Summary
新生児マウス脳の線条体にマイクロインジェクション試薬は自家製頭固定デバイスに定位手術のプロトコルについて述べる。この手法では、新生児マウス脳の特定の領域の神経細胞で遺伝子操作ことができます。
Abstract
多くの遺伝子は萌芽期の脳で表されます、それらのいくつかは継続的に出生後、脳で表現されます。このような永続的に表現された遺伝子の彼らは、発達過程や新生児の脳の生理機能を調節する機能があります。脳の特定の遺伝子の神経生理機能を調べるためには、脳における遺伝子を不活化する不可欠です。ここでは、新生児のタイム ・ ウィンドウでトランスジェニック マウス線条体における遺伝子発現の不活化する簡便な脳定位固定装置について述べる。Microinjected AAV eGFP Cre ウイルスはあった生後日 (P) 定位脳手術による 2 Ai14 レポーター遺伝子マウスの線条体に。P14 線条体、成功の Cre loxP AAV 導入線条体細胞での DNA 組換えを介した示唆 tdTomato レポーター遺伝子発現が検出されました。さらに、P2Foxp2フロリダ州/フロリダマウスに AAV eGFP Cre ウイルス マイクロインジェクションによるこの技術を検証しました。GFP と Foxp2 の二重ラベル GFP 陽性細胞に導入 AAV eGFP Cre 線条体における Foxp2 蛋白質の損失を示唆、P9 の線条体の Foxp2 を免疫反応性が欠けていたことを示した。一緒に取られて、これらの結果は、floxed トランスジェニック マウスの新生児の脳の特定の神経細胞集団におけるてんかん microinjected AAV eGFP Cre ウイルスによって効果的な遺伝子欠失を示します。結論としては、私たちの脳定位固定装置の手法は、新生児マウス脳における遺伝子操作の簡単でシンプルなプラットフォームを提供します。テクニックだけが使えないことが新生児の脳の特定の領域に遺伝子を削除するが、それはまた、薬の薬理学的、神経トレーサー、遺伝子組み換えの研究と chemogenetics タンパク質、神経活動の指標を注入する使用ことができ、新生児マウス脳の線条体に他の試薬。
Introduction
構造の近代的な研究と脳の機能が神経細胞の特定の遺伝子の遺伝的操作を通常要求します。完全、トランスジェニック マウスを含む突然変異体の対立遺伝子を運ぶの異なる遺伝子の機能を調べるため、ノックアウト、ノックイン対立遺伝子を定期的に生成されます。大人の齧歯動物の脳定位固定脳外科手術は、ローカル齧歯動物の頭脳1,2の特定の領域に薬物、ウイルス、トレーサーおよびその他の試薬を提供する標準的な方法です。トランスジェニック マウスに定位脳手術を適用することにより、遺伝子遺伝子機能およびマウス脳の特定の神経集団の神経活動を操作する 1 つ。セル型固有の操作は、脳の3,4、5の複雑な神経回路の神経機能を解読する強力なアプローチを提供します。
神経系の神経系の発達が初期胚の段階から始まり、幼齢期まで生後後発達プロセス続行します。神経系の成熟生後には6脳の生理学的および認知機能のために不可欠である正確なシナプス神経回路網の配線が含まれます。したがって、新生児のタイム ・ ウィンドウで発生する発達のイベントの勉強は通常の神経系の発達を理解するためだけではなく重要ですが、また神経発達や精神疾患7 の病因に洞察力を提供することがあります。 ,8。大人の齧歯動物の脳定位固定脳外科手術の方法がすぐに利用できる2,9, いくつかのプロトコルが新生児マウス10,11脳定位固定脳外科手術のためのインターネットで利用できます。実際には、マウスの新生仔ラットの脳に試薬の脳定位固定装置の薬剤は困難、新生児子犬の頭は非常に傷つきやすい標準脳定位固定装置で固定されるためです。それにもかかわらず、トランスジェニック マウスへの定位脳手術の適用は新生児マウス12可能です。ここでは、マウスの新生仔ラットの脳定位固定脳外科手術を実行する自家製セットアップと簡単な方法をについて説明します。このテクニックにより、レポーター遺伝子マウスおよび条件付きで floxed トランスジェニック マウスの線条体に Cre DNA の AAV 表現の recombinase マイクロインジェクションによる floxed 遺伝子を条件付きで削除する 1 つを示します。この方法は、野生型マウスの新生児の線条体に試薬を提供するも。
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Protocol
ここで説明した動物のプロトコルは、動物のケアと使用国立陽明大学委員会によって承認されています。
1. 新生仔脳定位固定装置のホルダーの準備
- 頭のトレイを作る: 管の壁の 1/5 を削除することによって新生児子犬の頭にフィットする形状に 1.5 mL 遠心チューブ (15 mm 長い) の下部をカットします。
- 脳定位固定装置の台座に合った適切なサイズのピペット チップ ボックスを取るし、上部カバーを取り外します。手順 1.1 ・熱溶融接着剤で先端トレイのベースの上に組織の埋め込みカセットで頭のトレイに貼付します。組織の埋め込みカセットの高さは 7 mm、ヘッド固定位置で子犬の首と体をサポートするものです。
- 標準的な脳定位固定装置の全体のセットアップを配置します。
2. 30 G 注射ステンレス針の準備
- 3 日間のクロロホルムでそれらを浸すことによってクリーン前 30 G 注射針。
- 慎重に、ゆっくりと引き出す針化学フードをポリプロピレン ハブから鉗子を使用します。
- 無水エタノール 50 rpm でシェーカーの 3 × 10 分の 70% のエタノールの洗浄に続いて 20 分針を洗います。使用するまで針の空気乾燥し、室温 (RT) でクリーン ボックスの洗浄針を保存してみましょう。
3. マイクロインジェクション チューブ用アダプターを準備します。
- PE10 ポリエチレン管 (PE10 チューブ) 30 G 注射針 1 マイクロリットル注射器に接続します。1 マイクロリットルの注射器と注射針をブリッジの PE20 ポリエチレン チューブ (PE20 チューブ) アダプターを準備します。アダプターの使用は、PE10 チューブの直径は 26 G 1 マイクロリットル シリンジの針よりもかなり小さいため、必要です。
- 1 マイクロリットル注射器にチューブを準備: PE20 チューブ 5 cm と事前にクリーンアップされた 30 G 注射針を接続し、瞬間接着剤との接合部をシールします。このチューブ アダプターは再利用です。
注: 場合のインジェクション注射器の針は 30 G、調製 (ステップ 3.1) とその利用 (ステップ 3.3) このアダプターの必要はありません。 - 1 マイクロリットル注射器 (10 μ L) (3.1 の手順で準備) チューブ アダプターを接続します。
- PE20 チューブ アダプターの 30 G 針に (ない 60 cm 以上) PE10 チューブの一方の端を接続します。PE10 チューブのもう一方の端に新しい 30 G 注射針をマウントします。
4. オートクレーブ蒸留水、染料とウイルスのインジェクション チューブをロードします。
- 1 マイクロリットル シリンジのプランジャーを取り外します。25 G の注射器を使用して、1 マイクロリットル注射器とオートクレーブ蒸留水、チューブから空気を削除するとその接続の PE 管を読み込みます。
- 戻る 1 マイクロリットル シリンジのプランジャーを置き、プランジャー バレルのままに蒸留水の 2 μ L まで。2 μ L よりも低くなる蒸留水の量を聞かせてはいけません。
- マイクロ フロー レート シリンジ ポンプに 1 マイクロリットル注射器を慎重にマウントします。
- 少量の 0.1% 高速グリーン色素 (0.9% 生理食塩水に用意され、0.22 μ m フィルターでフィルタ リング) とパラフィルムの部分にウイルス液をピペットします。
- マイクロインジェクション チューブで流体の流れをテストする 30 G 注射針とチューブへのフィルタ リングの高速グリーンの 0.7 μ L の読み込みに続いて PE10 チューブの間のジャンクションで気泡を表示するへの空気の少量を撤回します。
- 空気を抜いてマイクロインジェクション チューブにウイルス液を読み込むことによって続いて第 2 気泡の別の少量を撤回します。
- 添付し、脳定位固定装置のアームに 30 G マイクロインジェクション針を固定します。
5. 低体温による新生児マウスの麻酔
- ラテックス手袋スリーブに子犬を置き、5 分間の首まで砕いた氷に浸します。
- 子犬の足を確認の足の撤退応答に鉗子でつまみます。
- 頭のトレイにラテックス手袋スリーブと子犬を置き、低体温麻酔の寒さを維持するラテックス スリーブ周り砕いた氷を入れた。
- 可能であれば麻酔中の乾燥を防ぐために子犬の目に獣医軟膏を適用します。
6. マイクロインジェクション
- 70% エタノールで十分に脳定位固定装置を拭くことによって生殖不能手術を準備します。70% エタノールに浸漬した手術器具を滅菌します。
- 70% エタノールで子犬の頭をごしごし洗いなさい。頭蓋のランドマーク ラムダを探し、マーカーペンでラムダをマークします。ラムダに針の先端を目指して、ゼロとして前後 (AP) と内側-外側 (ML) 座標を設定します。
- 注射の腕をターゲット サイトの X および Y 座標によるとターゲット ・ サイトに移動します。生後一日 (P) 2 の線条体の子犬、座標は、: AP、ラムダ; 前方 +2.4 mmML、± 1.0 mm; 正中線から外側背腹軸 (DV)、頭蓋骨から −1.7 mm。PE10 管内高速グリーン色素の位置をペンでマークします。
- 皮膚と頭蓋骨を貫通するゆっくりと 30 G の注射針をダウンさせるし、頭蓋骨の表面で停止するまで針の先端をもたらします。ゼロとして DV 座標を設定します。
- ターゲット ・ サイトの DV 座標に到達するまでゆっくりと 30 G の注射針をダウンさせます。実質通常の形状の再開を許可する 1 分待ちます。マイクロインジェクション プログラム (100 nL/min) を実行します。
- 高速グリーンの色素のマークが脳にウイルス液を注入できるように PE 管で動いていることを確認します。
- マイクロインジェクションの終了後 1 分待つし、DV 深さ 30 以内の高さの 1/2 に針をゆっくりと徐々 に戻して s。30 後 s、子犬の頭から針をゆっくりと引き出します。
- すべてのターゲット サイトの薬剤が完了するまで、手順 6.2 に 6.7.
7 子犬の手術後の回復
- 33 ° C の定温器で 20 分間子犬を暖かい。子犬は胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻したまで低体温麻酔 5 分ごとから子犬の回復を確認します。
- 子犬は完全に回復した後、子犬をダムに戻ります。
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Representative Results
実験の最初のセットに我々 microinjected 200 Ai14 マウスの P2 線条体に GFP 融合エクスプレス DNA Cre リコンビナーゼ AAV9.hSynapsin.HI.eGFP Cre.WPRE.SV40 ウイルス (AAV-eGFP-Cre、ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水で 1/10 希釈) の nL。Ai14 マウスは、loxP 並ぶ (floxed) 停止カセット (図 2 f) の削除を Cre を介した tdTomato レポーターの遺伝子を表現します。脳は、GFP と tdTomato の免疫染色の P14 に収穫されました。多くの AAV が GFP 陽性細胞を導入した (図 2 a, C)、線条体全体で現在 AAV eGFP Cre ウイルスによって線条体細胞の広範な感染を示します。TdTomato のような広範な表現も、線条体 (図 2 b, C) で発見されました。ほぼすべての GFP 陽性線条体細胞が共同 tdTomato レポーターの遺伝子を表現がわかりました高倍率での顕微鏡検査は、(図 2 a'-C')。また、tdTomato 信号は淡蒼球 (図 2 D) や中脳蓋カン (図 2 e)、線条体黒質、線条の投射ニューロンのターゲット地域でおそらく軸索の端末で検出されました。13です。 これらが示唆された成功の Cre loxP を介した DNA 組換え AAV による新生児線条体ニューロンにおける Cre 活性の発現によって誘導されます。
実験の第 2 セット、我々 microinjected 50 P2 で loxP 並ぶFoxp2遺伝子を運ぶFoxp2フロリダ州/フロリダマウス線条体に AAV eGFP Cre ウイルスの nL (図 3 aの C、F)、P9 で脳を収穫。ない Foxp2+;GFP+二重標識細胞が線条体、すなわち見つかりました。、Foxp2 蛋白質は欠席した GFP 陽性細胞 (図 3 a'-C')。制御実験、Foxp2 の+;GFP+二重標識細胞 AAV eGFP コントロール ウイルス (図 3 D) とFoxp2フロリダ州/フロリダマウス線条体とヘテロ接合性の線条体に存在していたFoxp2fl/+ AAV eGFP Cre マウスウイルス (図 3E)。Foxp2遺伝子が導入 AAV eGFP Cre 新生児線条体の細胞で具体的には削除されることが示唆されました。
AAV-eGFP-Cre; の結果をまとめるAi14とAAV-eGFP-Cre;Foxp2フロリダ州/フロリダ州マウスを開発した新生児の脳定位固定脳外科技術は新生仔マウスの脳の特定の領域で条件付きで削除遺伝子の影響を受けやすい。
図 1。脳定位固定装置および新生仔マウスの自家製頭固定ホルダー。(A)脳定位固定装置の噴射システムは、次のデバイスで構成されています: i. シリンジ ポンプ (コント ローラー);ii. シリンジ ポンプ (駆動部);iii. 1 マイクロリットル シリンジ (10 μ L);iv. PE20 チューブ アダプター;v. PE10 管;vi. 30 G 注射針。vii. 脳定位固定装置viii. ピペット ヒント ボックス変換新生児の子犬のためのプラットフォームxi: 砕いた氷。(B)組織の埋め込みカセットの高さは約 7 mm です。1.5 mL 遠心管のボタンが約 15 mm 長いです。(C)マウスの頭は、自家製の頭固定ホルダーで保護されます。矢印は、画期的なラムダ新生仔マウスの頭の中を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。AAV eGFP Cre は, DNA 組換えを介した後 P14 Ai14 マウス線条体 tdTomato の発現します。AAV eGFP Cre ウイルスであった sterotaxically Ai14 マウスの P2 線条体に注入します。P14 で脳を調べた。(A)多くの GFP 陽性細胞は線条体 (Str) 全体に存在します。(B)多くの tdTomato 陽性細胞が線条体の存在も。(C)結合画像は線条体における GFP および tdTomato の広範な共局在を示します。A の高倍率で A ~ C のボックス化された地域の共焦点画像のとおり '-C'、それぞれ。(緑) すべての GFP 陽性細胞は、線条体 (赤) tdTomato 共同エクスプレスします。(D, E)淡蒼球 (GP; を含む、線条体投射ニューロンのターゲット地域で tdTomato 信号が検出されます。D) および中脳蓋カン (SNr;E). (F) AAV eGFP Cre と Ai14 遺伝子導入構成体の模式図。Ctx: 皮質;9 月: 隔壁;ヒップ: 海馬。MB: 中脳。(A ~ C) のためのスケール バー、200 μ m;A' (a '-C'), 10 μ m;D (D および E)、100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。AAV eGFP Cre ウイルスのマウス injecions によって新生児線条体におけるFoxp2遺伝子の条件付き削除します。P2 Foxp2フロリダ州/フロリダ州で行われた AAV eGFP Cre ウイルスのマウス注射 (A ~ C') とFoxp2fl/+(E) マウス。P9 で脳を行った。(A ~ C)GFP 陽性細胞 (C、, 緑) は、AAV eGFP Cre ウイルスとFoxp2フロリダ州/フロリダマウス線条体における Foxp2 陽性 (B、C、赤) を欠いています。A ~ C でボックス化された地域では高倍率に示されている '-C'、それぞれ。(D)線条体細胞共同エクスプレス GFP と Foxp2 が AAV eGFP コントロール ウイルスが注入された線条体で存在。(E) GFP 陽性細胞共同エクスプレス Foxp2 の線条体に存在している (矢印) Foxp2fl/+ AAV eGFP Cre ウイルスを持つマウス。(F) AAV eGFP Cre ウイルスとFoxp2フロリダ州/フロリダトランスジェニック マウスの模式図。(A ~ C) のためのスケール バー、200 μ m;A' (a '-C'、D と E)、20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では新生児マウス脳の線条体に AAV ウィルスを注入するシンプルで信頼性の高い定位法を紹介します。我々 は P2 で Ai14 レポーター マウスの線条体に AAV eGFP Cre ウイルスを microinjected し、P14、レポーター遺伝子の発現を分析します。AAV 導入 GFP 陽性細胞は rostrocaudal レベルで線条体全体がわかった。さらに、ほぼすべての GFP 陽性細胞は共同 AAV による Cre 活性の発現によって誘導される成功, DNA 組換えを示唆、線条体における tdTomato レポーターの遺伝子を表現しました。さらに P2 で線条体Foxp2フロリダ州/フロリダマウスに AAV eGFP Cre の薬剤によりこのアプローチの有効性を確認しました。二重ラベル通気導入 GFP 陽性細胞は多くに新生児線条体におけるFoxp2遺伝子の正常に条件付き削除を示唆、P9 の線条体の Foxp2 を免疫反応性が欠けていたことを示した。Microinjected 通気量は、感染した脳の領域のサイズに関連付けられます。200 と噴射量の nL、GFP 陽性細胞は新生児の線条体全体で広範囲に発見された、いくつかの散在の GFP 陽性細胞も皮質線条体に隣接して存在していた。50 と噴射量の nL、GFP 陽性細胞はローカルで新生児の線条体に制限されていました。したがって、挿入された通気量を滴定特定の脳部位の神経細胞群の最適な伝達のために重要です。さらに、伝達率はまたウイルスの準備の力価によって決定されます。トランスジェニック マウスを用いた異なるプロモーターによる正確なターゲット特定の細胞型が得られることが考えられます。
興味を持って脳の領域に成功した注入通気の外科いくつかのヒントがあります。まず、マウスの子犬および手術中に手でマウスの頭の位置を確保する上で難しさのサイズが小さいため、新生児マウス10脳定位固定脳外科手術を行うことは困難です。以前の研究は新生児の定位手術を示しているものの、手術11マイクロインジェクションを実行する人が必要です。我々 は脳手術中に子犬の頭をしっかりと確保できるカスタムメイドの頭固定のデバイスを開発することによりこれらの問題を克服しています。全体の手順は、一人で実行できます。新生仔マウスの脳のサイズは異なる遺伝的背景、妊産婦ケアと子犬の年齢によりさまざまです。当社の自家製デバイスの利点は、高精度定位脳手術を行うために不可欠である、新生仔マウスの頭の穏やかな、セキュリティで保護された固定できます。第二に、柔らかい肌の弾力性と頭蓋骨の薄い壁に、スカルの頭にドリルが続く皮膚切開は新生児子犬に行うことは困難。この問題を克服するために皮および対象脳領域に注射針を下げる前に針の先端と頭蓋骨の穿刺をする必要です。第三に、PE 管、インジェクションは、射出時の進行を確認する目に見える色素の流れを確認することが重要です。PE 管に染料が移動しない場合、努力はチューブに流体の流出を含む問題のトラブル シュートに取られるべきし、針が詰まっています。そのラムダが P5 の前に皮膚を通して見える新生児子犬にこのメソッドが適用されることに注意してください。P5 より古い子犬、ラムダを公開するための皮膚切開があります。P4 と P5 のマウスの頭の上に照明がランドマーク ラムダを見つけるを助けるかもしれないことに注意してください。新生仔ラットの定位手術のこの手法を施しておりませんが、我々 は技術、適用されるいくつかの変更と仔と仮定します。
発症と遺伝子発現を運ぶウイルスの最大の表現を取るいくつかの数日または数週間脳14,15に注射後。本研究では AAV eGFP Cre 新生児線条体ニューロンにおける Cre loxP DNA 組換えのウイルス媒介がウイルス伝達の後の 8 日には早くも発生したことがわかった。以前の研究では、マウスの新生仔ラットの嗅球における AAV を介した Cre 依存レポーターの活動が早くも通気15の一括注入後 3 日で認識されることを報告しています。AAV を介した遺伝子活動の早期発症が生後の脳で発生する継続的に発達するイベントの勉強のための利点であることが考えられます。
要約すると、開発した新生児の脳定位固定装置技術は、脳の特定の地域で条件付きで削除遺伝子だけではないがそれも薬理学的試薬および新生仔マウスの脳の特定領域に神経トレーサーを注入を受けやすい。原則として、本研究で行った新生児の線条体に薬剤のみが、私たち新生児の定位脳手術は、新生児の脳の特定領域の座標が利用可能な場合はターゲット特定の脳領域に適用できます。さまざまな段階で異なる遺伝的背景を持つ新生児マウス脳のサイズの変動を考えると、経験的調査官によって対象のサイトの正確な座標を決定することが不可欠です。最後に、することにより脳の特定領域に遺伝子組み換え光3と chemogenetic 蛋白質4と神経活動の指標5を表現する通気の脳定位固定装置誘発は、1 つは、神経の役割を探る可能性があります。携帯型固有、回路レベルの解像度で脳の生後発達に活動。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は科学省によって支えられた、パワーオプティマイザーの技術は MOST104-2311-B-010-010-MY3、MOST106-2321-B-010-012、国家衛生研究院を与える NHRI-EX106-10429NI と注目領域研究センター プログラム助成脳研究センター、台湾国立陽明大学を通して教育省・員 MOST106-2811-B-010-031 (s ・ エンライテンメント)、MOST105-2811-B-010-036 MOST106-2811-B-010-030 (H. 社長交代)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton MICROLITER Syringe | Hamilton | 80300 | 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor |
| Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Micro Flow Rate Syringe Pump | Longer Precision Pump Co. | TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit) | |
| 25G syringe | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0.1% |
| Standard Stereotaxic Instruments | RWD Life Science | 68037 | Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor |
| Anti-FOXP2 antibody | Abcam | ab16046 | Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4,000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | ab65856 | Mouse monoclonal to RFP, 1:1,000 |
| BX63 microscope | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 confocal microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1x1014 (GC/ml) |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Labtorary | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | The Jackson Labtorary | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning cellgro | 21-030-CVR |
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