Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

جراحة ستيريوتاكسيك للتلاعب بالجينات في خلايا أدمغة الفأر الولدان سترياتال

doi: 10.3791/57270 Published: July 10, 2018

Summary

يصف لنا على بروتوكول لجراحة ستيريوتاكسيك مع جهاز ثابت رئيس محلية صنع الكاشفات ميكروينجيكتينج في المخطط للعقول الماوس الأطفال حديثي الولادة. هذا الأسلوب يتيح التلاعب بالجينات في الخلايا العصبية في مناطق معينة من أدمغة الفأر حديثي الولادة.

Abstract

يتم التعبير عن العديد من الجينات في أدمغة الأجنة، وبعضهم يعبر عن استمرار في الدماغ بعد الولادة. لهذه الجينات، وأعرب عن إصرار أنها قد تعمل لتنظيم عملية التنمية و/أو الوظيفة الفسيولوجية في أدمغة الأطفال حديثي الولادة. للتحقيق في الوظائف العصبية الحيوية من جينات محددة في الدماغ، من الضروري إلغاء تنشيط الجينات في الدماغ. هنا، نحن تصف طريقة ستيريوتاكسيك بسيطة لإلغاء تنشيط التعبير الجيني في المخطط الفئران المحورة وراثيا في إطارات زمنية الولدان. كانت ميكروينجيكتيد الفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية في المخطط Ai14 مراسل جينات الفئران في يوم بعد الولادة (ف) 2 بجراحه الدماغ ستيريوتاكسيك. تم الكشف عن الجينات مراسل تدتوماتو في المخطط P14، مما يوحي نجاح لجنة المساواة العرقية-لوكسب يتوسط جزئ الحمض النووي في الخلايا سترياتال ترانسدوسيد إف. كذلك نحن التحقق من صحة هذا الأسلوب من ميكروينجيكتينج الفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية في الفئران P2Foxp2fl/فلوريدا . وسم مزدوجة للتجارة والنقل و Foxp2 أظهرت أن الخلايا إيجابية بروتينات فلورية خضراء تفتقر إلى إيمونوريكتيفيتي Foxp2 في المخطط P9، مما يوحي بفقدان البروتين Foxp2 في لجنة المساواة العرقية اجفب إف ترانسدوسيد سترياتال الخلايا. مجتمعة، هذه النتائج تبرهن حذف وراثية فعالة بالفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية ستيريوتاكسيكالي ميكروينجيكتيد في فئات معينة من السكان الخلايا العصبية في أدمغة الأطفال حديثي الولادة من الفئران المعدلة وراثيا فلوكسيد. وفي الختام، لدينا تقنية ستيريوتاكسيك يوفر منبرا سهلة وبسيطة للتلاعب بالجينات في أدمغة الفأر حديثي الولادة. هذا الأسلوب لا يمكن استخدامها فقط لحذف الجينات في مناطق معينة من أدمغة الأطفال حديثي الولادة، ولكن أيضا يمكن استخدامه لحقن العقاقير الدوائية، تتبع الخلايا العصبية، أوبتوجينيتيكس المعدلة وراثيا والبروتينات تشيموجينيتيكس، مؤشرات نشاط الخلايا العصبية و الكواشف الأخرى في المخطط للعقول الماوس الأطفال حديثي الولادة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الدراسات الحديثة لهيكل ووظيفة المخ عادة ما تتطلب التحوير الوراثي لجينات معينة في الخلايا العصبية. وقد تم إنشاؤها للتحقيق في وظائف جينات مختلفة، الفئران المحورة وراثيا تحمل الآليلات متحولة، بما في ذلك بشكل روتيني خروج المغلوب والمغلوب في الآليلات. جراحة المخ ستيريوتاكسيك للقوارض الكبار أسلوب قياسي لتسليم المخدرات وتتبع وفيروسات أخرى الكواشف محلياً إلى مناطق معينة من أدمغة القوارض1،2. تطبيق جراحة الدماغ ستيريوتاكسيك على الفئران المحورة وراثيا يسمح أحد للتلاعب وراثيا بوظيفة الجينات ونشاط الخلايا العصبية في فئات معينة من السكان الخلايا العصبية في الدماغ الماوس. التلاعب الخلية بنوع خاص يوفر نهج قوية فك الوظائف العصبية في مجمع الدوائر العصبية من المخ3،،من45.

تبدأ التنمية العصبية للجهاز العصبي في المراحل الجنينية المبكرة، والعمليات الإنمائية التي تستمر بعد الولادة حتى فترة الأحداث. ويشمل نضج الجهاز العصبي بعد الولادة الأسلاك متشابك دقيقة من الدوائر العصبية، هو أمر ضروري للوظائف الفسيولوجية والإدراكية ل الدماغ6. ولذلك، دراسة الأحداث التنموية التي تحدث في windows وقت حديثي الولادة مهم ليس فقط لفهم التنمية العصبية الطبيعية، ولكن كما يجوز تقديم رؤى في الآلية المرضية للنماء العصبي والاضطرابات العصبية7 ،8. على الرغم من أن أساليب جراحة المخ ستيريوتاكسيك للقوارض الكبار متاحة2،9، البروتوكولات القليلة المتاحة على شبكة الإنترنت لعملية جراحية في الدماغ ستيريوتاكسيك في الفئران حديثي الولادة10،11. في الواقع، ميكروينجيكشنز ستيريوتاكسيك من الكواشف في أدمغة الفأر المواليد الجراء صعبة، لأن رأس ألجرو الولدان هشة جداً لتكون ثابتة في الجهاز ستيريوتاكسيك القياسية. على الرغم من ذلك، يتم تطبيق عملية جراحية في الدماغ ستيريوتاكسيك على الفئران المعدلة وراثيا ممكنة للفئران حديثي الولادة12. وهنا يصف لنا طريقة بسيطة مع إعداد محلية صنع لإجراء عملية جراحية في الدماغ ستيريوتاكسيك في الجراء الماوس حديثي الولادة. علينا أن نظهر أن هذا الأسلوب يسمح أحد لحذف الجينات فلوكسيد مشروط ميكروينجيكتينج ريكومبيناسي إف-الإعراب عن "الحمض النووي لجنة المساواة العرقية" في المخطط لمراسل جينات الفئران والفئران المعدلة وراثيا فلوكسيد إفراجاً مشروطاً. هذا الأسلوب ينطبق أيضا على تسليم المواد الكاشفة في المخطط الولدان من الفئران البرية من نوع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

عليها البروتوكولات الحيوانية الموضحة هنا بالعناية بالحيوان ولجان جامعة يانغ مينغ الوطنية استخدام.

1. إعداد الحامل للمواليد الجراء في الجهاز ستيريوتاكسيك

  1. جعل علبة الرأس: قص الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل (طويلة 15 ملم) في الشكل الذي يناسب رأس الجراء الأطفال حديثي الولادة عن طريق إزالة 1/5 لجدار الأنبوبة.
  2. أن مربع تلميح ماصة مع الحجم الصحيح الذي يناسب مع قاعدة التمثال لجهاز ستيريوتاكسيك، وإزالة الغطاء العلوي. إلصاق درج الرأس بإعدادها في الخطوة 1، 1 ونسيج كاسيت تضمين على القاعدة علبة تلميح بمادة لاصقة ساخنة-ذوبان. ارتفاع كاسيت تضمين الأنسجة هو 7 مم، الذي يستخدم لدعم ألجرو في الرقبة والجسم في موقف ثابت الرأس.
  3. ضع الإعداد كلها في جهاز ستيريوتاكسيك قياسية.

2-إعداد 30 جرام الحقن بالإبر الفولاذ المقاوم للصدأ

  1. قبل تنظيف 30 إبر المحاقن ز التي نقع عليها في كلوروفورم لمدة 3 أيام.
  2. استخدام الملقط بعناية وبطء سحب الإبرة من مركزها البوليبروبيلين في غطاء كيميائية.
  3. أغسل الإبر مع الإيثانول المطلقة لمدة 20 دقيقة تليها يشطف الإيثانول 70% ل 3 × 10 دقيقة على شاكر 50 لفة في الدقيقة. واسمحوا الهواء الإبر الجافة، وتخزين الإبر تنظيفها في مربع نظيف في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى الاستخدام.

3-إعداد محول لأنابيب Microinjection

  1. قم بتوصيل المحاقن ميكروليتير إبرة حقن 30 جرام مع أنبوب البولي إثيلين PE10 (أنبوب PE10). إعداد محول أنابيب (أنابيب PE20) البولي إثيلين PE20 لسد إبرة الحقن والمحاقن ميكروليتير. استخدام المحول ضروري، لأن قطر الأنبوب PE10 أصغر بكثير من أن الإبرة للمحاقن ميكروليتير ز 26.
  2. إعداد الأنابيب للمحاقن ميكروليتير: الاتصال إبرة حقن 30 جرام تنظيفها مسبقاً مع 5 سم أنبوب PE20، وختم التقاطع مع الغراء الفورية. هذا محول الأنابيب قابلة لإعادة الاستخدام.
    ملاحظة: إذا كانت الإبرة لحقنه microinjection ز 30، إعداد (الخطوة 3.1) واستخدام هذا المحول (الخطوة 3، 3) ليس من الضروري.
  3. قم بتوصيل مهايئ الأنابيب (أعد الخطوة 3.1) مع حقنه ميكروليتير (10 ميليلتر).
  4. قم بتوصيل أحد طرفي أنبوب PE10 (لا تزيد عن 60 سم) على الإبرة 30 جرام من محول أنابيب PE20. جبل إبرة حقن ز 30 جديدة على الطرف الآخر من أنبوب PE10.

4-تحميل أنبوب Microinjection مع يعقم الماء المقطر وصبغ والفيروسات

  1. إزالة المكبس المحاقن ميكروليتير. استخدام المحاقن ز 25 لتحميل المحاقن ميكروليتير ولها أنبوب PE متصلة مع يعقم الماء المقطر لإزالة الهواء من الأنبوب.
  2. وضع المكبس مرة أخرى إلى المحاقن ميكروليتير، ودفع المكبس حتى 2 ميليلتر من بقايا الماء المقطر في البرميل. لا تدع حجم الماء المقطر أصبح أقل من 2 ميليلتر.
  3. جبل بعناية المحاقن ميكروليتير على ضخ حقنه معدل التدفق الجزئي.
  4. "الماصة؛" كميات صغيرة من صبغة 0.1% الأخضر سريع (أعد في المحلول الملحي 0.9% وتصفيتها مع 0.22 ميكرومتر التصفية) والسوائل الفيروس بقطعة من بارافيلم.
  5. سحب كمية صغيرة من الهواء لجعل فقاعة هواء مرئية على مفترق الطرق بين 30 جرام حقن إبرة وأنبوب PE10 متبوعاً بتحميل ميليلتر 0.7 الخضراء السريعة التي تمت تصفيتها في الأنبوب اختبار تدفق السوائل في الأنابيب microinjection.
  6. سحب آخر كمية صغيرة من الهواء لجعل فقاعة هواء ثاني متبوعاً بتحميل الفيروسات السوائل في الأنابيب microinjection.
  7. إرفاق وتأمين إبرة microinjection ز 30 في الذراع لجهاز ستيريوتاكسيك.

5-تخدير فئران حديثي الولادة بانخفاض درجة حرارة الجسم

  1. ألجرو في الأكمام قفاز مطاط وتزج أنه في الثلج المجروش حتى الرقبة لمدة 5 دقائق.
  2. قرصه القدمين ألجرو مع الملقط للتأكد من استجابة انسحاب لا من قدميه.
  3. وضع ألجرو الأكمام قفاز مطاط في علبة الرأس ووضع بعض الثلج المجروش حول الأكمام مطاط للحفاظ على البارد للتخدير انخفاض درجة حرارة الجسم.
  4. تطبيق مرهم البيطرية في عيون ألجرو لمنع جفاف بينما تحت التخدير إذا كان ذلك ممكناً.

6-microinjection

  1. إعداد عملية جراحية معقمة بمحو الصك ستيريوتاكسيك تماما مع الإيثانول 70%. تعقيم الأدوات الجراحية بغمر لهم في الإيثانول 70%.
  2. فرك رأسه ألجرو مع الإيثانول 70%. تحديد موقع لامدا معلما في الجمجمة وعلامة لامدا بقلم ماركر. تهدف نصيحة إبرة إلى لامدا، وتعيين الأمامي الخلفي (AP) واحداثيات الآنسي الجانبي (ML) كصفر.
  3. تحريك ذراع الحقن إلى الموقع المستهدف وفقا لإحداثيات س وص للموقع المستهدف. للمخطط يوم بعد الولادة (ف) 2 الجراء، الإحداثيات: وكالة اسوشييتد برس، مم +2.4 لياقته لامدا؛ مل، تيار الأفقي مم من خط الوسط؛ الظهري-البطني (DV)، مم و− من الجمجمة. وضع علامة على موضع الصبغة الخضراء سريعة في أنبوب PE10 بقلم.
  4. إسقاط إبرة حقن 30 غ ببطء لاختراق عن طريق الجلد والجمجمة ومن ثم إحضار تلميح إبرة حتى يتوقف على سطح الجمجمة. تعيين تنسيق DV كصفر.
  5. إسقاط إبرة حقن 30 غ ببطء حتى تصل إلى تنسيق DV من الموقع المستهدف. الانتظار لمدة 1 دقيقة للسماح حمة استئناف شكل عادي. قم بتشغيل برنامج microinjection (100 nL/دقيقة).
  6. تأكد من أن علامة الصبغة الخضراء سريعة تتحرك في أنبوب PE لضمان يتم حقن السائل فيروس في المخ.
  7. انتظر 1 دقيقة بعد انتهاء microinjection، وثم ببطء وتدريجيا إحضار الإبرة للارتفاع 1/2 من عمق العنف المنزلي خلال 30 ثانية. وبعد 30 ثانية، سحب الإبرة ببطء من الرأس ألجرو.
  8. كرر الخطوة 6، 2 إلى 6.7 حتى يتم إكمال ميكروينجيكشنز من جميع المواقع المستهدفة.

7-بعد الجراحة استرداد ألجرو

  1. الاحماء ألجرو لمدة 20 دقيقة في حاضنة 33 درجة مئوية. تحقق من استرداد ألجرو من انخفاض حرارة الجسم التخدير كل 5 دقائق حتى ألجرو قد استعاد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية.
  2. العودة ألجرو إلى السد بعد ألجرو هو تعافي تماما.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

للمجموعة الأولى من التجربة، ونحن ميكروينجيكتيد 200 nL فيروسات AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية، 1/10 إضعاف في الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو) التي تعبر عن ريكومبيناسي الحمض النووي Cre تنصهر مع التجارة والنقل في المخطط P2 من الفئران Ai14. الفئران Ai14 إكسبريس تدتوماتو مراسل الجينات عند الحذف بوساطة لجنة المساواة العرقية من كاسيت وقف يحف لوكسب (فلوكسيد) (الشكل 2 واو). كان حصاد P14 العقل المدبر ل immunostaining تدتوماتو والتجارة والنقل. ترانسدوسيد إف العديد من الخلايا بروتينات فلورية خضراء-الإيجابية كانت حاليا في جميع أنحاء المخطط (الشكل 2 أ، ج)، التي تشير إلى عدوى واسعة النطاق من الخلايا سترياتال بالفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية. ووجد أيضا تعبير واسعة مماثلة من تدتوماتو في المخطط (الشكل 2، ج). عند الفحص المجهري في تضخم عالية، وجدنا أن ما يقرب من جميع الخلايا striatal الحاملات للتجارة والنقل المشترك أعربت عن الجينات مراسل تدتوماتو (الشكل 2A'-ج'). وعلاوة على ذلك، تم الكشف عن إشارات تدتوماتو في يفترض أن إكسون في المحطات في pallidus جلوبس (الشكل 2D) والشبكي بارس الرمادية في الدماغ (الشكل 2E)، المناطق المستهدفة من العصبية الإسقاط سترياتونيجرال وسترياتوباليدال 13. هذه النتائج توحي نجاح لجنة المساواة العرقية-لوكسب يتوسط جزئ الحمض النووي الناجم عن إف بوساطة التعبير عن نشاط لجنة المساواة العرقية في الخلايا العصبية سترياتال حديثي الولادة.

للمجموعة الثانية من التجربة، ونحن ميكروينجيكتيد 50 nL فيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية في المخطط الفئران Foxp2fl/fl تحمل يحف لوكسب الآليلات Foxp2 في P2 (الشكل 3 أ-ج، و)، والتي تحصد في الدماغ في P9. لا Foxp2+؛ تم العثور على الخلايا المسماة مزدوجة بروتينات فلورية خضراء+ في المخطط، أي.، البروتين Foxp2 كان غائبا في التجارة والنقل-إيجابية الخلايا (الشكل 3A'-ج'). في تجارب التحكم، Foxp2+؛ بروتينات فلورية خضراء+ الخلايا المسماة مزدوجة كانت موجودة في المخطط الفئران Foxp2fl/fl مع إف-اجفب مكافحة الفيروسات (3D الشكل) وفي المخطط من متخالف Foxp2fl/+ الفئران مع إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية الفيروسات (3E الشكل). تشير هذه النتائج إلى أن الجين Foxp2 يتم حذف على وجه التحديد في الخلايا إف-اجفب-Cre ترانسدوسيد من المخطط الولدان.

مجتمعة نتائج إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية؛ Ai14 و إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية؛ Foxp2fl/fl الفئران، تقنية جراحة الدماغ الولدان ستيريوتاكسيك التي قمنا بتطويرها قابلة لشروط حذف الجينات في مناطق معينة من أدمغة الفأر حديثي الولادة.

Figure 1
رقم 1. جهاز ستيريوتاكسيك وحامل ثابت رئيس محلية الصنع للفئران حديثي الولادة. (أ) نظام حقن ستيريوتاكسيك يتكون من الأجهزة التالية: أولاً المحقن مضخة (المراقب المالي)؛ ثانيا-الحقن مضخة (وحدة محرك الأقراص)؛ ثالثا-ميكروليتير المحاقن (10 ميليلتر)؛ رابعا-PE20 الأنابيب محول؛ ف أنبوب PE10؛ سادسا-30 غ إبرة حقن؛ سابعا-ستيريوتاكسيك الجهاز؛ ثامنا-مربع نصائح ماصة تحويل منهاج الجراء حديثي الولادة؛ حادي عشر: سحق الجليد. (ب) ارتفاع الكاسيت تضمين الأنسجة حوالي 7 مم. يكون زر أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل حوالي 15 مم في الطول. (ج) تأمين رأس الماوس في حامل ثابت رئيس محلية الصنع. يشير السهم إلى أمداً معلما في رأس الفئران حديثي الولادة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. التعبير عن تدتوماتو في المخطط الفئران P14 Ai14 بعد وساطة إف-اجفب-Cre جزئ الحمض النووي Cre-لوكسب- وكانت الفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية ستيروتاكسيكالي حقن المخطط P2 من الفئران Ai14. وقد تم تحليل الدماغ في P14. (أ) العديد من بروتينات فلورية خضراء-إيجابية الخلايا موجودة في جميع أنحاء المخطط (Str). (ب) الخلايا تدتوماتو-إيجابية كثيرة موجودة أيضا في المخطط. (ج) إظهار الصور المدمجة ترجمة المشارك واسع النطاق للتجارة والنقل وتدتوماتو في المخطط. تظهر الصور [كنفوكل] المناطق محاصر في أ-ج في تضخم عالية في A '-ج'، على التوالي. شارك إكسبريس كافة الخلايا الحاملات للتجارة والنقل (الأخضر) تدتوماتو (أحمر) في المخطط. (د، ه) يتم الكشف عن الإشارات التي تدتوماتو في المناطق المستهدفة من الإسقاط سترياتال من الخلايا العصبية، بما في ذلك pallidus جلوبس (سباق الجائزة الكبرى؛ د) والشبكي بارس الرمادية في الدماغ (دائرة الاستخبارات الوطنية؛ ﻫ)- (و) رسومات تخطيطية من إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية، و Ai14 بنيات المحورة وراثيا. Ctx: قشرة؛ Sep: حاجز؛ هيب: الحصين؛ ميغا بايت: midbrain. شريط مقياس في أ (لألف إلى جيم)، 200 ميكرومتر؛ A '(ألف'-ج ')، 10 ميكرومتر؛ (د) (لدال وهاء)، 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. الحذف الشرطي جين Foxp2 في المخطط الولدان من إينجيسيونس إينتراسترياتال من الفيروسات إف-اجفب-Cre. أجريت الحقن إينتراسترياتال من الفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية في P2 Foxp2fl/فلوريدا (أ-ج ') و Foxp2fl/+الفئران (ه). وجرى تحليل العقل المدبر في P9. (أ-ج) بروتينات فلورية خضراء-إيجابية الخلايا (أ، ج، أخضر) تفتقر إلى إيمونوريكتيفيتي Foxp2 (ب، ج، أحمر) في المخطط الفئران Foxp2fl/fl مع الفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية. تظهر المناطق محاصر في أ-ج في تضخم عالية في A '-ج'، على التوالي. (د) الخلايا سترياتال إكسبرس المشارك بروتينات فلورية خضراء و Foxp2 موجودة في المخطط التي تم حقن مع إف-اجفب مكافحة الفيروسات. خلايا الحاملات للتجارة والنقل (ه) شارك إكسبريس Foxp2 (رؤوس) موجودة في المخطط من Foxp2fl/+ الفئران مع الفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية. (و) رسومات تخطيطية الفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية و Foxp2fl/fl الفئران المعدلة وراثيا. شريط مقياس في أ (لألف إلى جيم)، 200 ميكرومتر؛ A '(ألف'-ج '، دال وهاء)، 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في الدراسة الحالية، ونظهر أسلوب ستيريوتاكسيك بسيطة وموثوق بها لحقن الفيروسات إف في المخطط للعقول الماوس الأطفال حديثي الولادة. ونحن ميكروينجيكتيد الفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية في المخطط Ai14 مراسل الفئران في P2 وثم تحليل تعبير الجينات مراسل في P14. ووجدنا إف ترانسدوسيد الخلايا الحاملات للتجارة والنقل في جميع أنحاء المخطط على المستويات روستروكودال. وعلاوة على ذلك، شارك ما يقرب من جميع بروتينات فلورية خضراء-إيجابية الخلايا أعرب عن تدتوماتو مراسل الجينات في الخلايا سترياتال، مما يوحي جزئ الحمض النووي لوكسب لجنة المساواة العرقية ناجحة الناجمة عن إف بوساطة التعبير عن نشاط لجنة المساواة العرقية. لقد أكد فعالية هذا النهج ميكروينجيكشنز إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية في الفئران Foxp2fl/fl المخطط في P2. التسمية المزدوجة أظهرت أن الخلايا ترانسدوسيد آفس التجارة والنقل-إيجابية كثيرة تفتقر إلى إيمونوريكتيفيتي Foxp2 في المخطط P9، مما يوحي بحذف بنجاح شرطي جين Foxp2 في المخطط الولدان. وحدات تخزين آفس ميكروينجيكتيد ترتبط بحجم مناطق الدماغ المصابة. مع 200 nL حجم المحقون، تم العثور على خلايا الحاملات للتجارة والنقل على نطاق واسع في جميع أنحاء المخطط الولدان، وكما حضر بعض الخلايا إيجابية بروتينات فلورية خضراء متناثرة في قشرة المتاخمة المخطط. مع 50 nL حجم المحقون، الخلايا بروتينات فلورية خضراء-الإيجابية اقتصرت محلياً للمخطط الولدان. ولذلك، المعايرة أحجام AAVs حقن المهم لتوصيل الأمثل للسكان الخلايا العصبية في مناطق معينة من الدماغ. وعلاوة على ذلك، يتحدد معدل توصيل أيضا عيار إعداد الفيروسية. فمن المتصور أن يتحقق دقيقة استهداف أنواع الخلايا المحددة باستخدام الفئران المعدلة وراثيا مع المروجين مختلفة.

هناك العديد من النصائح الجراحية ل AAVs الحقن ناجحة لمناطق الدماغ المهتمة. أولاً، بسبب صغر حجم الجراء الماوس وصعوبة الحصول على موضع الماوس الرأس باليدين أثناء الجراحة، من الصعب إجراء عملية جراحية في الدماغ ستيريوتاكسيك في الفئران حديثي الولادة10. على الرغم من أن دراسة سابقة أثبتت جراحة ستيريوتاكسيك حديثي الولادة، ولكنه يتطلب شخصين لأداء microinjection أثناء الجراحة11. لقد تغلبنا على هذه المشاكل بوضع جهاز ثابت رئيس مصنوعة خصيصا بحزم يمكن تأمين رأس ألجرو أثناء عملية جراحية في الدماغ. كل الإجراءات التي يمكن أن يؤديها شخص واحد. وتتنوع أحجام المخ الفئران حديثي الولادة بسبب الخلفيات الوراثية المختلفة والعناية بآلام وسن الجراء. ميزة لدينا جهاز محلية الصنع هو أنه يسمح لتثبيت لطيف ولكن المضمون لرأس الماوس الولدان، هو أمر ضروري لإجراء عملية جراحية في الدماغ ستيريوتاكسيك عالية الدقة. ثانيا، نظراً لمرونة الجلد لينة ورقيقة الجدار للجمجمة، شق الجلد متبوعاً بالجمجمة الحفر في الرأس من الصعب على أداء في الجراء الولدان. للتغلب على هذه المشكلة، من الضروري جعل ثقب الجلد والجمجمة مع تلميح إبرة قبل تخفيض إبرة حقن في المنطقة المستهدفة الدماغ. ثالثا، من المهم أن تحقق تدفق صبغ مرئية في أنبوب PE للتأكد من microinjection في التقدم من خلال الحقن. إذا لم تتحرك الصبغة في الأنبوب PE، الجهود الواجب اتخاذها لإطلاق النار المتاعب المشاكل، بما في ذلك إمكانية تسرب للسائل في الأنبوب وانسداد الإبر. لاحظ أن هذا الأسلوب ينطبق على الجراء الولدان لامدا التي تكون مرئية من خلال الجلد قبل P5. لأقدم من P5 الجراء، قد تحتاج إلى شق في الجلد لكشف لامدا. نلاحظ أن الإضاءة الخفيفة إلى رؤساء الماوس P4 و P5 قد تساعد في تحديد موقع لامدا معلما. على الرغم من أننا لا بتنفيذ هذا الأسلوب لجراحة ستيريوتاكسيك في الفئران حديثي الولادة، ونحن نفترض أن الأسلوب الذي ينطبق على الفئران الجراء مع إدخال بعض التعديلات عليها.

بداية والتعبير القصوى من الفيروسات التي تحمل الجينات يستغرق عدة أيام أو أسابيع بعد الحقن إلى14،العقول15. في هذه الدراسة، وجدنا أن إف-اجفب-Cre الفيروسات بوساطة جزئ الحمض النووي لوكسب لجنة المساواة العرقية في الخلايا العصبية سترياتال حديثي الولادة حدث لها في أقرب وقت بعد توصيل الفيروسية 8 أيام. وقد ذكرت الدراسة السابقة أنه يمكن الكشف عن نشاط مراسل إف بوساطة لجنة المساواة العرقية تعتمد على لمبة شمي من الجراء الماوس الوليد أقرب 3 أيام بعد حقن الجزء الأكبر من آفس15. من المتصور أن بداية مبكرة للنشاط الجيني بوساطة إف هي ميزة لدراسة الأحداث التنموية التي تحدث باستمرار في العقول بعد الولادة.

وباختصار، هذه التقنية ستيريوتاكسيك حديثي الولادة التي قمنا بتطوير ليس فقط لشروط حذف الجينات في مناطق محددة من الدماغ، ولكن كما أنها قابلة لحقن الكواشف الدوائي وتتبع الخلايا العصبية في مناطق معينة من الدماغ في الفئران حديثي الولادة. لدينا جراحة الدماغ الولدان ستيريوتاكسيك وعلى الرغم من أننا فقط ميكروينجيكشنز في المخطط الولدان في هذه الدراسة، من حيث المبدأ، يمكن تطبيقها على مناطق مستهدفة محددة من الدماغ إذا كانت تتوفر إحداثيات مناطق معينة في أدمغة الأطفال حديثي الولادة. ونظرا للتغير في حجم أدمغة الفأر حديثي الولادة مع مختلف الخلفيات الوراثية في مراحل مختلفة، من الضروري أن تجريبيا تحديد الإحداثيات الدقيقة للمواقع المستهدفة من المحققين. وأخيراً، من ستيريوتاكسيك ميكروينجيكشنز من آفس تعبر عن أوبتوجينيتيك المعدلة وراثيا3 وتشيموجينيتيك البروتينات4 ونشاط الخلايا العصبية مؤشرات5 في مناطق محددة من الدماغ، واحد قد استكشاف دور الخلايا العصبية النشاط على تطوير الدماغ بدقة من المستويات المحددة لنوع ودارة خلية بعد الولادة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا العمل كان تدعمها وزارة العلوم والتكنولوجيا تمنح MOST104-2311-B-010-010-MY3، MOST106-2321-ب-010-012، ومعاهد البحوث الصحية الوطنية في منح المؤسسات الوطنية-EX106-10429NI، ومنحة "البرنامج مركز بحوث المناطق" الموصى بها من وزارة التربية من خلال مركز أبحاث الدماغ، جامعة يانغ مينغ الوطنية في تايوان، ، ومنح "زمالات ما بعد الدكتوراه" MOST106-2811-ب-010-031 (س-أ)، MOST105-2811-ب-010-036 و MOST106-2811-ب-010-030 (حاء-مجموعة).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30G PrecisionGlide Needle Becton Dickinson REF 305106
Chloroform JT Baker 9180-03
Hamilton MICROLITER Syringe Hamilton  80300 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor
Polyethylene tubing PE20 Becton Dickinson 427406
Polyethylene tubing PE10 Becton Dickinson 427401
Micro Flow Rate Syringe Pump Longer Precision Pump Co. TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit)
25G syringe Becton Dickinson REF 302105
Fast green Sigma-Aldrich F-7252 0.1%
Standard Stereotaxic Instruments RWD Life Science 68037 Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor
Anti-FOXP2 antibody Abcam ab16046 Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4,000
Anti-RFP antibody Abcam ab65856 Mouse monoclonal to RFP, 1:1,000
BX63 microscope Olympus BX63
LSM 880 confocal microscope Zeiss LSM 880
Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. 111-585-003
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 Penn Vector Core AV-9-PV1848 Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)
AAV9.chicken actin-eGFP AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan N/A 1x1014 (GC/ml)
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J The Jackson Labtorary  007914 Ai14
B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ The Jackson Labtorary  026259 Foxp2fl/fl
Dulbecco’s phosphate buffered saline Corning cellgro 21-030-CVR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).
  2. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1, (6), 3166-3173 (2006).
  3. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13, (4), 251-266 (2012).
  4. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89, (4), 683-694 (2016).
  5. Knopfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 13, (10), 687-700 (2012).
  6. Tau, G. Z., Peterson, B. S. Normal development of brain circuits. Neuropsychopharmacol. 35, (1), 147-168 (2010).
  7. Mitchell, K. J. The genetics of neurodevelopmental disease. Curr. Opin. Neurobiol. 21, (1), 197-203 (2011).
  8. Sahin, M., Sur, M. Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders. Science. 350, (6263), (2015).
  9. Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference. J. Vis. Exp. (77), e50600 (2013).
  10. Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neurosci. Bull. 31, (6), 685-696 (2015).
  11. Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. Jr A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo. Brain Res. 1307, 43-52 (2010).
  12. Chen, Y. C., et al. Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c. Nat. Neurosci. 19, (11), 1513-1522 (2016).
  13. Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia. Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).
  14. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, (18), 6171-6177 (2010).
  15. Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas. Front. Neural Circuit. 9, 72 (2015).
جراحة ستيريوتاكسيك للتلاعب بالجينات في خلايا أدمغة الفأر الولدان سترياتال
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, S. Y., Kuo, H. Y., Liu, F. C. Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (137), e57270, doi:10.3791/57270 (2018).More

Chen, S. Y., Kuo, H. Y., Liu, F. C. Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (137), e57270, doi:10.3791/57270 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter