Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Chirurgia stereotassica per la manipolazione genetica in cellule striatali di cervelli di topo neonatale

doi: 10.3791/57270 Published: July 10, 2018

Summary

Descriviamo un protocollo di chirurgia stereotassica con un dispositivo fisso testa fatti in casa per microinjecting reagenti nello striato del cervello neonatale del mouse. Questa tecnica permette la manipolazione genetica in cellule neuronali di specifiche regioni del cervello di topo neonatale.

Abstract

Molti geni sono espressi nel cervello embrionale, e alcuni di loro sono continuamente espresso nel cervello dopo la nascita. Per tali geni espressi in modo persistente, possono funzionare per regolare il processo di sviluppo e/o funzione fisiologica nel cervello neonatale. Per indagare le funzioni neurobiologiche di specifici geni nel cervello, è essenziale che inattivano geni nel cervello. Qui, descriviamo un semplice metodo stereotassica per inattivare l'espressione genica nel corpo striato di topi transgenici alle finestre temporali neonatale. AAV-eGFP-Cre virus erano microiniettati nello striato di topi Ai14 reporter gene al giorno postnatale (P) 2 di chirurgia stereotassica cerebrale. L'espressione di gene reporter tdTomato è stata rilevata nello striatum P14, suggerendo che un successo Cre-loxP mediato ricombinazione del DNA in cellule trasdotte AAV striatali. Abbiamo validato ulteriormente questa tecnica da microinjecting virus AAV-eGFP-Cre nei topi P2Foxp2fl/fl . Doppia etichettatura di GFP e Foxp2 ha mostrato che le cellule GFP-positive mancavano immunoreactivity Foxp2 nello striatum P9, suggerendo la perdita della proteina Foxp2 in cellule striatali AAV-eGFP-Cre trasformata. Presi insieme, questi risultati dimostrano un'efficace eliminazione genetica da stereotassicamente iniettati virus AAV-eGFP-Cre in specifiche popolazioni neuronali nel cervello neonatale di topi transgenici floxed. In conclusione, la nostra tecnica stereotassica fornisce una piattaforma facile e semplice per manipolazione genetica in cervelli di topo neonatale. La tecnica non può essere utilizzata solo per eliminare geni in regioni specifiche del cervello neonatale, ma può essere utilizzato anche per iniettare droghe farmacologiche, traccianti neuronali, geneticamente optogenetica e proteine chemogenetics, indicatori di attività neuronale e altri reagenti nello striato del cervello neonatale del mouse.

Introduction

Moderni studi sulla struttura e funzione del cervello di solito richiedono manipolazione genetica di specifici geni nelle cellule neuronali. Per sondare le funzioni dei geni differenti, topi transgenici portatori di alleli mutanti, tra cui knockout e knock-in alleli sono stati generati regolarmente. Chirurgia stereotassica cerebrale per roditori adulti è un metodo standard per fornire localmente farmaci, virus, traccianti e altri reagenti a specifiche regioni del cervello del roditore1,2. Applicando la chirurgia stereotassica cervello di topi transgenici permette di manipolare geneticamente la funzione del gene e l'attività neuronale in specifiche popolazioni neuronali del cervello del mouse. La manipolazione di specifici del tipo di cella fornisce un approccio potente per decifrare funzioni neuronali nei complessi circuiti neurali del cervello3,4,5.

Sviluppo neurale del sistema nervoso comincia alle prime fasi embrionali, e continuano i processi di sviluppo dopo la nascita fino al periodo giovanile. Postnatale maturazione del sistema nervoso include il cablaggio sinaptico preciso dei circuiti neurali, che è essenziale per le funzioni fisiologiche e cognitive del cervello6. Pertanto, è importante non solo per comprendere lo sviluppo neurale normale studiare eventi inerenti allo sviluppo che si verificano in finestre temporali neonatale, ma può anche fornire comprensioni nella patogenesi di neurodevelopmental ed i disordini neuropsichiatrici7 ,8. Sebbene i metodi di chirurgia stereotassica cerebrale per roditori adulti sono prontamente disponibili2,9, alcuni protocolli sono disponibili su internet per chirurgia stereotassica cerebrale in topi neonatali10,11. Infatti, microiniezioni stereotassiche dei reagenti nei cervelli dei cuccioli del mouse neonatale sono difficili, perché la testa di pup neonatale è troppo fragile per essere fissato nell'apparato stereotassica standard. Tuttavia, l'applicazione della chirurgia stereotassica cerebrale di topi transgenici è fattibile per topi neonatali12. Qui, descriviamo un metodo semplice con un setup fatti in casa per eseguire chirurgia stereotassica cerebrale nei cuccioli di neonato mouse. Dimostriamo che questa tecnica permette di eliminare condizionalmente floxed geni di microinjecting ricombinasi AAV-esprimendo Cre DNA nello striato di topi gene reporter e condizionalmente floxed topi transgenici. Questa tecnica è anche applicabile per fornire reagenti nello striato neonatale di topi wild-type.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I protocolli degli animali descritti qui sono stati approvati dalla cura degli animali e uso comitati della National Yang-Ming University.

1. preparazione del supporto per cuccioli neonatali nell'apparato stereotassica

  1. Rendere il vassoio testa: tagliare il fondo di una provetta da centrifuga da 1,5 mL (15 mm di lunghezza) nella forma che si adatta alla testa dei cuccioli neonatale rimuovendo 1/5 della parete del tubo.
  2. Una casella di punta della pipetta con la giusta dimensione che si adatta con il piedistallo dell'apparato stereotassiche e rimuovere il coperchio superiore. Apporre il vassoio testa preparato nel passaggio 1.1 e una cassetta di incorporamento di tessuto sulla base del vassoio di punta con adesivo hot-fusione. L'altezza della cassetta incorporamento del tessuto è di 7 mm, che viene utilizzato per supportare il pup collo e corpo in posizione di testa-fisso.
  3. Posto l'intero setup apparecchiature stereotassiche.

2. preparazione di 30g iniezione aghi in acciaio inox

  1. Aghi di siringhe 30g prepulizia immergendo in cloroformio per 3 giorni.
  2. Utilizzare pinze per lentamente e con cautela estrarre l'ago dal suo hub in polipropilene in una cappa chimica.
  3. Lavare gli aghi con etanolo assoluto per 20 min seguita da risciacqui di etanolo 70% per 3 × 10 minuti su un agitatore a 50 giri/min. Lasciare che l'aria di aghi asciugare e conservare gli aghi puliti in una scatola pulita a temperatura ambiente (TA) fino all'utilizzo.

3. preparare un adattatore per tubo rame Microinjection

  1. Collegare la siringa microliter di un ago per iniezione 30G con un tubo di polietilene PE10 (PE10 tubo). Preparare un adattatore per tubo (tubo PE20) polietilene PE20 per colmare l'inserimento dell'ago e la siringa di microliter. L'uso dell'adattatore è necessario, perché il diametro del tubo PE10 è molto più piccolo di quello dell'ago della siringa microliter 26G.
  2. Preparare la tubatura per microliter siringa: collegare l'ago per iniezione pre-pulito 30 G con 5 cm di tubo PE20 e sigillare la giunzione con colla istantanea. Questo adattatore della tubazione è riutilizzabile.
    Nota: Se l'ago della siringa di microiniezione è 30G, la preparazione (fase 3.1) e l'utilizzo (punto 3.3) di questo adattatore non è necessario.
  3. Collegare l'adattatore del tubo (preparata al punto 3.1) con una siringa di microlitro (10 µ l).
  4. Collegare un'estremità del tubo PE10 (non più di 60 cm) sull'ago 30g dell'adattatore tubo PE20. Montare un nuovo ago per iniezione 30G sull'altra estremità del tubo PE10.

4. caricare il tubo di microiniezione con acqua distillata in autoclave, tintura e virus

  1. Togliere lo stantuffo della siringa microliter. Utilizzare una siringa di 25G per caricare la siringa microliter e il suo tubo di PE connesso con acqua distillata in autoclave per eliminare l'aria dal tubo.
  2. Posizionare il pistone torna alla siringa microliter e spingere lo stantuffo fino a 2 µ l di acqua distillata rimane in canna. Non lasciare che il volume di acqua distillata diventano inferiore a 2 µ l.
  3. Montare con cura siringa microliter la pompa a siringa micro portata.
  4. Pipettare piccole quantità di colorante 0,1% veloce verde (preparato in soluzione fisiologica allo 0,9% e filtrato con filtro di 0,22 µm) e i liquidi di virus a un pezzo di parafilm.
  5. Prelevare una piccola quantità di aria per rendere visibile una bolla d'aria all'incrocio tra l'ago per iniezione 30g e PE10 tubo seguita da 0,7 µ l di filtrato verde veloce di carico nel tubo per verificare il flusso dei liquidi nelle tubazioni microiniezione.
  6. Ritirare un'altra piccola quantità di aria per rendere una bolla d'aria seconda seguita caricando i liquidi di virus nella tubazione microiniezione.
  7. Collegare e fissare l'ago per microiniezione 30g al braccio dell'apparecchiatura stereotassica.

5. anestesia di topi neonatali di ipotermia

  1. Collocare il cucciolo in un manicotto di guanto di lattice e immergerlo nel ghiaccio tritato fino al collo per 5 min.
  2. Un pizzico di piedi di pup con pinze per non assicurarsi che nessuna risposta di ritiro dei suoi piedi.
  3. Collocare il cucciolo con manica guanto di lattice nel vassoio di testa e metti del ghiaccio schiacciato attorno al manicotto in lattice per mantenere il freddo per anestesia di ipotermia.
  4. Applicare unguento veterinario sugli occhi del cucciolo per prevenire la secchezza mentre nell'ambito dell'anestesia se possibile.

6. microiniezione

  1. Preparare chirurgia sterile pulendo lo strumento stereotassica accuratamente con etanolo al 70%. Sterilizzare lo strumento chirurgico immergendole in etanolo al 70%.
  2. Strofinare la testa di pup con etanolo al 70%. Individuare la lambda pietra miliare sul cranio e contrassegnare la lambda con un pennarello. Dirigere la punta dell'ago per la lambda e impostare l'antero-posteriore (AP) e mediale-laterale (ML) Coordinate come zero.
  3. Spostare il braccio di iniezione al sito di destinazione, secondo le coordinate X e Y del sito di destinazione. Per il corpo striato di giorno postnatale (P) 2 cuccioli, le coordinate sono: AP, +2,4 mm in avanti facendo la lambda; ML, ± 1,0 mm laterale dalla linea mediana; dorso-ventrale (DV), −1.7 mm dal cranio. Segnare la posizione della tintura veloce verde in PE10 tubo con una penna.
  4. Portare giù l'ago per iniezione 30g lentamente a penetrare attraverso la pelle e il cranio e quindi portare la punta dell'ago finché non si ferma alla superficie del cranio. Impostare la coordinata DV come zero.
  5. Far cadere l'ago per iniezione 30g lentamente fino a raggiungere la coordinata DV del sito di destinazione. Attendere 1 minuto consentire il parenchima riprendendo la sua forma normale. Eseguire il programma di Microiniezione (100 nL/min).
  6. Assicurarsi che il marchio della tintura veloce verde si muove nel tubo PE affinché che il liquido di virus è iniettato nel cervello.
  7. Attendere 1 minuto dopo la cessazione della microiniezione e poi lentamente e progressivamente portare l'ago all'altezza di 1/2 di profondità DV entro 30 s. Dopo 30 s, estrarre lentamente l'ago dalla testa di pup.
  8. Ripetere il passaggio 6.2 a 6.7 finché non vengono completate le microiniezioni di tutti i siti mirati.

7. post-chirurgica di recupero del cucciolo

  1. Scaldare il pup per 20 min in un incubatore a 33 ° C. Controllare il recupero del cucciolo dall'ipotermia anestesia ogni 5 min fino a quando il cucciolo ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
  2. Riportare il cucciolo alla diga dopo il cucciolo è completamente recuperato.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Per il primo set di esperimento, abbiamo microiniettati 200 nL di AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 virus (AAV-eGFP-Cre, diluizione 1: 10 in soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco) che esprimono la ricombinasi Cre DNA fusi con GFP in P2 striato di topi Ai14. I topi Ai14 rapidi tdTomato gene reporter all'omissione Cre-mediata di loxP-fiancheggiato (floxed) fermata cassetta (Figura 2F). I cervelli sono stati raccolti presso P14 per immunostaining di GFP e tdTomato. Molti AAV trasdotte cellule GFP-positive era presente in tutto il corpo striato (Figura 2A, C), che indica un'infezione estesa delle cellule striatali da virus AAV-eGFP-Cre. Espressione simile vasto di tdTomato inoltre è stato trovato nel corpo striato (Figura 2B, C). All'esame al microscopio ad alto ingrandimento, abbiamo trovato che quasi tutte le cellule di striatal GFP-positive co-espressi il gene reporter tdTomato (Figura 2A'-C'). Inoltre, tdTomato segnali sono stati rilevati in presumibilmente terminali assonici nel pallidus di globus (Figura 2D) e la substantia nigra pars reticulata (Figura 2E), le regioni di destinazione dei neuroni di proiezione striatonigral e striatopallidal 13. questi risultati indicano un successo Cre-loxP mediata ricombinazione del DNA indotto da espressione AAV-mediata di attività Cre in neuroni striatali neonatale.

Per il secondo set di esperimento, abbiamo microiniettati 50 nL di virus AAV-eGFP-Cre nello striato di Foxp2fl/fl topi portatori di alleli di Foxp2 loxP-affiancata a P2 (Figura 3A- C, F) e raccolto il cervello a P9. Nessun Foxp2+; GFP+ doppio-etichettati cellule sono state trovate nel corpo striato, vale a dire., proteina Foxp2 era assente in cellule GFP-positive (Figura 3A'-C'). In esperimenti di controllo, Foxp2+; GFP+ doppio-etichettati cellule erano presenti nel corpo striato dei topi di Foxp2fl/fl con virus di controllo AAV-eGFP (Figura 3D) e nel corpo striato di eterozigoti Foxp2fl / + topi con AAV-eGFP-Cre virus (Figura 3E). Questi risultati indicano che il gene Foxp2 specificamente viene eliminato in AAV-eGFP-Cre trasformata cellule dello striato neonatale.

Considerati nel loro insieme i risultati di AAV-eGFP-Cre; Ai14 e AAV-eGFP-Cre; FOXP2fl/fl topi, la tecnica di chirurgia stereotassica cerebrale neonatale che abbiamo sviluppato è favorevole per condizionalmente Elimina geni in regioni specifiche del cervello di topo neonatale.

Figure 1
Figura 1. Apparato stereotassiche e fatti in casa dal titolare fisso in testa per topi neonatali. (A) il sistema di iniezione stereotassica consiste dei seguenti dispositivi: pompa a siringa i. (regolatore); pompa a siringa II. (unità); III. microliter siringa (10 µ l); IV. PE20 adattatore tubi; v. PE10 tubo; ago per iniezione vi. 30G; VII. stereotassica apparato; VIII. una scatola di punte di pipetta convertito piattaforma per cuccioli neonatali; XI: ghiaccio tritato. (B) l'altezza della cassetta incorporamento del tessuto è di circa 7 mm. Il pulsante di 1.5 mL provetta è lunga circa 15 mm. (C) la testa del mouse è fissata nel supporto testa-fisso fatti in casa. La freccia indica la lambda di pietra miliare nella testa del topi neonatali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Espressione di tdTomato nello striato di topi P14 Ai14 dopo AAV-eGFP-Cre mediata ricombinazione del DNA Cre-loxP. AAV-eGFP-Cre virus sono stati iniettati nel corpo striato P2 dei topi Ai14 sterotaxically. Il cervello è stato analizzato a P14. (A) molte cellule GFP-positive sono presenti in tutto il corpo striato (Str). (B) molte cellule tdTomato-positive sono anche presenti nel corpo striato. (C) le immagini unite mostrano un'ampia co-localizzazione di GFP e tdTomato nel corpo striato. Immagini confocal di regioni boxed in A-C sono indicate ad alto ingrandimento nell'A '-C', rispettivamente. Tutte le cellule GFP-positive (verde) Co-express tdTomato (rosso) nel corpo striato. (D, E) Vengono rilevati i segnali di tdTomato nei territori target dei neuroni di proiezione striatali, tra cui il pallidus di globus (GP; D) e la substantia nigra pars reticulata (SNr; E). (F) disegni schematici di AAV-eGFP-Cre e Ai14 costrutti transgenici. CTX: corteccia; Sep: setto; Hipp: Ippocampo; MB: mesencefalo. Barra della scala in A (per A-C), 200 µm; A' (per A'-C'), 10 µm; D (per D ed E), 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Nella figura 3. Condizionale delezione del gene Foxp2 nello striatum neonatale di injecions di intrastriatal di virus AAV-eGFP-Cre. Intrastriatal iniezioni di virus AAV-eGFP-Cre sono state eseguite in P2 Foxp2fl/fl (A-C') e Foxp2fl / +topi (E). I cervelli sono stati analizzati a P9. (A-C) Cellule GFP-positive (A, C, verde) mancano di immunoreactivity di Foxp2 (B, C, rosso) nel corpo striato dei topi di Foxp2fl/fl con virus AAV-eGFP-Cre. Le regioni boxed in A-C sono mostrate a forte ingrandimento nell'A '-C', rispettivamente. (D) cellule striatali co-express GFP e Foxp2 sono presenti nel corpo striato che è stato iniettato con virus controllo AAV-eGFP. Cellule GFP-positive (E) co-express Foxp2 (frecce) sono presenti nello striato del Foxp2fl / + topi con virus AAV-eGFP-Cre. (F) disegni schematici di virus AAV-eGFP-Cre e topi transgenici Foxp2fl/fl . Barra della scala in A (per A-C), 200 µm; A' (per la A'-C', D ed E), 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nello studio presente, dimostriamo un metodo semplice e affidabile stereotassica per iniettare il virus AAV nello striato del cervello di topo neonatale. Abbiamo microiniettati virus AAV-eGFP-Cre nello striato di topi reporter Ai14 a P2 e poi analizzata l'espressione del gene reporter presso P14. Abbiamo trovato che AAV trasdotte cellule GFP-positive in tutto il corpo striato a rostrocaudal livelli. Inoltre, quasi tutte le cellule GFP-positive co-espressi il gene reporter di tdTomato in cellule striatali, suggerendo una ricombinazione del DNA Cre-loxP successo indotta dall'espressione AAV-mediata di attività Cre. Abbiamo ulteriormente confermato l'efficacia di questo approccio tramite microiniezioni di AAV-eGFP-Cre nei topi di Foxp2fl/fl striato a P2. Doppia etichettatura hanno mostrato che molte cellule trasdotte adenoassociati GFP-positive mancavano il immunoreactivity Foxp2 nello striatum P9, suggerendo un'omissione con successo condizionale del gene Foxp2 nello striatum neonatale. I volumi di adenoassociati iniettati sono correlati con la dimensione delle regioni del cervello infetto. Con 200 nL del volume iniettato, cellule GFP-positive sono state trovate ampiamente in tutto il corpo striato neonatale, e alcune cellule GFP-positive sparse erano inoltre presenti nella corteccia adiacente al corpo striato. Con 50 nL del volume iniettato, cellule GFP-positive erano localmente limitate al corpo striato neonatale. Pertanto, titolazione i volumi di adenoassociati iniettati è importante per trasduzione ottimale di popolazioni neuronali in regioni specifiche del cervello. Inoltre, il tasso di trasduzione è determinato anche dal titolo di preparazione virale. È immaginabile che tipi di cella specifica targeting preciso possono essere ottenuti utilizzando topi transgenici con differenti promotori.

Ci sono diversi suggerimenti chirurgici per successo adenoassociati d'iniezione per le regioni del cervello interessato. In primo luogo, a causa delle piccole dimensioni di cuccioli di topo e la difficoltà di ottenere la posizione della testa del mouse con le mani durante la chirurgia, è difficile eseguire chirurgia stereotassica cerebrale in topi neonatali10. Anche se uno studio precedente ha dimostrato chirurgia stereotassica neonatale, ma ci vogliono due persone per eseguire la microiniezione durante la chirurgia11. Abbiamo superato questi problemi attraverso lo sviluppo di un dispositivo su misura testa-fisso che può fissare saldamente la testa del cucciolo durante l'intervento chirurgico al cervello. L'intere procedure possono essere eseguite da una sola persona. Le dimensioni del cervello dei topi neonatali sono variate a causa di diverso background genetico, cure materne e l'età dei cuccioli. Un vantaggio del nostro dispositivo in casa è che permette una fissazione delicata ma sicura della testa del mouse neonatale, che è essenziale per l'esecuzione di neurochirurgia stereotassica di alta precisione. In secondo luogo, a causa dell'elasticità della pelle morbida e la sottile parete del cranio, incisione della pelle seguita da teschio di perforazione in testa è difficile da eseguire nei cuccioli neonatali. Per ovviare a questo problema, è necessario fare una puntura della pelle e il cranio con una punta ad ago prima di abbassare l'ago per iniezione per la regione del cervello mirato. In terzo luogo, è importante controllare il flusso di colorante visibile nel tubo PE per assicurarsi che la microiniezione è in progressione durante l'iniezione. Se il colorante non si muove nel tubo PE, gli sforzi dovrebbero adottare per problemi sparare i problemi, tra cui una possibile perdita di liquido nel tubo e intasato aghi. Si noti che questo metodo si applica per i cuccioli neonatali cui lambda sono visibili attraverso la pelle prima di P5. Per i cuccioli più vecchi di P5, potrebbe richiedere un'incisione nella pelle per esporre la lambda. Si noti che illuminazione luce sulla testa del mouse P4 e P5 può aiutare a individuare la lambda di pietra miliare. Anche se non abbiamo effettuato questa tecnica di chirurgia stereotassica in ratti neonatali, diamo per scontato che la tecnica è applicabile a cuccioli di ratto con alcune modifiche.

L'inizio e la massima espressione del virus che trasportano espressione genica prendere diversi giorni o settimane dopo le iniezioni nel cervello14,15. Nello studio presente, abbiamo trovato che la ricombinazione di Cre-loxP DNA mediata da virus AAV-eGFP-Cre in neuroni striatali neonatale si è verificato più presto 8 giorni dopo la trasduzione virale. Lo studio precedente ha segnalato che l'attività del reporter AAV-mediata Cre-dipendente può essere rilevato nel bulbo olfattivo dei cuccioli neonato mouse fin da 3 giorni dopo l'iniezione di massa di adenoassociati15. È immaginabile che l'inizio iniziale di attività genetica AAV-mediata è un vantaggio per studiare gli eventi inerenti allo sviluppo che continuamente si verificano nel cervello postnatale.

In sintesi, la tecnica stereotassica neonatale che abbiamo sviluppato non è solo per condizionalmente Elimina geni in regioni specifiche del cervello, ma è anche suscettibile di iniettare reagenti farmacologici e traccianti neuronali a regioni specifiche del cervello in topi neonatali. Anche se abbiamo solo fatto microiniezioni nello striato neonatale nello studio presente, in linea di principio, nostra chirurgia stereotassica cerebrale neonatale può essere applicato a regioni specifiche del cervello di destinazione se le coordinate delle regioni specifiche nel cervello neonatale sono disponibili. Data la variabilità delle dimensioni del cervello di topo neonatale con diverso background genetico nelle diverse fasi, è essenziale per determinare empiricamente le coordinate precise dei siti mirati dagli investigatori. Infine, da stereotassiche microiniezioni di adenoassociati esprimendo geneticamente optogenetica3 e chemogenetic proteine4 e indicatori di attività neuronale5 in regioni specifiche del cervello, uno può esplorare il ruolo di un neurone attività sullo sviluppo postnatale del cervello alla risoluzione di livelli specifici del circuito e del tipo delle cellule.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Quest'opera è stata sostenuta dal Ministero della scienza e tecnologia garantisce a MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, gli istituti di ricerca nazionali di salute concede vi-EX106-10429NI e il programma di centro di ricerca aree consigliati sovvenzione da il Ministero dell'istruzione attraverso Brain Research Center, National Yang-Ming University di Taiwan, e Postdoctoral Fellowship concede MOST106-2811-B-010-031 (S.-Y.C.), MOST105-2811-B-010-036 e MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30G PrecisionGlide Needle Becton Dickinson REF 305106
Chloroform JT Baker 9180-03
Hamilton MICROLITER Syringe Hamilton  80300 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor
Polyethylene tubing PE20 Becton Dickinson 427406
Polyethylene tubing PE10 Becton Dickinson 427401
Micro Flow Rate Syringe Pump Longer Precision Pump Co. TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit)
25G syringe Becton Dickinson REF 302105
Fast green Sigma-Aldrich F-7252 0.1%
Standard Stereotaxic Instruments RWD Life Science 68037 Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor
Anti-FOXP2 antibody Abcam ab16046 Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4,000
Anti-RFP antibody Abcam ab65856 Mouse monoclonal to RFP, 1:1,000
BX63 microscope Olympus BX63
LSM 880 confocal microscope Zeiss LSM 880
Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. 111-585-003
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 Penn Vector Core AV-9-PV1848 Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)
AAV9.chicken actin-eGFP AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan N/A 1x1014 (GC/ml)
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J The Jackson Labtorary  007914 Ai14
B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ The Jackson Labtorary  026259 Foxp2fl/fl
Dulbecco’s phosphate buffered saline Corning cellgro 21-030-CVR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).
  2. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1, (6), 3166-3173 (2006).
  3. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13, (4), 251-266 (2012).
  4. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89, (4), 683-694 (2016).
  5. Knopfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 13, (10), 687-700 (2012).
  6. Tau, G. Z., Peterson, B. S. Normal development of brain circuits. Neuropsychopharmacol. 35, (1), 147-168 (2010).
  7. Mitchell, K. J. The genetics of neurodevelopmental disease. Curr. Opin. Neurobiol. 21, (1), 197-203 (2011).
  8. Sahin, M., Sur, M. Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders. Science. 350, (6263), (2015).
  9. Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference. J. Vis. Exp. (77), e50600 (2013).
  10. Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neurosci. Bull. 31, (6), 685-696 (2015).
  11. Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. Jr A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo. Brain Res. 1307, 43-52 (2010).
  12. Chen, Y. C., et al. Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c. Nat. Neurosci. 19, (11), 1513-1522 (2016).
  13. Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia. Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).
  14. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, (18), 6171-6177 (2010).
  15. Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas. Front. Neural Circuit. 9, 72 (2015).
Chirurgia stereotassica per la manipolazione genetica in cellule striatali di cervelli di topo neonatale
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, S. Y., Kuo, H. Y., Liu, F. C. Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (137), e57270, doi:10.3791/57270 (2018).More

Chen, S. Y., Kuo, H. Y., Liu, F. C. Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (137), e57270, doi:10.3791/57270 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter