konto produktproverna höger kammare gratis väggen. Celler från distriktet sjuka höger kammare kan vara mer representativ för patologiska status för sjukdomar som involverar RV.
Dessutom är några av de reagens som används i detta protokoll olika med avseende på andra C-MSC isolering och differentiering metoder32. Till exempel vilken typ av kollagenas som föreslås i detta manuskript är en blandning av klass I och klass II kollagenaserna med ett balanserat förhållande av proteolytiska verksamhet. Dessutom består matsmältningen lösningen av kollagenas blandning upplöst i samma basala medium (IMDM) används för beredning av C-MSC odlingsmedium, så att isolerade C-MSC att anpassa sig till framtida tillväxt.
Dessutom även sortering förfaranden skulle kunna standardisera cell batchen, använder hela C-MSC befolkningen, isolerade endast via egenskapen plast följsamhet i dessa celler, utgör en förenkling utan att ändra immunophenotypic Kännetecken för C-MSC. Sammansättningen av T. ADIPO föreslås i detta manuskript är kompetent att leda till adipogena differentiering, undvika den metabola dysreglering inducerad av andra komponenter såsom insulin.
Dessutom ger den föreslagna metoden för lipid ackumulering kvantifiering, som är baserat på utvärdering av ORO kolorimetriska intensitet, mer information om kvantiteten av de ackumulerade lipider, om jämfört med metoder baseras endast på andelen av celler som är positiva till ORO färgningen. Ofta lipid ackumulering kvantifieras genom att extrahera ORO införlivas genom celler med isopropanol och mätning av dess absorbering. Men denna metod kräver fler passager och utsätts för variabilitet på grund av isopropanol avdunstning.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av italienska hälsovårdsministeriet, Ricerca Corrente till Centro Cardiologico Monzino-IRCCS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Gibco by Life Technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN | Life Technologies Italia | 15140122 | |
| Collagenase NB4 | Serva | 17454.02 | |
| Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B | |
| L-glutammine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Tryple select 1X (cell dissociation reagent) | Gibco | 12563029 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T6689 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Paraformaldehyde (PFA) Solution 4% in PBS | D.b.a. Italia S.r.l. | sc-281692 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Antibody CD14-FITC (MφP9) | Becton Dickinson | 345784 | |
| Antibody Integrin β1 (CD29)-PE (clone MAR4) | Becton Dickinson | 561795 | |
| Antibody PECAM-1 (CD31)- APC (clone 9G11) | R&D Systems | FAB3567A | |
| Antibody Hematopoietic progenitor cell antigen (CD34)-APC (clone 581) | Thermo Fisher Scientific | CD34-581-05 | |
| Antibody H-CAM (CD44)-PE (clone G44-26) | Becton Dickinson | 561858 | |
| Antibody L-CA (CD45)-APC (clone HI30) | Thermo Fisher Scientific | MHCD4505-4 | |
| Antibody THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10) | Becton Dickinson | 561969 | |
| Antibody Endoglin (CD105)-APC (clone 266) | Becton Dickinson | 562408 | |
| Antibody HLA-DR-FITC (clone L243) | Becton Dickinson | 347400 |
|
| Gima Quick Plus sterilizer | Gima | 35642 | |
| Bench centrifuge Sigma 3-16K | Sigma Centrifuges | 10330 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| AxioVert 200M microscope | Zeiss | B 40-080 e 03/01 | |
| FACS Gallios | Beckman Coulter | 773231AF | |
| ImageJ (image processing program) | NIH | ||
| Stericup filter units | Merck S.P.A. | SCGPU05RE | |
| Conical Tubes, 50 mL | Eppendorf | 30122178 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Eppendorf | 30122151 | |
| Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
| 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 60 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430166 | |
| 6 well TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3516 | |
| Polystyrene Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Falcon | 352058 | |
| BRAND counting chamber BLAUBRAND Bürker-Türk | Sigma-Aldrich | BR719520 |
References
- Brooke, G., et al. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells. Semin Cell Dev Biol. 18 (6), 846-858 (2007).
- Rossini, A., et al. Human cardiac and bone marrow stromal cells exhibit distinctive properties related to their origin. Cardiovasc Res. 89 (3), 650-660 (2010).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Doppler, S. A., et al. Cardiac fibroblasts: more than mechanical support. J Thorac Dis. 9, Suppl 1 36-51 (2017).
- Moore-Morris, T., Guimaraes-Camboa, N., Yutzey, K. E., Puceat, M., Evans, S. M. Cardiac fibroblasts: from development to heart failure. J Mol Med (Berl). 93 (8), 823-830 (2015).
- Jugdutt, B. I. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108 (11), 1395-1403 (2003).
- Brown, R. D., Ambler, S. K., Mitchell, M. D., Long, C. S. The cardiac fibroblast: therapeutic target in myocardial remodeling and failure. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 45, 657-687 (2005).
- Sommariva, E., et al. Cardiac mesenchymal stromal cells are a source of adipocytes in arrhythmogenic cardiomyopathy. Eur Heart J. 37 (23), 1835-1846 (2016).
- Sommariva, E., Stadiotti, I., Perrucci, G. L., Tondo, C., Pompilio, G. Cell models of arrhythmogenic cardiomyopathy: advances and opportunities. Dis Model Mech. 10 (7), 823-835 (2017).
- Casella, M., et al. Electroanatomical mapping systems and intracardiac echo integration for guided endomyocardial biopsy. Expert Rev Med Devices. 14 (8), 609-619 (2017).
- Beltrami, A. P., et al. Multipotent cells can be generated in vitro from several adult human organs (heart, liver, and bone marrow). Blood. 110 (9), 3438-3446 (2007).
- da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P. C., Nardi, N. B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119, Pt 11 2204-2213 (2006).
- Cencioni, C., et al. The double life of cardiac mesenchymal cells: Epimetabolic sensors and therapeutic assets for heart regeneration. Pharmacol Ther. 171, 43-55 (2017).
- Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
- Germani, A., Foglio, E., Capogrossi, M. C., Russo, M. A., Limana, F. Generation of cardiac progenitor cells through epicardial to mesenchymal transition. J Mol Med (Berl). 93 (7), 735-748 (2015).
- Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A.
- Di Maggio, S., et al. Non-oxidizable HMGB1 induces cardiac fibroblasts migration via CXCR4 in a CXCL12-independent manner and worsens tissue remodeling after myocardial infarction. Biochim Biophys Acta. , (2017).
- Czapla, J., et al. Human Cardiac Mesenchymal Stromal Cells with CD105+CD34- Phenotype Enhance the Function of Post-Infarction Heart in Mice. PLoS One. 11 (7), 0158745 (2016).
- Gambini, E., et al. C-kit+ cardiac progenitors exhibit mesenchymal markers and preferential cardiovascular commitment. Cardiovasc Res. 89 (2), 362-373 (2010).
- Gourdie, R. G., Dimmeler, S., Kohl, P. Novel therapeutic strategies targeting fibroblasts and fibrosis in heart disease. Nat Rev Drug Discov. 15 (9), 620-638 (2016).
- Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).
- Detert, S., et al. The Atrial Appendage as a Suitable Source to Generate Cardiac-derived Adherent Proliferating Cells for Regenerative Cell-based Therapies. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Miteva, K., et al. Human cardiac-derived adherent proliferating cells reduce murine acute Coxsackievirus B3-induced myocarditis. PLoS One. 6 (12), 28513 (2011).
- Bassetti, B., Capogrossi, M. C., Pompilio, G. Power Is Nothing Without Control: The Enduring Search for the Best Cell in Cardiac Cell Therapy at a Crossroads. Circ Res. 119 (9), 988-991 (2016).
- Nigro, P., et al. Cell therapy for heart disease after 15 years: Unmet expectations. Pharmacol Res. , (2017).
- Ikebe, C., Suzuki, K. Mesenchymal stem cells for regenerative therapy: optimization of cell preparation protocols. Biomed Res Int. 2014, 951512 (2014).
- Marcus, F. I., et al. Diagnosis of arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy/dysplasia: proposed modification of the task force criteria. Circulation. 121 (13), 1533-1541 (2010).
- Pieroni, M., et al. High prevalence of myocarditis mimicking arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy differential diagnosis by electroanatomic mapping-guided endomyocardial biopsy. J Am Coll Cardiol. 53 (8), 681-689 (2009).
- Casella, M., et al. Feasibility of combined unipolar and bipolar voltage maps to improve sensitivity of endomyocardial biopsy. Circ Arrhythm Electrophysiol. 8 (3), 625-632 (2015).
- Cooper, L. T., et al. The role of endomyocardial biopsy in the management of cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association, the American College of Cardiology, and the European Society of Cardiology Endorsed by the Heart Failure Society of America and the Heart Failure Association of the European Society of Cardiology. Eur Heart J. 28 (24), 3076-3093 (2007).
- Leone, O., et al. 2011 consensus statement on endomyocardial biopsy from the Association for European Cardiovascular Pathology and the Society for Cardiovascular Pathology. Cardiovasc Pathol. 21 (4), 245-274 (2011).
- Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circ Res. 121 (2), 113-124 (2017).
- From, A. M., Maleszewski, J. J., Rihal, C. S.
