Summary
Vi beskriver en protokoll stereotaxic kirurgi med en hjemmelaget leder-fast enhet for microinjecting reagenser i striatum neonatal musen hjerner. Denne teknikken tillater genetisk manipulasjon i neuronal cellene i bestemte regioner neonatal musen hjerner.
Abstract
Mange gener som er uttrykt i embryonale hjernen, og noen av dem er kontinuerlig uttrykt i hjernen etter fødselen. For slike vedvarende uttrykt gener, kan de fungere for å regulere utviklingsprosess og/eller fysiologiske funksjon i neonatal hjernen. Undersøke nevrobiologiske funksjoner av bestemte gener i hjernen, er det viktig å deaktivere gener i hjernen. Her beskriver vi en enkel stereotaxic metode for å deaktivere byggkorn under striatum av transgene mus på neonatal tidsvinduer. AAV-eGFP-grobunn virus var microinjected i striatum Ai14 reporter genet mus på postnatal dag (P) 2 av stereotaxic hjernekirurgi. TdTomato reporter genuttrykk ble oppdaget i P14 striatum, antyder en vellykket grobunn-loxP mediert DNA rekombinasjon i AAV-transduced striatal celler. Vi ytterligere bekreftet denne teknikken av microinjecting AAV-eGFP-grobunn virus i P2Foxp2fl/fl mus. Dobbel merking av GFP og Foxp2 viste at GFP-positive celler manglet Foxp2 immunoreactivity i P9 striatum, tyder tap av Foxp2 protein i AAV-eGFP-grobunn transduced striatal celler. Til sammen viser disse resultatene en effektiv genetisk sletting av stereotaxically microinjected AAV-eGFP-grobunn virus bestemt neuronal bestander i neonatal hjernen floxed transgene mus. Avslutningsvis gir våre stereotaxic teknikken en lett og enkel plattform for genetisk manipulasjon i neonatal musen hjernen. Teknikken kan ikke bare brukes til å slette gener i bestemte regioner neonatal hjerner, men det også kan brukes til å injisere farmakologiske narkotika, neuronal tracers, genmodifiserte optogenetics og chemogenetics proteiner, neuronal aktiviteten indikatorer og andre reagenser i striatum neonatal musen hjerner.
Introduction
Moderne studier av strukturen og funksjon av hjernen krever vanligvis genetisk manipulasjon av bestemte gener i neuronal celler. For å undersøke funksjonene i ulike gener, transgene mus bærer mutant alleler, inkludert er knockout og banke i alleler rutinemessig generert. Stereotaxic hjernekirurgi for voksen gnagere er en standardmetode lokalt levere narkotika, virus, tracers og andre til bestemte områder av gnager hjerner1,2. Bruke stereotaxic hjernekirurgi transgene mus tillater en å manipulere genetisk gen funksjon og neuronal aktivitet bestemt neuronal bestander av musen hjernen. Celle type-spesifikk manipulering gir en kraftig tilnærming dechiffrere neuronal funksjoner i kompliserte nevrale kretser av hjernen3,4,5.
Neural utvikling av nervesystemet begynner på tidlig embryonale stadier, og utviklingsprosesser fortsette etter fødselen til juvenile perioden. Postnatal modning av nervesystemet inneholder nøyaktig synaptic ledninger av nevrale kretser, som er avgjørende for fysiologiske og kognitive funksjoner av hjernen6. Derfor studerer utviklingsmessige hendelser som oppstår i neonatal tidsvinduer er viktig ikke bare for å forstå normal neural utvikling, men det kan også gi innsikt i patogenesen av neurodevelopmental og nevropsykiatriske lidelser7 ,8. Selv om metoder for stereotaxic hjernekirurgi for voksen gnagere er lett tilgjengelig2,9, er noen protokoller tilgjengelige på Internett for stereotaxic hjernekirurgi i neonatal mus10,11. Faktisk er stereotaxic microinjections reagenser i hjernen av neonatal musen pups vanskelig, fordi hodet av neonatal pup er for skjøre til å være fast i standard stereotaxic apparatet. Likevel er anvendelse av stereotaxic hjernekirurgi til transgene mus mulig for neonatal mus12. Her beskriver vi en enkel metode med en hjemmelaget oppsett til å utføre stereotaxic hjernekirurgi i nyfødte musen pups. Viser vi at denne teknikken kan en betinget slette floxed gener ved microinjecting AAV-uttrykke grobunn DNA recombinase i striatum reporter genet mus og betinget floxed transgene mus. Denne teknikken er også aktuelt å levere reagenser i den nyfødte striatum av vill-type mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr protokollene beskrevet her er godkjent av Animal Care og bruk komiteer av nasjonale Yang-Ming University.
1. forberedelse av holderen til Neonatal Pups inne Stereotaxic apparatet
- Gjøre hodet skuffen: Skjær bunnen av en 1,5 mL sentrifuge tube (15 mm lang) i figuren som passer hodet av neonatal pups ved å fjerne 1/5 av veggen av røret.
- Ta en pipette tips boks med riktig størrelse som passer med sokkelen stereotaxic apparater, og fjern toppdekselet. Påføre hodet brettet i trinn 1.1 og en vev innebygging kassett på bunnen av tips brett med hot-smelte limet. Høyden på vev innebygging kassetten er 7 mm som brukes til å støtte pup halsen og kroppen i hodet-fast posisjon.
- Sett hele oppsettet i en standard stereotaxic apparater.
2. forberedelse av 30G injeksjon rustfritt stål nåler
- Pre ren 30 G sprøyte nåler av soaking dem i kloroform for 3 dager.
- Bruk tang til å sakte og forsiktig dra pinnen fra sin polypropylen hub i kjemisk hette.
- Vask pinner med absolutt etanol for 20 min etterfulgt av 70% etanol skyller for 3 × 10 minutter på en shaker på 50 rpm. La nåler luften tørr, og lagre renset nålene i en ren ved romtemperatur (RT) før bruk.
3. forberede et kort Microinjection rør
- Koble mikroliter sprøyten til en 30G injeksjon nål med et PE10 polyetylen rør (PE10 rør). Forberede en PE20 polyetylen rør (PE20 rør) adapter bygge bro injeksjon nålen og mikroliter sprøyten. Bruk av adapteren er nødvendig fordi diameteren på PE10 rør er mye mindre enn nålen av 26G mikroliter.
- Forberede slangen for mikroliter sprøyten: koble pre renset 30 G injeksjon nålen med 5 cm PE20 rør, og forsegle krysset med umiddelbar limet. Denne slangen adapter er gjenbrukbare.
Merk: Hvis nålen microinjection sprøytebytteprogrammer er 30G, forberedelse (trinn 3.1) og bruk (trinn 3.3) av denne adapter er ikke nødvendig. - Koble slangen adapteren (forberedt i trinn 3.1) med en syringe mikroliter (10 µL).
- Koble en ende av PE10 tube (ikke lenger enn 60 cm) på 30G pinnen av PE20 rør adapteren. Montere en ny 30G injeksjon nål på den andre enden av PE10 røret.
4. Legg Microinjection røret med autoklaveres destillert vann, fargestoff og virus
- Fjerne stempelet til sprøyten mikroliter. Bruk en 25G syringe mikroliter sprøyten og den tilkoblede PE rør med autoklaveres destillert vann for å fjerne luft fra slangen.
- Plasserer stempelet tilbake mikroliter sprøyten og skyv stempelet til 2 µL av destillert vann i fat. Ikke la volumet av destillert vann blir lavere enn 2 µL.
- Montere nøye mikroliter sprøyten til mikro flow rate sprøytepumpen.
- Pipetter små mengder 0,1% fast grønt fargestoff (forberedt i 0,9% saltvann og filtrert med 0.22 µm filter) og virus væske til et stykke parafilm.
- Ta en liten mengde luft å synliggjøre en luftboble i krysset mellom 30G injeksjon nål og PE10 rør etterfulgt av lasting 0,7 µL av filtrerte rask grønne inn i røret å teste flyten av fluids microinjection slangen.
- Ta en liten mengde luft for å nå en andre luftboble etterfulgt av laste virus væske i microinjection slangen.
- Fest og sikre 30G microinjection nålen med armen av stereotaxic apparat.
5. anestesi Neonatal mus ved nedkjøling
- Plasser pup i en latex hansker ermet og Dynk kjeden i knust is opp til halsen i 5 min.
- Hugge det pup føtter med tang sørge ingen tilbaketrekning respons på føttene.
- Plasser pup med latex vante erme i hodet brettet og sette noen knust is rundt latex ermet å holde det kaldt for nedkjøling anestesi.
- Bruke vet salve på pup's øyne å hindre tørrhet mens under narkose hvis mulig.
6. microinjection
- Forberede sterilt kirurgi ved å tørke stereotaxic apparatet grundig med 70% etanol. Sterilisere kirurgisk apparatet ved å fordype seg i 70% etanol.
- Skrubbe den pup hode med 70% etanol. Finn landemerke lambda skallen og merke lambda med en markør pennen. Mål pinne-spissen til lambda, og angi anterior-posterior (AP) og mediale-lateral (ML) koordinater som null.
- Flytte injeksjon armen til målet nettstedet X og Y koordinatene til målområdet. For striatum postnatal dag (P) 2 pups, koordinatene er: AP, +2.4 mm anterior lambda; ML, ±1.0 mm lateral fra midtlinjen; rygg-ventrale (DV), −1.7 mm fra skallen. Merk plasseringen av fort grønt fargebad i PE10 rør med en penn.
- Få ned 30G injeksjon nålen sakte å trenge gjennom huden og kraniet, og så oppdra pinne-spissen til den stopper på overflaten av skallen. Angi den DV-koordinaten som null.
- Bringe ned 30G injeksjon nålen langsomt til den når DV koordinaten til målområdet. Vente 1 min tillate parenchyma fortsetter sin normale form. Kjør programmet microinjection (100 nL/min).
- Kontroller at merket av fast grønt fargebad bevegelse i PE røret slik virus væsken injiseres i hjernen.
- Vente 1 min etter avslutningen av microinjection, og deretter sakte og gradvis få opp nålen til 1/2 høyde DV dybde innen 30 s. Etter 30 s, sakte ut nålen fra det pup hode.
- Gjenta trinn 6.2 til 6,7 til microinjections av alle målrettede steder er fullført.
7. etter kirurgisk utvinning av valp
- Varm opp valpen for 20 min i en 33 ° C inkubator. Sjekk utvinning av pup nedkjøling bedøvelsen hver 5 min til pup har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency.
- Returner pup tilbake til demningen etter pup er fullstendig gjenopprettet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For det første settet av eksperimentet, vi microinjected 200 nL AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 virus (AAV-eGFP-grobunn, 1/10 fortynning i Dulbeccos fosfat bufret saltvann) som uttrykker grobunn DNA recombinase smeltet sammen med GFP til P2 striatum Ai14 mus. Ai14 mus uttrykke tdTomato reporter genet på Cre-mediert overstrekingen av loxP-flankert (floxed) stoppe kassett (figur 2F). Hjernen ble høstet på P14 for immunostaining av GFP og tdTomato. Mange AAV transduced GFP-positive celler var tilstede hele striatum (figur 2A, C), som indikerer en omfattende infeksjon av striatal celler av AAV-eGFP-grobunn virus. Lignende omfattende uttrykk for tdTomato ble også funnet i striatum (figur 2B, C). Ved mikroskopisk undersøkelse på forstørring, fant vi at nesten alle GFP-positive striatal celler co-uttrykkes tdTomato reporter genet (figur 2A'-C'). Videre ble tdTomato signaler oppdaget i antagelig axon terminaler i globus pallidus (figur 2D) og substantia nigra pars reticulata (figur 2E), mål regionene striatonigral og striatopallidal projeksjon neurons 13. disse resultatene tyder på en vellykket grobunn-loxP mediert DNA rekombinasjon indusert av AAV-mediert uttrykk for grobunn aktivitet i neonatale striatal neurons.
For det andre settet av eksperimentet, vi microinjected 50 nL AAV-eGFP-grobunn virus i striatum Foxp2fl/fl mus bærer loxP-flankert Foxp2 alleler på P2 (figur 3A- C, F), og høstet hjernen på P9. Ingen Foxp2+; GFP+ dobbel-merket celler ble funnet i striatum, dvs., Foxp2 protein var fraværende i GFP-positive celler (figur 3A'-C'). Kontroll eksperimenter, Foxp2+; GFP+ dobbel-merket cellene var tilstede i striatum Foxp2fl/fl mus med AAV-eGFP kontroll virus (figur 3D) og striatum av heterozygote Foxp2fl / + mus med AAV-eGFP-grobunn virus (figur 3E). Disse resultatene indikerer at Foxp2 genet spesielt slettes AAV-eGFP-grobunn transduced celler av neonatal striatum.
Til sammen resultatene av AAV-eGFP-grobunn; Ai14 og AAV-eGFP-grobunn; Foxp2fl/fl mus, teknikken stereotaxic neonatal hjernen kirurgi som vi utviklet er mottakelig for betinget Slett gener i bestemte regioner neonatal musen hjerner.
Figur 1. Stereotaxic apparater og hjemmelaget leder-fast holder for neonatal mus. (A) stereotaxic injeksjon systemet består av følgende enheter: i. sprøytepumpe (kontroller); II. sprøytepumpe (drivenheten); III. mikroliter sprøyten (10 µL); IV. PE20 rør adapter; v. PE10 rør; Vi. 30G injeksjon nål; VII. stereotaxic apparater; VIII. en pipette tips boksen konvertert plattform for neonatal pups; Xi: knust is. (B) av vev innebygging kassetten er ca 7 mm. Knappen av 1,5 mL sentrifuger er ca 15 mm lang. (C) mus hodet er sikret i hjemmelaget leder-fast holderen. Pilen viser landemerke lambda i hodet av neonatal mus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Uttrykk for tdTomato i striatum P14 Ai14 mus etter AAV-eGFP-grobunn mediert grobunn-loxP DNA rekombinasjon. AAV-eGFP-grobunn virus var sterotaxically injiseres P2 striatum Ai14 mus. Hjernen ble analysert på P14. (A) mange GFP-positive celler finnes i hele striatum (Str). (B) mange tdTomato-positive celler finnes også i striatum. (C) de flettede bildene viser en omfattende co lokalisering av GFP og tdTomato i striatum. AC confocal bilder av innrammede områdene i vekselstrøm vises på forstørring i A'-C "henholdsvis. Alle GFP-positive celler (grønn) express co tdTomato (rød) i striatum. (D, E) TdTomato signalene oppdages i målet områder av striatal projeksjon neurons, inkludert globus pallidus (GP; D) og substantia nigra pars reticulata (SNr; E). (F) skjematisk tegninger av AAV-eGFP-grobunn og Ai14 transgene konstruksjoner. Ctx: cortex; SEP: septum; Hipp: Hippocampus; MB: mellomhjernen. Skala bar i A (for vekselstrøm), 200 µm; A' (for'-C "), 10 µm; D (for D og E), 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Betinget sletting av Foxp2 genet i den nyfødte striatum ved intrastriatal injecions AAV-eGFP-grobunn virus. Intrastriatal injeksjoner av AAV-eGFP-grobunn virus ble utført i P2 Foxp2fl/fl (vekselstrøm ") og Foxp2fl / +(E) mus. Hjernen ble analysert på P9. (A-C) GFP-positive celler (A, C, grønn) mangler Foxp2 immunoreactivity (B, C, rød) i striatum Foxp2fl/fl mus med AAV-eGFP-grobunn virus. Eske regionene i vekselstrøm vises på forstørring i A'-C "henholdsvis. (D) Striatal cellene co express GFP og Foxp2 er tilstede i striatum som ble injisert med AAV-eGFP kontroll virus. (E) GFP-positive celler uttrykke co Foxp2 (pilspisser) finnes i striatum av Foxp2fl / + mus med AAV-eGFP-grobunn virus. (F) skjematisk tegninger AAV-eGFP-grobunn virus og Foxp2fl/fl transgene mus. Skala bar i A (for vekselstrøm), 200 µm; A' (for'-C', D og E), 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studien viser vi en enkel og pålitelig stereotaxic metode for å injisere AAV virus i striatum neonatal musen hjerner. Vi microinjected AAV-eGFP-grobunn virus i striatum Ai14 reporter mus på P2 og deretter analysert genuttrykk reporter på P14. Vi fant AAV transduced GFP-positive celler i hele striatum på rostrocaudal nivå. Videre nesten alle GFP-positive celler co-uttrykkes tdTomato reporter genet i striatal celler, antyder en vellykket grobunn-loxP DNA rekombinasjon indusert av AAV-mediert uttrykk for grobunn aktivitet. Vi ytterligere bekreftet effekten av denne tilnærmingen av microinjections av AAV-eGFP-grobunn i striatum Foxp2fl/fl musene på P2. Dobbel merking viste at mange AAVs-transduced GFP-positive celler manglet Foxp2 immunoreactivity i P9 striatum, antyder en vellykket betinget sletting av Foxp2 genet i neonatal striatum. Volum av microinjected AAVs er korrelert med størrelsen på den infiserte hjerne regioner. Med 200 nL av injisert, GFP-positive celler ble funnet mye gjennom den nyfødte striatum, og noen spredte GFP-positive celler var også tilstede i cortex ved siden av striatum. Med 50 nL av injisert, GFP-positive celler var lokalt begrenset til den nyfødte striatum. Titrating volum av injisert AAVs er derfor viktig for optimal signaltransduksjon neuronal befolkninger i bestemte hjernen regioner. Videre bestemmes signaltransduksjon prisen også av titer viral forberedelser. Det er tenkelig at presis målretting spesifikke celletyper kan oppnås ved hjelp av transgene mus med ulike arrangører.
Det er flere kirurgisk tips for vellykket sprøytebruk AAVs til regionene interessert hjernen. Først på grunn av den lille størrelsen på musen pups og vanskeligheter med å sikre plasseringen av musen hodet med hendene under operasjonen, er det vanskelig å utføre stereotaxic hjernekirurgi i neonatal mus10. Selv om en tidligere studie har vist neonatale stereotaxic kirurgi, men det må to personer til å utføre microinjection under kirurgi11. Vi har overvunnet disse problemene ved å utvikle en skreddersydd hodet-fast enhet som kan sikre fast pup hodet under hjernekirurgi. Hele fremgangsmåten kan utføres av en enkelt person. Hjernen størrelsen på neonatal mus er varierte forskjellig genetisk bakgrunn, mors omsorg og alderen pups. En fordel med vår hjemmelagde enhet er at det gir en mild bortsett sikret fiksering av neonatal mus hodet, som er avgjørende for å utføre høy presisjon stereotaxic hjernekirurgi. Andre elastisiteten i huden myk og tynn vegg av skallen er huden snitt etterfulgt av skallen i hodet vanskelige å utføre i neonatal pups. Du løser dette problemet, er det nødvendig å gjøre en punktering av huden og kraniet med en pinne-spissen før senke injeksjon nålen til målrettet hjernen regionen. For det tredje er det viktig å kontrollere flyten av synlig farge i PE røret å sikre at microinjection er i progresjon under injeksjon. Hvis fargen ikke beveger seg i PE røret, innsats bør tas til problemer skyte problemer, inkludert en mulig lekkasje av væske slangen og tett nåler. Merk at denne metoden gjelder neonatal valpene hvis lambda vises gjennom huden før P5. For pups eldre enn P5 må den kanskje et snitt i huden å avsløre lambda. Merk at lys belysning på P4 og P5 musen hoder kan hjelpe finne landemerke lambda. Selv om vi ikke har utført denne teknikken stereotaxic kirurgi i neonatal rotter, antar vi at teknikken gjelder rotte unger med noen modifikasjoner.
Utbruddet og maksimal uttrykk for virus bærer genuttrykk ta flere dager eller uker etter injeksjoner i hjernen14,15. I studien fant vi at AAV-eGFP-grobunn virus-mediert grobunn-loxP DNA rekombinasjon i neonatale striatal neurons skjedde så tidlig som 8 dager etter viral signaltransduksjon. Tidligere studier har rapportert at AAV-mediert grobunn-avhengige reporter aktivitet kan påvises i olfactory pære av nyfødte musen pups så tidlig som 3 dager etter bulk injeksjon AAVs15. Det er tenkelig at av tidlig innsettende AAV-mediert genetisk aktivitet er en fordel for å studere utviklingsmessige hendelser som kontinuerlig oppstår i postnatal hjernen.
Oppsummert neonatale stereotaxic teknikken som vi utviklet er ikke bare for betinget Slett gener i bestemte hjernen regioner, men det er også mottagelig å injisere farmakologiske reagenser og neuronal tracers til bestemte hjernen regioner i neonatal mus. Selv om vi bare gjorde microinjections i den nyfødte striatum studien, i prinsippet, kan våre stereotaxic neonatal hjernekirurgi brukes til målet spesifikke hjernens områder hvis koordinatene for bestemte regioner i neonatal hjernen er tilgjengelige. Gitt variasjon i størrelsen på neonatal musen hjernen med ulik genetisk bakgrunn på ulike stadier, er det viktig å bestemme empirisk presis koordinatene av de målrettede stedene av etterforskerne. Endelig kan stereotaxic microinjections av AAVs uttrykke genmodifiserte optogenetic3 og chemogenetic proteiner4 og neuronal aktiviteten indikatorer5 til bestemte hjernen regioner, en utforske rollen neuronal aktivitet på postnatal utvikling av hjernen oppløsning cellen og krets-spesifikk nivåer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av departementet for vitenskap og teknologi gir MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, det nasjonale helse-forskningsinstitutter gir NHRI-EX106-10429NI og i utvalgte områder Center forskningsprogram stipend fra Departementet for utdanning gjennom hjernen Research Center, National Yang-Ming University i Taiwan, og postdoktorstipend gir MOST106-2811-B-010-031 (S.-Y.C.), MOST105-2811-B-010-036 og MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton MICROLITER Syringe | Hamilton | 80300 | 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor |
| Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Micro Flow Rate Syringe Pump | Longer Precision Pump Co. | TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit) | |
| 25G syringe | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0.1% |
| Standard Stereotaxic Instruments | RWD Life Science | 68037 | Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor |
| Anti-FOXP2 antibody | Abcam | ab16046 | Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4,000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | ab65856 | Mouse monoclonal to RFP, 1:1,000 |
| BX63 microscope | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 confocal microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1x1014 (GC/ml) |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Labtorary | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | The Jackson Labtorary | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning cellgro | 21-030-CVR |
References
- Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).
- Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Knopfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).
- Tau, G. Z., Peterson, B. S. Normal development of brain circuits. Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).
- Mitchell, K. J. The genetics of neurodevelopmental disease. Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).
- Sahin, M., Sur, M. Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders. Science. 350 (6263), (2015).
- Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference. J. Vis. Exp. (77), e50600 (2013).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).
- Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. Jr A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo. Brain Res. 1307, 43-52 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c. Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).
- Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia. Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas. Front. Neural Circuit. 9, 72 (2015).
