Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Stereotaxic chirurgie voor genetische manipulatie van striatale cellen van neonatale muis hersenen

doi: 10.3791/57270 Published: July 10, 2018

Summary

We beschrijven een protocol van stereotaxic chirurgie met een zelfgemaakte hoofd-fixed device voor microinjecting reagentia in het striatum van neonatale muis hersenen. Deze techniek maakt het mogelijk specifieke genmanipulatie in neuronale cellen van bepaalde regio's van neonatale muis hersenen.

Abstract

Veel genen in embryonale hersenen zijn uitgedrukt, en sommigen van hen voortdurend worden uitgedrukt in de hersenen na de geboorte. Voor dergelijke aanhoudend uitgedrukte genen werken ze voor het regelen van de ontwikkelingstoxiciteit proces en/of de fysiologische functie in neonatale hersenen. Om te onderzoeken neurobiologische functies van specifieke genen in de hersenen, is het essentieel om de inactivering van genen in de hersenen. Hier beschrijven we een eenvoudige stereotaxic methode om de inactivering van genexpressie in het striatum van transgene muizen op neonatale tijd windows. AAV-eGFP-Cre virussen werden microinjected in het striatum van Ai14 reporter gene muizen op postnatale dag (P) 2 door stereotaxic hersenchirurgie. De tdTomato verslaggever genexpressie werd ontdekt in P14 striatum, hetgeen wijst op dat een succesvolle Cre-loxP gemedieerde DNA recombinatie bij AAV-getransduceerde striatale cellen. We verder gevalideerd deze techniek door AAV-eGFP-Cre virussen in P2Foxp2fl/fl muizen microinjecting. Dubbele etikettering van GFP en Foxp2 bleek dat GFP-positieve cellen ontbrak Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggereert het verlies van Foxp2-eiwit in de AAV-eGFP-Cre getransduceerde striatale cellen. Samen genomen, tonen deze resultaten een effectieve genetische schrapping door stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre virussen in specifieke neuronale populaties in de neonatale hersenen van floxed transgene muizen. Kortom, biedt onze stereotaxic techniek een gemakkelijk en eenvoudig platform voor genetische manipulatie in neonatale muis hersenen. De techniek kan niet alleen worden gebruikt om te verwijderen van de genen in bepaalde gebieden van neonatale hersenen, maar het kan ook worden gebruikt om te injecteren farmacologische drugs, neuronale verklikstoffen, genetisch gemodificeerde optogenetics en chemogenetics eiwitten, neuronale activiteit indicatoren en andere reagentia in het striatum van neonatale muis hersenen.

Introduction

Moderne studies van de structuur en functie van de hersenen vereisen meestal genetische manipulatie van specifieke genen in neuronale cellen. Om de sonde van de functies van verschillende genen, transgene muizen mutant allelen, met inbegrip van uitvoering zijn knock-out en knock-in allelen routinematig gegenereerd. Stereotaxic hersenoperatie voor volwassen knaagdieren is een standaardmethode om lokaal drugs, virussen, verklikstoffen en andere reagentia voor specifieke regio's voor knaagdieren hersenen1,2. De stereotaxic hersenoperatie toe te passen op transgene muizen toelaat een om genetisch te manipuleren de genfunctie en de neuronale activiteit in specifieke neuronale populaties van de hersenen van de muis. De manipulatie van de type-specifieke cel biedt een krachtige aanpak om te ontcijferen van neuronale functies in complexe neurale circuits van de hersenen3,4,5.

Neurale ontwikkeling van het zenuwstelsel begint bij vroege embryonale stadia en de ontwikkelings processen blijven na de geboorte tot de jonge periode. Postnatale rijping van het zenuwstelsel omvat de precieze synaptic bedrading van neurale circuits, die is van essentieel belang voor fysiologische en cognitieve functies van de hersenen-6. Daarom studeren developmental gebeurtenissen die in neonatale tijd windows plaatsvinden is niet alleen belangrijk voor het begrijpen van normale neurale ontwikkeling, maar het kan ook inzicht verwerven in de pathogenese van neurologische en neuropsychiatrische aandoeningen7 ,8. Hoewel de methoden van stereotaxic hersenoperatie voor volwassen knaagdieren direct beschikbaar2,9 zijn, zijn paar protocollen beschikbaar op het internet voor stereotaxic hersenoperatie in neonatale muizen10,11. In feite, zijn stereotaxic microinjections van reagentia in de hersenen van neonatale muis pups moeilijk, omdat het hoofd van neonatale pup is te kwetsbaar vast te stellen in de standaard stereotaxic apparaat. Niettemin, de toepassing van stereotaxic hersenoperatie op transgene muizen is haalbaar voor neonatale muizen12. Hier beschrijven we een eenvoudige methode met een zelfgemaakte setup uit te voeren stereotaxic hersenoperatie in pasgeboren muis pups. We laten zien dat deze techniek maakt het mogelijk om voorwaardelijk verwijderen floxed genen door AAV-uiten Cre DNA recombinase microinjecting in het striatum van reporter gene muizen en voorwaardelijk floxed transgene muizen. Deze techniek is ook van toepassing op het leveren van reagentia in de neonatale striatum van wild-type muizen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De dierlijke protocollen die hier beschreven zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik comités van nationale Yang-Ming Universiteit.

1. voorbereiding van de houder van de neonatale Pups in het Stereotaxic apparaat

  1. De hoofd lade maken: Snijd de onderkant van een centrifugebuis 1,5 mL (15 mm lang) in de vorm die het hoofd van neonatale pups door het verwijderen van 1/5 van de wand van de buis past.
  2. Neem een pipet tip doos met de juiste grootte die bij het voetstuk van stereotaxic apparaat past, en verwijder de bovenklep. Brengt het hoofd lade bereid in stap 1.1 en een cassette weefsel insluiten op de basis van tip dienblad met hot-smelten lijm. De hoogte van het weefsel inbedden cassette is 7 mm, die wordt gebruikt ter ondersteuning van de nek en het lichaam van de pup in de hoofd-vaste positie.
  3. Plaats de hele setup in een standaard stereotaxic apparaat.

2. voorbereiding van 30G injectie RVS naalden

  1. Vooraf schone 30 G spuit naalden door inweken hen in chloroform voor 3 dagen.
  2. Gebruik pincet om zorgvuldig en langzaam Trek de naald uit haar polypropyleen hub in een chemische kap.
  3. Wassen van de naalden met absolute ethanol gedurende 20 minuten, gevolgd door 70% ethanol gespoeld voor 3 × 10 min op een shaker 50 rpm. Laat de naalden lucht droog, en de schone naalden Bewaar in een schone vak bij kamertemperatuur (RT) tot gebruik.

3. een Adapter voorbereiden door Microinjection Tubing

  1. De spuit microliter verbinden met een naald 30G injectie met een PE10 polyethyleen buis (PE10 buis). Voorbereiden op een PE20 polyethyleen buis (PE20 buis) adapter overbruggen de injectie naald en de spuit microliter. Het gebruik van de adapter is nodig, omdat de diameter van de buis van de PE10 veel kleiner dan die van de naald van de spuit 26G microliter is.
  2. De buis voor de microliter spuit bereiden: Sluit de vooraf gereinigd 30 G injectie naald met 5 cm van PE20 buis, en verzegel het kruispunt met instant lijm. Deze buis-adapter is herbruikbaar.
    Opmerking: Als de naald van microinjection spuit is 30G, de voorbereiding (stap 3.1) en het gebruik (stap 3.3) voor deze adapter is niet nodig.
  3. Sluit de adapter van de buis (bereid in stap 3.1) met een microliter spuit (10 µL).
  4. Sluit het ene uiteinde van PE10 buis (langer dan 60 cm) op de naald 30G van de PE20 slang adapter. Monteer een nieuwe 30G injectie naald op het andere uiteinde van de buis van de PE10.

4. Laad de Microinjection buis met gesteriliseerde met autoclaaf gedestilleerd Water, kleurstof en virussen

  1. Verwijder de plunjer van de injectiespuit microliter. Gebruik een 25G spuit te laden de microliter spuit en haar verbonden PE buis met gesteriliseerde met autoclaaf gedestilleerd water te verwijderen van de lucht uit de slang.
  2. Plaats de zuiger terug naar de microliter spuit, en duw de plunjer tot 2 µL van gedistilleerd water in het vat blijft. Laat niet de hoeveelheid gedestilleerd water lager dan 2 µL worden.
  3. Mount zorgvuldig de microliter spuit op de micro stroom tarief-spuitpomp.
  4. Pipetteer van kleine hoeveelheden van 0,1% snel groene kleurstof (bereid in een zoutoplossing 0,9% en gefilterd met 0,22 µm filter) en het virus vloeistoffen op een stuk parafilm.
  5. Een kleine hoeveelheid lucht een luchtbel zichtbaar maken op de kruising tussen de 30G injectie naald en PE10 buis gevolgd door het laden van 0,7 µL van gefilterde snel groen in de buis om te testen de stroom van vloeistoffen in de buizen van microinjection trekken.
  6. Een andere kleine hoeveelheid lucht om een tweede luchtbel gevolgd door het laden van de virus vloeistoffen in de buizen van microinjection trekken.
  7. Hechten en beveiligen van de 30G microinjection naald aan de tak van stereotaxic apparaat.

5. de verdoving van neonatale muizen door onderkoeling

  1. Plaats de pup in een latex handschoen hoes en dompel het in crushed ijs tot de nek voor 5 min.
  2. Knijp de pup de voeten met een tang om ervoor te zorgen dat geen reactie van de terugtrekking van zijn voeten.
  3. Plaats van de pup met latex handschoen mouw in het Dienblad van het hoofd en zet sommige crushed ijs rond de latex mouw te houden koude voor onderkoeling anesthesie.
  4. Dierenarts zalf toepassen op pup van ogen om indien mogelijk te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.

6. microinjection

  1. Steriele chirurgie voor te bereiden door af te vegen de stereotaxic instrument grondig met 70% ethanol. Het chirurgische instrument steriliseren door ze onder te dompelen in 70% ethanol.
  2. Schrobben van de pup hoofd met 70% ethanol. Zoek de landmark lambda op de schedel en de lambda markeren met een viltstift. Doel van de tip van de naald om de lambda, en bepalen de anterior-posterior (AP) en de mediale-en laterale (ML) coördinaten nul.
  3. Verplaats de injectie arm naar de doelsite volgens de X- en Y-coördinaten van de doelsite. Voor het striatum van postnatale dag (P) 2 pups, de coördinaten zijn: AP, +2.4 mm anterior to de lambda; ML, ±1.0 mm lateraal van de middellijn; dorsal-ventrale (DV), −1.7 mm van de schedel. Markeer de positie van snel groene kleurstof in PE10 buis met een pen.
  4. Neerhalen van de 30G injectie naald langzaam te dringen via de huid en de schedel, en dan breng omhoog de naald tip totdat het stopt bij het oppervlak van de schedel. De DV-coördinaat ingesteld als nul.
  5. Omlaag brengen de 30G injectie naald langzaam totdat zij de DV-coördinaat van de doelsite tot. Wacht 1 minuut om het parenchym hervatten van de normale vorm. Voer het programma van microinjection (100 nL/min).
  6. Zorg ervoor dat het merk van snel groene kleurstof zich beweegt in de PE-buis om ervoor te zorgen dat de virus vloeistof wordt geïnjecteerd in de hersenen.
  7. 1 min wachten na de beëindiging van de microinjection, en dan langzaam en geleidelijk breng omhoog de naald tot 1/2 hoogte van DV diepte binnen 30 s. Na 30 s, langzaam het terugtrekken van de naald uit de pup het hoofd.
  8. Herhaal stap 6.2 tot en met 6.7 totdat de microinjections van alle gerichte sites zijn voltooid.

7. post-chirurgisch herstel van de Pup

  1. Opwarmen van de pup voor 20 min in een incubator 33 ° C. Controleer de terugwinning van de pup uit hypothermie verdoving elke 5 minuten totdat de pup heeft herwonnen voldoende bewustzijn te handhaven sternale ligcomfort.
  2. De pup terug terug naar de dam, nadat de pup volledig is hersteld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voor de eerste reeks van experiment, microinjected wij 200 nL van AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 virussen (AAV-eGFP-Cre, 1/10 verdunning in de Dulbecco fosfaatgebufferde zoutoplossing) die uitdrukking geven aan de Cre DNA recombinase gesmolten met GFP in P2 striatum van Ai14 muizen. De muizen Ai14 express tdTomato verslaggever gen op Cre-gemedieerde schrapping van loxP-geflankeerd (floxed) STOP cassette (figuur 2F). De hersenen werden voor immunokleuring van GFP en tdTomato P14 geoogst. Getransduceerde veel AAV GFP-positieve cellen waren aanwezig in het striatum (figuur 2A, C), die aangeeft een uitgebreide infectie van striatale cellen door AAV-eGFP-Cre virussen. Soortgelijke uitgebreide uitdrukking van tdTomato werd ook gevonden in het striatum (figuur 2B, C). Bij microscopisch onderzoek bij hoge vergroting, vonden we dat bijna alle GFP-positieve striatale cellen samen het tdTomato verslaggever gen uitgedrukt (figuur 2A'-C'). Bovendien, tdTomato signalen werden ontdekt in vermoedelijk axon terminals in de globus pallidus (figuur 2D) en de substantia nigra pars reticulata (figuur 2E), de doelregio's van striatonigral en striatopallidal projectie neuronen 13. deze resultaten suggereren een succesvolle Cre-loxP gemedieerde DNA recombinatie geïnduceerd door AAV-gemedieerde uitdrukking van Cre activiteit in neonatale striatale neuronen.

Voor de tweede reeks van experiment, microinjected we 50 nL van AAV-eGFP-Cre virussen in het striatum van Foxp2fl/fl muizen uitvoering loxP-geflankeerd Foxp2 -allel op P2 (figuur 3A- C, F), en geoogst van de hersenen op P9. Geen Foxp2+; GFP+ dubbel-geëtiketteerden cellen werden gevonden in het striatum, dwz., Foxp2-eiwit afwezig was in GFP-positieve cellen (figuur 3A'-C'). In control experimenten, Foxp2+; GFP+ dubbel-geëtiketteerden cellen waren aanwezig in het striatum van Foxp2fl/fl muizen met AAV-eGFP controle virussen (figuur 3D) en in het striatum van heterozygoot Foxp2fl / + muizen met AAV-eGFP-Cre virussen (figuur 3E). Deze resultaten wijzen erop dat het Foxp2 -gen specifiek is geschrapt in de AAV-eGFP-Cre getransduceerde cellen van neonatale striatum.

Tezamen met de resultaten van AAV-eGFP-Cre; Ai14 en AAV-eGFP-Cre; Foxp2fl/fl muizen, de techniek van stereotaxic neonatale hersenoperatie die we ontwikkeld is vatbaar voor voorwaardelijk verwijderen genen in bepaalde gebieden van de hersenen van de neonatale muis.

Figure 1
Figuur 1. Stereotaxic apparatuur en zelfgemaakte hoofd-vaste houder voor neonatale muizen. (A) het stereotaxic injectiesysteem bestaat uit de volgende apparaten: i.-spuitpomp (controller); II.-spuitpomp (aandrijving); III. microliter spuit (10 µL); IV. PE20 slang adapter; v. PE10 buis; VI. 30G injectie naald; VII. stereotaxic toestellen; VIII. een pipet tips-vak geconverteerd platform voor neonatale pups; XI: gemalen ijs. (B) de hoogte van het weefsel inbedden cassette is ongeveer 7 mm. De knop van de centrifugebuis 1,5 mL is ongeveer 15 mm lang. (C) het hoofd van de muis is beveiligd in de zelfgemaakte hoofd-vaste houder. De pijl geeft de lambda landmark in het hoofd van neonatale muizen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Uitdrukking van tdTomato in het striatum van P14 Ai14 muizen nadat AAV-eGFP-Cre Cre-loxP DNA recombinatie gemedieerde. AAV-eGFP-Cre virussen werden sterotaxically geïnjecteerd in P2 striatum van Ai14 muizen. De hersenen werd geanalyseerd op P14. (A) veel GFP-positieve cellen zijn aanwezig in het striatum (Str). (B) veel tdTomato-positieve cellen zijn ook aanwezig in het striatum. (C) de samengevoegde afbeeldingen tonen een uitgebreide co lokalisatie van GFP en tdTomato in het striatum. Confocale beelden van de boxed regio's in de A-C worden getoond bij hoge vergroting in A'-C', respectievelijk. Alle GFP-positieve cellen (groen) express co tdTomato (rood) in het striatum. (D, E) De tdTomato-signalen worden gedetecteerd in de doelregio's van striatale projectie neuronen, met inbegrip van de globus pallidus (GP; D) en de substantia nigra pars reticulata (SNr; E). (F) schematische tekeningen van AAV-eGFP-Cre en Ai14 transgene constructies. CTX: cortex; Sep: septum; Hipp: De Hippocampus; MB: veroorzaakt. Schaal bar in A (voor A-C), 200 µm; A' (voor A'-C'), 10 µm; D (voor D en E), 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. Voorwaardelijke schrapping van het Foxp2 -gen in de neonatale striatum door intrastriatal injecions van AAV-eGFP-Cre virussen. Intrastriatal injecties van AAV-eGFP-Cre virussen werden uitgevoerd in P2 Foxp2fl/fl (A-C') en Foxp2fl / +(E) muizen. De hersenen werden geanalyseerd op P9. (A-C) GFP-positieve cellen (A, C, groene) ontbreken Foxp2-immunoreactivity (B, C, rode) in het striatum van Foxp2fl/fl muizen met AAV-eGFP-Cre virussen. De vakken regio's in de A-C worden getoond bij hoge vergroting in A'-C', respectievelijk. (D) striatale cellen Co express GFP en Foxp2 in het striatum die werd ingespoten met AAV-eGFP controle virussen aanwezig zijn. (E) GFP-positieve cellen samen express Foxp2 (pijlpunten) zijn aanwezig in het striatum van Foxp2fl / + muizen met AAV-eGFP-Cre virussen. (F) schematische tekeningen van AAV-eGFP-Cre virus en Foxp2fl/fl transgene muizen. Schaal bar in A (voor A-C), 200 µm; A' (voor A'-C', D en E), van 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In de huidige studie, we laten zien een eenvoudige en betrouwbare stereotaxic methode voor het injecteren van AAV virussen in het striatum van neonatale muis hersenen. Wij microinjected AAV-eGFP-Cre virussen in het striatum van Ai14 verslaggever muizen op P2 en vervolgens de verslaggever genexpressie bij P14 geanalyseerd. We vonden getransduceerde AAV GFP-positieve cellen in de hele het striatum op rostrocaudal niveau. Bovendien, bijna alle GFP-positieve cellen uitgedrukt samen het tdTomato verslaggever gen in striatale cellen, hetgeen wijst op een succesvolle Cre-loxP DNA-recombinatie geïnduceerd door AAV-gemedieerde uitdrukking van Cre activiteit. We verder bevestigd de werkzaamheid van deze aanpak door microinjections van AAV-eGFP-Cre in het striatum Foxp2fl/fl muizen op P2. Dubbele etikettering, bleek dat veel AAVs-getransduceerde GFP-positieve cellen ontbrak Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggereren een succesvol voorwaardelijke schrapping van het Foxp2 -gen in neonatale striatum. De hoeveelheid microinjected AAVs zijn gecorreleerd met de grootte van de besmette hersengebieden. Met 200 nL van het geïnjecteerde volume, GFP-positieve cellen uitgebreid werden gevonden in de neonatale striatum, en enkele verspreide GFP-positieve cellen waren ook aanwezig in de cortex grenzend aan het striatum. Met 50 nL van het geïnjecteerde volume, GFP-positieve cellen werden lokaal beperkt tot de neonatale striatum. Daarom is het belangrijk voor optimale transductie van neuronale populaties in specifieke hersengebieden titrating van de hoeveelheid geïnjecteerd AAVs. Bovendien, de signaaltransductie wordt ook bepaald door de titer van virale voorbereiding. Het is denkbaar dat nauwkeurige targeting specifieke celtypes kunnen worden bereikt door het gebruik van transgene muizen met verschillende initiatiefnemers.

Er zijn verschillende chirurgische tips voor succesvolle injecterende AAVs aan de betrokken hersengebieden. Ten eerste vanwege de geringe omvang van muis pups en de moeilijkheid bij het veiligstellen van de positie van het hoofd van de muis met handen tijdens de operatie, is het moeilijk uit te voeren stereotaxic hersenoperatie in neonatale muizen10. Hoewel een eerdere studie heeft aangetoond neonatale stereotaxic chirurgie, maar het vereist twee mensen voor het uitvoeren van de microinjection tijdens de operatie11. We hebben deze problemen overwinnen door de ontwikkeling van een op maat gemaakte hoofd-vaste apparaat dat stevig het hoofd van de pup tijdens hersenoperatie kunt beveiligen. De hele procedures kunnen worden uitgevoerd door één persoon. De grootte van de hersenen van neonatale muizen zijn gevarieerd als gevolg van verschillende genetische achtergronden, moederlijke zorg en de leeftijden van de pups. Een voordeel van onze zelfgemaakte apparaat is dat het mogelijk een zachte maar beveiligde fixatie van neonatale muis hoofd, die essentieel is maakt voor het uitvoeren van hoge precisie stereotaxic hersenchirurgie. Ten tweede, als gevolg van de elasticiteit van de zachte huid en de dunne wand van schedel, huid incisie gevolgd door schedel boren in het hoofd is moeilijk uit te voeren in neonatale pups. Om dit probleem te verhelpen, is het noodzakelijk om een lekke band van de huid en de schedel met een naald tip vóór het verlagen van de naald van de injectie naar de regio gerichte hersenen. Ten derde, is het belangrijk om te controleren van de stroom van zichtbare kleurstof in de PE-buis om ervoor te zorgen dat de microinjection is bij progressie tijdens de injectie. Als de kleurstof niet in de PE-buis overgaat, inspanningen moeten worden genomen om problemen te schieten de problemen, met inbegrip van een mogelijke lekkage van vloeistof in de buis en verstopt naalden. Let op dat deze methode is van toepassing op de neonatale pups waarvan lambda zijn zichtbaar via de huid vóór P5. Voor pups ouder dan P5 wellicht het een incisie in de huid om de lambda bloot te stellen. Merk op dat lichte verlichting op P4 en P5 muis hoofden kan helpen bij het vinden van de landmark lambda. Hoewel we hebben niet deze techniek van stereotaxic chirurgie uitgevoerd in neonatale ratten, wij gaan ervan uit dat de techniek is van toepassing op rat pups met enkele wijzigingen.

Het ontstaan en de maximale expressie van virussen uitvoering van genexpressie nemen meerdere dagen of weken na injecties in de hersenen14,15. In de huidige studie vonden we dat AAV-eGFP-Cre virussen-gemedieerde Cre-loxP DNA recombinatie bij neonatale striatale neuronen zo spoedig 8 dagen na virale transductie is opgetreden. De vorige studie heeft gemeld dat AAV-gemedieerde Cre-afhankelijke verslaggever activiteit kan worden opgespoord in de bulbus olfactorius van pasgeboren muis pups zo spoedig 3 dagen na de injectie van de bulk van de AAVs15. Het is denkbaar dat de vroege begin van AAV-gemedieerde genetische activiteit een voordeel is voor de studie van ontwikkelingsstoornissen gebeurtenissen die voortdurend in de postnatale hersenen plaatsvinden.

Kortom, de neonatale stereotaxic techniek die we ontwikkeld is niet alleen voor voorwaardelijk verwijderen genen in specifieke hersengebieden, maar het is ook vatbaar voor het injecteren van farmacologische reagentia en neuronale verklikstoffen aan specifieke hersengebieden in neonatale muizen. Hoewel we alleen microinjections in de neonatale striatum in de huidige studie, in principe gemaakt, kan onze stereotaxic neonatale hersenoperatie worden toegepast op doel specifieke hersengebieden als de coördinaten van bepaalde regio's in neonatale hersenen beschikbaar zijn. Gezien de variabiliteit in de grootte van neonatale muis hersenen met verschillende genetische achtergronden in verschillende stadia, is het essentieel de precieze coördinaten van de gerichte sites empirisch te bepalen door de onderzoekers. Tot slot kan een door stereotaxic microinjections van AAVs genetisch gemodificeerde optogenetic3 en chemogenetic eiwitten4 en neuronale activiteit indicatoren5 in specifieke hersengebieden uitdrukken, de rol van neuronale verkennen activiteit op de postnatale ontwikkeling van de hersenen bij de resolutie van cel - en circuit-systeemeigen niveaus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door het ministerie van wetenschap en technologie verleent MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, de nationale instituten van gezondheid onderzoek subsidie NHRI-EX106-10429NI, en de aanbevolen gebieden Research Center Program grant van het ministerie van onderwijs door Brain Research Center, National Yang-Ming University in Taiwan, en de postdoctorale Fellowship verleent MOST106-2811-B-010-031 (S.-Y.C.), MOST105-2811-B-010-036 en MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30G PrecisionGlide Needle Becton Dickinson REF 305106
Chloroform JT Baker 9180-03
Hamilton MICROLITER Syringe Hamilton  80300 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor
Polyethylene tubing PE20 Becton Dickinson 427406
Polyethylene tubing PE10 Becton Dickinson 427401
Micro Flow Rate Syringe Pump Longer Precision Pump Co. TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit)
25G syringe Becton Dickinson REF 302105
Fast green Sigma-Aldrich F-7252 0.1%
Standard Stereotaxic Instruments RWD Life Science 68037 Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor
Anti-FOXP2 antibody Abcam ab16046 Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4,000
Anti-RFP antibody Abcam ab65856 Mouse monoclonal to RFP, 1:1,000
BX63 microscope Olympus BX63
LSM 880 confocal microscope Zeiss LSM 880
Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. 111-585-003
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 Penn Vector Core AV-9-PV1848 Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)
AAV9.chicken actin-eGFP AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan N/A 1x1014 (GC/ml)
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J The Jackson Labtorary  007914 Ai14
B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ The Jackson Labtorary  026259 Foxp2fl/fl
Dulbecco’s phosphate buffered saline Corning cellgro 21-030-CVR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).
  2. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1, (6), 3166-3173 (2006).
  3. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13, (4), 251-266 (2012).
  4. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89, (4), 683-694 (2016).
  5. Knopfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 13, (10), 687-700 (2012).
  6. Tau, G. Z., Peterson, B. S. Normal development of brain circuits. Neuropsychopharmacol. 35, (1), 147-168 (2010).
  7. Mitchell, K. J. The genetics of neurodevelopmental disease. Curr. Opin. Neurobiol. 21, (1), 197-203 (2011).
  8. Sahin, M., Sur, M. Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders. Science. 350, (6263), (2015).
  9. Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference. J. Vis. Exp. (77), e50600 (2013).
  10. Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neurosci. Bull. 31, (6), 685-696 (2015).
  11. Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. Jr A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo. Brain Res. 1307, 43-52 (2010).
  12. Chen, Y. C., et al. Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c. Nat. Neurosci. 19, (11), 1513-1522 (2016).
  13. Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia. Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).
  14. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, (18), 6171-6177 (2010).
  15. Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas. Front. Neural Circuit. 9, 72 (2015).
Stereotaxic chirurgie voor genetische manipulatie van striatale cellen van neonatale muis hersenen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, S. Y., Kuo, H. Y., Liu, F. C. Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (137), e57270, doi:10.3791/57270 (2018).More

Chen, S. Y., Kuo, H. Y., Liu, F. C. Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (137), e57270, doi:10.3791/57270 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter