Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Formaldehyd-assisteret Isolation af regulerende elementer til foranstaltning kromatin tilgængelighed i pattedyrceller

Published: April 2, 2018 doi: 10.3791/57272
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Department of Oncohematology and Genetics. Institute of Biomedicine of Seville (IBiS), University Hospital Virgen del Rocío, 2Institute of Biochemistry, Medical Faculty, Friedrichstrasse 24, Member of the German Center for Lung Research, Justus-Liebig-University

Summary

Plasticitet af nukleare arkitektur styres af dynamiske epigenetiske mekanismer, herunder ikke-kodende RNA'er, DNA methylering, nucleosome repositionering samt Histon sammensætning og modifikation. Her beskriver vi en Formaldehyde-Assisted Isolation af regulerende elementer (FAIRE) protokol, som giver bestemmelsen af kromatin tilgængelighed i en reproducerbar, billig og ligetil måde.

Abstract

Passende genekspression i svar til ekstracellulære stikord, dvs væv og afstamning specifikke gen transskription, afhænger kritisk højt definerede stater af kromatin organisation. Den dynamiske arkitektur af kernen styres af flere mekanismer og figurer transcriptional output programmer. Det er derfor vigtigt at fastlægge locus-specifikke kromatin tilgængelighed på en pålidelig måde, der helst uafhængigt af antistoffer, som kan være et potentielt forstyrrende kilde til eksperimentel variation. Kromatin tilgængelighed kan måles ved forskellige metoder, herunder Formaldehyde-Assisted Isolation af regulerende elementer (FAIRE) assay, der kunne give generelle kromatin tilgængelighed i et relativt lavt antal celler. Her beskriver vi en FAIRE protokol, der giver mulighed for enkel, pålidelig og hurtig identifikation af genomisk regioner med et lavt protein belægning. I denne metode, er DNA kovalent bundet til kromatin proteiner ved hjælp af formaldehyd som en crosslinking agent og klippet i små stykker. Gratis DNA er bagefter beriget ved hjælp af phenol: chloroform udvinding. Forholdet mellem gratis DNA bestemmes af kvantitative Polymerasekædereaktionen (qPCR) eller DNA-sekventering (DNA-FF.) i forhold til en kontrolprøve, der repræsenterer samlede DNA. Regioner med en løsere kromatin struktur er beriget med gratis DNA-prøven, således at identifikation af genomisk regioner med lavere kromatin jordpakning.

Introduction

Genomisk DNA af eukaryote celler er tæt pakket ind i nucleosomes, som skal fjernes eller ombygget for at tillade interaktion med andre proteiner med DNA. Transkriptionel aktivering af et gen typisk fører til en mere åben konfiguration af sin nucleosomal struktur, især i + 1 nucleosome1, lette transskription af RNA polymerase. Reguleringsmæssige områder som initiativtagere og smagsforstærkere undergår også, dynamiske ændringer i deres kromatin tilgængelighed til at tillade interaktion med kromatin modifikatorer eller transskription faktorer2. Flere metoder er blevet udviklet for at identificere disse nucleosome-frie regioner. Disse omfatter følsomhed til nukleaser såsom DNase jeg3 eller micrococcal nukleasen4, som har kun adgang til DNA, når det ikke er stramt svøbt omkring nucleosomes. Andre metoder til identifikation af åbne kromatin eller gratis DNA omfatter en transposase-medieret integration af retrotransposable elementer (Assay for Transposase-tilgængelige kromatin, ATAC)5, eller kromatin immunoprecipitation (ChIP) ved hjælp af antistoffer mod histoner. Metoden FAIRE er ikke baseret på et enzym kapacitet til at nå DNA eller binding af et antistof mod et bestemt protein, men i stedet bygger på rensning af nucleosome-frie regioner af phenol: chloroform udvinding6,7. I denne metode, DNA er kovalent bundet til kromatin proteiner af crosslinking agent formaldehyd og er forskydes bagefter i små stykker ved hjælp af sonikering. Tætpakkede kromatin regioner vil have rigelige DNA/protein krydsbindinger, mens DNA regioner med ingen eller kun få nucleosomes vil have ringe eller ingen crosslinked DNA/protein komplekser. En phenol: chloroform udvinding giver mulighed for rensning af den ikke-crosslinked gratis DNA i den vandige fase, mens DNA crosslinked at proteiner er fanget i økologisk phenol fase eller vandig-økologisk interfase med proteiner. Kvantificering af denne gratis DNA i forhold til en reference af samlede DNA-prøve giver mulighed for identifikation af kromatin gratis regioner. FAIRE metode kan anvendes til karakterisering af genomisk enkeltregioner, som beskrevet her, men er også velegnet til identifikation af genome-wide kromatin tilgængelighed når koblet til dyb sekventering, som beskrevet i forskellige modeller8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. resultaterne af FAIRE-FF. og andre metoder såsom ATAC-seq er stort set overlappende14. FAIRE-metoden er en meget robust, billige og nemme at udføre metode til at identificere nucleosome-frie regioner. I modsætning til andre metoder, det kræver ikke pilot forsøg for at bestemme det relevante niveau for fordøjelsen som krævet for nukleaser (DNase-FF., MNase-seq) eller transposases (ATAC-seq) og drøftet i detaljer i en nylig revision15. De eneste parametre skal justeres er sonikering betingelser og i nogle tilfælde fiksering tid. Dette papir beskriver en enkel protokol der vises skematisk i figur 1 og som ikke kræver nogen særligt udstyr end en sonikator. Protokollen kan udføres i en rimelig kort tid og gør FAIRE en nem og pålidelig metode til at teste kromatin tilgængelighed i en række forskellige celletyper spænder fra lunge celler11 til primærelementer fremstillet af mus lever16.

Protocol

1. dag 1: Cellekultur

  1. Kultur celler skal analyseres til den ønskede mængde. Celle kultur betingelser og medier afhænger celletyper under undersøgelsen.
    Bemærk: I princippet alle eukaryote celle er genstand for en analyse af kromatin tilgængelighed af FAIRE. For dette eksperiment, 4 x 106 HEK-293T cellerne udsås i en enkelt 10 cm parabol i DMEM medium suppleret med 10% (v/v) FBS og 1% (w/v) penicillin/streptomycin, og inkuberes ved 5% CO2 og 37 ° C i 24 timer indtil cellerne nå 70-80% sammenløbet (~ 8 x 10 6 celler pr. parabol).

2. dag 2: Formaldehyd Crosslinking og celle høst

Forsigtig: Formaldehyd er yderst giftigt og skal altid anvendes under et stinkskab. Bær beskyttende tøj (handsker og laboratoriekittel). Kassere affald korrekt.

  1. Tilføje formaldehyd direkte til cellekulturmedium i et stinkskab at nå frem til en endelig koncentration på 1% (v/v) (270 µL af 37% (v/v) formaldehyd til 10 mL i cellekulturmedium). Der inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur (20-25 ° C) og dræbte pladerne manuelt hver 2 min.
    Bemærk: Crosslinking tid kan reguleres efter celletype. For størstedelen af de cellelinjer er 10 min af crosslinking passende. For væv, længere inkubationer muligvis bedt om at tillade optagelsen af alle celler.
  2. Tilføje glycin til en endelig koncentration på 0,125 M slukke formaldehyd (tilsættes 500 µL af en 2,5 M Glycin bestand 10 mL af næringssubstratet). Inkuber i 5 min. ved stuetemperatur og dræbte hver 2 min.
  3. Vaske cellerne 3 x med is kold PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4 · 2 H2O, 0,24 g/L KH2PO4, justere pH til 7.4 med HCl eller NaOH). Opsug mediet og vaske direkte i celle kultur parabol eller kolben ved tilsætning af 10 mL PBS. Gentag dette trin to gange være meget omhyggelig i forbindelse med løst vedhængende celler såsom HEK-293T. Tilføje PBS omhyggeligt til siden af skålen for at undgå udstationering af celler.
  4. Efter den tredje vask, resuspend celle i 1 mL af is kold PBS og overførsel til en 1,5 mL reaktion tube på is. Bruge en celle skraber Adskil celler når det er nødvendigt.
    Bemærk: Når du starter med en begrænset materiale, brug lav DNA-bindende rør for at undgå prøve tab under proceduren.
  5. Der centrifugeres i 5 min. ved 300 x g ved 4 ° C i et afkølet bordplade centrifuge. Supernatanten ved omhyggeligt sugning det.

3. celle Lysis og kromatin opsplitning

  1. Celle resuspenderes i 1 mL FAIRE lysisbuffer (1% (w/v), 10 mM EDTA, 50 mM Tris HCl pH 8.1, 10 µg/mL leupeptin, 10 µg/mL aprotinin, 2 mM PMSF), og pelleten cellerne ved omhyggeligt pipettering op og ned flere gange. Ruger i 20 min. på is. Gemme prøver på-80 ° C på dette trin, hvis det er nødvendigt.
  2. Der sonikeres crosslinked DNA til at vride det til en gennemsnitlig størrelse på 200-300 bp. De specifikke indstillinger for sonikator skal bestemmes for hver kilde af prøver og de anvendte sonikering enhed. Under alle omstændigheder sikre, at DNA er effektivt forskydes. En optimering skridt for DNA klipning er beskrevet under trin 5.14. Cool prøver på is under sonikering til at undgå opvarmning af prøven.
  3. Centrifugeres prøve for 15 min og 13.000 x g ved 4 ° C.
  4. Overføre supernatanten til en ny reaktion tube. Split prøver i 100 µL delprøver. Gemme prøver på-80 ° C, hvis det er nødvendigt.
    Bemærk: Protokollen kan afbrydes på dette punkt.

4. de-crosslinking af kontrol DNA

  1. Tage en 100 µL alikvot fra trin 3.4 at vende bitmapgenkendelse og skal anvendes som reference for samlede DNA. Tilsæt 10 µL af RNase-A (10 mg/mL) og Inkuber i 1 time ved 37 ° C.
  2. Tilsæt 10 µL af Proteinase K (20 mg/mL). Brug en programmerbar thermo-blok til inkuberes i 4 timer ved 37 ° C og derefter i 6 timer ved 65 ° C kløver proteiner og vende krydsbindinger. Endelig holde prøverne ved 4 ° C, indtil protokollen er genoptaget og derefter fortsætte til trin 5.
    Bemærk: Andre FAIRE protokoller bruge kromatin prøver fra celler, som ikke har været crosslinked som reference, således afskaffe behovet for de-crosslinking11. Det faktum, at disse prøver ikke er crosslinked kunne føre til forskelle i sonikering effektivitet eller DNA stabilitet, derfor brugen af samlede DNA referenceprøver, der har gennemgået den samme procedure som prøverne er mere præcis.

5. dag 3: Phenol: Chloroform oprensning af DNA

  1. Tage den ikke-de-crosslinked alikvot fra trin 3.4. Tilsæt 10 µL af RNase-A (10 mg/mL) og Inkuber i 1 time ved 37 ° C.
  2. Tag ikke-de-crosslinked alikvot form skridt 5.1 og de-crosslinked prøven fra trin 4.2 og fortsætte sideløbende. Tilføj H2O for at nå en endelige mængden af 300 µL.
  3. Tilsæt 300 µL af phenol: chloroform: isoamyl alkohol (25:24:1) i et stinkskab og vortex kraftigt.
    Forsigtig: Phenol er ætsende og giftige og skal anvendes altid under et stinkskab. Bær beskyttende tøj (handsker og laboratoriekittel), Sørg for reaktion rør er tæt lukket, og bortskaf affald korrekt.
  4. Der centrifugeres i 10 min på 13.000 x g ved 4 ° C.
  5. Omhyggeligt overføre 280 µL af den øverste vandige fase til en ny reaktion tube. Sørg for ikke at tage eventuelle rester fra den interfase, som også indeholder proteiner. Kassér den resterende lavere fase som organisk opløsningsmiddel affald.
  6. Gentag trin 5.3 til 5,5 og omhyggeligt overføre 270 µL af den øverste vandige fase til en ny reaktion tube.
  7. Tilføje 270 µL chloroform i et stinkskab og vortexes kraftigt.
    Bemærk: Dette trin bruges til at fjerne enhver resterende phenol fra prøven.
  8. Der centrifugeres i 10 min på 13.000 x g ved 4 ° C.
  9. Omhyggeligt overføre 250 µL af den øverste vandige fase til en ny reaktion tube, pas på ikke for at bære eventuelle rester fra interfasen. Kassér den resterende prøve som organisk opløsningsmiddel affald.
  10. Tilsæt 25 µL af 5 M NaCl og 250 µL af isopropanol. Tilføj 5 µL af glykogen (20 mg/mL) som DNA luftfartsselskab. Bland godt af invertere rør og Ruger i 20 min. ved stuetemperatur. Der centrifugeres i 10 min på 13.000 x g ved 4 ° C til udfældes DNA.
  11. Vask DNA pellet med 400 µL af 70% (v/v) ethanol. Der centrifugeres i 10 min på 13.000 x g ved 4 ° C.
  12. Opsug supernatanten omhyggeligt og lad pellet tørre i 10 min. ved stuetemperatur. Resuspend i 100 µL TE buffer (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA).
  13. Inkuber ikke-de-crosslinked gratis DNA-prøven i 4 timer ved 65 ° C til at fjerne indbyrdes DNA krydsbindinger. Gemme prøver på-20 ° C.
  14. Kvantificere mængden af DNA ved hjælp af et spektrofotometer og køre en prøve for at kontrollere fragment størrelsen på en 2% (w/v) agarosegel. Justere klipning tid og intensitet, afhængigt af resultaterne af DNA størrelse analyse ved agarosegelelektroforese gel elektroforese, for at opnå en gennemsnitlig størrelse på 200-300 bp.

6. bestemmelse af frie Versus samlede DNA af kvantitative Real Time PCR (qRT-PCR)

  1. Forholdet mellem nucleosome-gratis DNA (i det følgende benævnt gratis DNA) versus samlede DNA bestemmes af qRT-PCR17,18. Prøver kan også analyseres kvantitativt af microarray hybridisering eller dyb sekvensering til genome-wide bestemmelser.
  2. Design qPCR primere for regioner skal testes og for positive og negative kontroller.
    NOTE: Egnet positive kontroller er primere beliggende i promotor af aktivt transskriberede husholdning gener såsom ACTB, GAPDH, TPI1 eller TUBA1A (kodning β-Actin, GAPDH, TPI eller α-Tubulin). Passende negative kontroller findes i heterochromatin regioner eller gen ørkener. Andre egnede negative kontroller kan designes i genomisk regioner støder op til den dynamisk regulerede locus undersøges til kontrol for lokal kopi nummer forskelle (tabel 1).
  3. Fortyndes DNA-prøver til en slutkoncentration på 10 ng/µL med TE buffer, og der tages hensyn til de endelige beregninger fortyndingsfaktoren (Se trin 6.5).
  4. Oprette en qPCR reaktion i tre i en 96-brønd plade, med de følgende mastermix pr. brønd: DNA-template: 20 ng (2 µL), fremad primer 200 nM (0.4 µL af en 5 µM bestand), omvendt primer 200 nM (0.4 µL af en 5 µM stock) , en kommerciel klar til brug mastermix indeholdende grønne farvestof (5 µL fra en 2 x bestand) og H2O til 10 µL.
  5. Køre i en realtid qPCR enhed, bruge tilstanden absolutte kvantificering og bestemme Ct af prøver med forskellige primer par. Beregn forholdet mellem opsving gratis DNA til samlede DNA for hver primer ved hjælp af følgende formel, under hensyntagen til fortynding faktorer fra trin 6.3:
    Equation 1
    Repræsentative resultater og et eksempel beregning er givet i tabel 2.
  6. For at kompensere for forskelle blandt prøver, normalisere til positiv kontrol opsving forholdet:
    Equation 2

Representative Results

Vi har brugt FAIRE metode til at måle forskelle i kromatin tilgængelighed af MHC klasse II gener i HEK293T celler som offentliggjort19. MHC klasse II kodning gener er udtrykt i antigen præsentere celler (PMV'er), enten constitutively eller som svar på cytokin signalering20. Udtryk for MHCII gener er drevet af en aktivator kompleks, som binder til specifikke DNA elementer, såkaldte XY kasser, beliggende i promotor og smagsforstærkere i disse gener21,22. Dette afspejles på niveauet af kromatin, som fremgår af vores FAIRE analyse af udvalgte områder i MHC klasse II gener HLA-DPB1 og HLA-DMA. Disse eksperimenter viste, at kromatin er åben på de regioner, som omfatter felterne XY, mens det er mere kompakt i gen organer (figur 2).

Som et eksempel, for beregninger, i dette særlige forsøg, vi fortyndet samlet DNA-prøve 10 gange (fortyndingsfaktoren 10), og gratis DNA-prøven var ikke fortyndet (fortyndingsfaktoren 1) for qRT-PCR. Cts opnået for de forskellige regioner, testet og beregninger til at opnå den endelige nyttiggørelse nøgletal og relative opsving nøgletal er anført i tabel 2. Disse relative opsving nøgletal blev indhentet ved hjælp af ACTB promotor som den positive kontrol. Bemærk, at disse beregninger for en af flergangsbestemmelser bruges til at generere resultaterne vist i figur 2.

I en anden sammenhæng, blev kromatin tilgængelighed testet i en model for inducerbar genekspression. I dette tilfælde blev hurtige ændringer af kromatin jordpakning som reaktion på pro-inflammatoriske stimulus tumornekrosefaktor (TNF) målt. HeLa celler blev efterladt ubehandlet eller stimuleret med TNF for 1 h, efterfulgt af FAIRE at måle kromatin jordpakning på promotor-regionen kontrollerende udtryk af genet kodning af TNF-responderende cytokin interleukin 8 (IL8). Disse resultater viste en stærkt øget kromatin tilgængelighed på IL8 promotor af TNF-stimuleret celler (figur 3). Tilgængelighed på IL-8 promotor efter TNF stimulation er endnu højere end der findes i ACTB initiativtageren viser en dramatisk kromatin remodeling i denne lovgivningsmæssige region. Som recovery forholdet fremstillet i dette tilfælde er højere end der opnås i regionen bruges som den positive kontrol (ACTB promotor) er relative opsving ratio højere end en.

Figure 1
Figur 1: The FAIRE arbejdsproces. Celler er crosslinked direkte i celle kultur kolbe eller fad ved at tilføje formaldehyd (A). Efter quenching af formaldehyd, er cellerne vaskes tre gange med is kold PBS (B) og overført til en reaktion tube hvor de er genopslemmes i FAIRE lysisbuffer og sonicated du kan forskyde DNA (C). En alikvot af det udtrukne kromatin er de-crosslinked ved opvarmning på 65 ° C, for at få den samlede DNA reference (D), og bagefter gratis DNA er udvundet ved hjælp af phenol: chloroform fra både crosslinked og de-crosslinked delprøver (E). Endelig DNA er kvantificeret, og forholdet mellem fri vs samlede DNA er beregnet (F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: bestemmelse af kromatin tilgængelighed i MHC klasse II genet klynge i HEK293T celler. HEK293T celler blev analyseret af FAIRE. Forholdet mellem fri versus samlede DNA (dvs., relative opsving ratio) blev der fastsat fortaler for ACTB-gen som positiv kontrol, et heterochromatin region på Chr. 12 som negativ kontrol, og lovgivningsmæssige områder og gen organer i MHC klasse II gener HLA-DMA og HLA-DPB1. Den øverste del viser en skematisk fremstilling af locus og holdninger af primere. Fejllinjer udgør standardafvigelser fra to biologiske replikater målt i tre. Tallet blev ændret fra en rapport offentliggjort19. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: ændringer i DNA tilgængelighed på IL8 promotor svar på TNF behandling. HeLa celler blev stimuleret med TNF (20 ng/mL) for 1 h og analyseret af FAIRE. Forholdet mellem fri versus samlede DNA blev der fastsat promotor af ACTB (positiv kontrol), et heterochromatin region på Chr. 12 (negativ kontrol) og IL8-promotor. Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien (SEM) fra tre biologiske replikater målt i dubletter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: optimering af sonikering betingelser. Kromatin udvundet fra 293T celler blev sonified ved hjælp af en fokuseret sonikator med passende rør (Tabel af materialer). Kromatin var sonicated for den angivne tid med gentagelser af 30 s med følgende indstillinger: spidseffekt 150, duty faktor 15, cykler pr. burst 500, efterfulgt af 30 s: spidseffekt 2.5 pligt faktor 15, cykler pr. burst 500. Den resulterende kromatin var de-crosslinked, renset af phenol: chloroform udvinding og indlæses i en 2%-agarosegel. En farvet gel ethidiumbromid er vist, og positioner i molekylvægt markører er angivet i bp. I dette eksperiment, blev optimal kromatin størrelse (200-300 bp) opnået efter 20 min af sonikering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Primer Sekvens
ACTB-promotor-F AAAGGCAACTTTCGGAACGG
ACTB-promotor-Rasmussen TTCCTCAATCTCGCTCTCGC
Chr. 12 negativ kontrol-F ATGGTTGCCACTGGGGATCT
Chr. 12 negativ kontrol-Rasmussen TGCCAAAGCCTAGGGGAAGA
HLA-DMA-XY-Box-F CATCAGTCACTGGGGAGACG
HLA-DMA-XY-Box-R GCTTCCCAGCCCAGTTACAT
HLA-DMA-5'-F GGAGAGAACAATCTCCGCTTCA
HLA-DMA-5'-R AGCTGCTATGTGTGGTTGGT
HLA-DMA-3'-F TGGGGACCTAGTTAGGGAGC
HLA-DMA-3'-R AGATCCATGGGAGGAGGCTT
HLA-DPB1-XY-Box-F GTCCAATCCCAGGGTCACAG
HLA-DPB1-XY-Box-R TGAAAAGAGCTGCAGTCAGGA
HLA-DPB1-5'-F GCGTGTTCATGTCTGCATCC
HLA-DPB1-5'-R TGATCCTCAGAGCCTGGACA
HLA-DPB1-3'-F CCAGCCTAGGGTGAATGTTT
HLA-DPB1-3'-R GCCTGGGTAGAAATCCGTCA
IL8 Promotor-F GTGATGACTCAGGTTTGCCCT
IL8 Promotor-Rasmussen CTTATGGAGTGCTCCGGTGG

Tabel 1: Primere for qPCR.

Table 2
Tabel 2: eksempel beregninger af FAIRE Relative opsving nøgletal. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

FAIRE er en robust og billig metode til identifikation af nucleosome-frie regioner. Det er baseret på princippet om, at DNA snoet omkring nucleosomes nemt kan crosslinked til histonerne. En phenol: chloroform udvinding bruges til at adskille ikke-crosslinked og protein-gratis DNA fragmenter fra protein-bundne DNA, som er fundet i den lavere phenol fase og til en vis grad i interfase (figur 1). Derfor, de nucleosome-frie regioner er overrepræsenteret i brøkdel af gratis DNA i den vandige fase. En række publikationer beskrive detaljerede protokoller af FAIRE metode23,24,25,26, som kan høres for at supplere proceduren beskrevet her.

I lighed med andre metoder, der anvendes til at bestemme strukturen kromatin, metoden FAIRE også kritisk afhænger af optimal klipning af DNA. Hvis fragmenter er for lange, vil nogen nucleosome-fri region blive maskeret af tilstødende kromatin-bundne DNA. Hvis fragmenter er for små, bliver detektering af qPCR eller dyb sekventering meget vanskeligt. Af denne grund, ultralydbehandling af DNA er en afgørende parameter, der skal kontrolleres og optimeret for at opnå fragmenter omkring 200-300 bp længde, der udgør 1-2 nucleosomes (figur 4).

En anden parameter, der kan påvirke det endelige resultat er crosslinking af prøven. Selv om fiksering proceduren beskrevet her er gyldig for de fleste cellelinjer, forskeren omhyggeligt skal evaluere dette trin for den bestemte prøve under undersøgelsen, især når du bruger væv, hvor længere optagelse gange kan være nødvendigt at tillade de formaldehyd til nå celler i alle vævsprøve.

I modsætning til andre metoder, såsom DNase jeg eller micrococcal nukleasen overfølsomhed, ChIP eller ATAC, FAIRE ikke stole på en enzymatisk aktivitet eller specifikke antistoffer, og det behøver derfor ikke titrering eller optimering af reaktionsbetingelser. Dette gør FAIRE en ideel metode til at måle kromatin tilgængelighed for labs med lidt erfaring i feltet kromatin. Desuden pilotforsøg er kun behov for at optimere DNA klipning trin og crosslinking tid, når det er nødvendigt.

Metoden blev oprindeligt udviklet i gær6, men det er også blevet udvidet til pattedyrsceller. DNA renset med metoden FAIRE kan bruges til dybe sekvensering, så genome-wide karakterisering af kromatin status. Det har allerede vist sig nyttig i en række undersøgelser8,9,10,11,12,13,19,27, 28.

Resultaterne fra FAIRE-seq eksperimenter viser et stort overlap med resultaterne af andre metoder såsom DNase-seq14, selv om nogle forskelle opstår. Dette er på grund af metodologiske forskelle som for eksempel afslappet eller ombygget nucleosomes kunne stadig hindrer spaltning af DNase jeg, mens disse DNA regioner ville være mindre tilbøjelige til at producere DNA/protein krydsbindinger og dermed ville blive bestemt som nucleosome-fri områder ved hjælp af FAIRE9. Også tilstedeværelsen af ikke-Histon proteiner såsom RNA polymeraser eller læser proteiner for epigenetiske mærker kunne resultere i DNA/protein krydsbindinger og dermed ville blive tolket som protein-pakket regioner i FAIRE eksperimenter. Disse begrænsninger er forbundet til hver metode anvendes til bestemmelse af kromatin stat, således at øge behovet for at bruge en kombination af forskellige metoder til at opnå en omfattende indsigt.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Tilman Borggrefe (universitetet i Giessen) for venligt deling sonikering enhed. Arbejde fra M.L.S. understøttes af tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (SCHM 1417/8-3), SFB/TRR81, SFB1021, SFB1213, Excellence klynge Cardio-pulmonal System (ECCPS, EXC 147/2), Deutsche Krebshilfe (111447) og programmet IMPRS-HLR af Max-Planck selskabet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 Carl Roth A156.1
Glycogen, 20 mg/ml Thermo Fisher R0561
ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, Rox Thermo Fisher AB1162B
Proteinase K, 20 mg/ml Thermo Fisher EO0491
RNase A, 10 mg/ml Thermo Fisher EN0531
Leupeptin Sigma L8511
Aprotinin Sigma A1603
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma 78830
milliTUBE 1 ml AFA Fiber Covaris 520130
Holder milliTUBE 1ml Covaris 500371
Covaris S220 Focused-ultrasonicator Covaris
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosistems 4376600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Struhl, K., Segal, E. Determinants of nucleosome positioning. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 267-273 (2013).
  2. Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol. Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
  3. Wu, C. The 5' ends of Drosophila heat shock genes in chromatin are hypersensitive to DNase I. Nature. 286 (5776), 854-860 (1980).
  4. Yuan, G. C., et al. Genome-scale identification of nucleosome positions in S. cerevisiae. Science. 309 (5734), 626-630 (2005).
  5. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat. Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  6. Nagy, P. L., Cleary, M. L., Brown, P. O., Lieb, J. D. Genomewide demarcation of RNA polymerase II transcription units revealed by physical fractionation of chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6364-6369 (2003).
  7. Nagy, P. L., Price, D. H. Formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. , (2009).
  8. Krinner, S., et al. CpG domains downstream of TSSs promote high levels of gene expression. Nucleic Acids Res. , 1-14 (2014).
  9. Gomez, N. C., et al. Widespread Chromatin Accessibility at Repetitive Elements Links Stem Cells with Human Cancer. Cell Rep. 17 (6), 1607-1620 (2016).
  10. Gaulton, K. J., et al. A map of open chromatin in human pancreatic islets. Nat. Genet. 42 (3), 255-259 (2010).
  11. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).
  12. Hurtado, A., Holmes, K. A., Ross-Innes, C. S., Schmidt, D., Carroll, J. S. FOXA1 is a key determinant of estrogen receptor function and endocrine response. Nat. Genet. 43 (1), 27-33 (2011).
  13. Filion, G. J., et al. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
  14. Davie, K., et al. Discovery of transcription factors and regulatory regions driving in vivo tumor development by ATAC-seq and FAIRE-seq open chromatin profiling. PLoS Genet. 11 (2), e1004994 (2015).
  15. Meyer, C. A., Liu, X. S. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat. Rev. Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
  16. Du, J., et al. Chromatin variation associated with liver metabolism is mediated by transposable elements. Epigenetics Chromatin. 9 (1), 28 (2016).
  17. Skinner, D. Z. Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications. Crop Sci. 54 (1), 455 (2014).
  18. Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. Good Practice Guide for the Application of Quantitative PCR (qPCR). Natl. Meas. Syst. , 50 (2013).
  19. Rodríguez-Gil, A., et al. The CCR4-NOT complex contributes to repression of Major Histocompatibility Complex class II transcription. Sci. Rep. 7 (1), 3547 (2017).
  20. Steimle, V., Siegrist, C. A., Mottet, A., Lisowska-Grospierre, B., Mach, B. Regulation of MHC class II expression by interferon-gamma mediated by the transactivator gene CIITA. Science. 265 (5168), 106-109 (1994).
  21. Choi, N. M., Majumder, P., Boss, J. M. Regulation of major histocompatibility complex class II genes. Curr. Opin. Immunol. 23 (1), 81-87 (2011).
  22. Ting, J. P. -Y., Trowsdale, J. Genetic control of MHC class II expression. Cell. 109 Suppl, S21-S33 (2002).
  23. Nammo, T., Rodríguez-Seguí, S. A., Ferrer, J. Mapping open chromatin with formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Methods Mol. Biol. 791, 287-296 (2011).
  24. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
  25. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. A detailed protocol for formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE). Curr. Protoc. Mol. Biol. , Chapter 21, Unit21.26 (2013).
  26. Giresi, P. G., Lieb, J. D. Isolation of active regulatory elements from eukaryotic chromatin using FAIRE (Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements). Methods. 48 (3), 233-239 (2009).
  27. Jung, S., Angarica, V. E., Andrade-Navarro, M. A., Buckley, N. J., Del Sol, A. Prediction of Chromatin Accessibility in Gene-Regulatory Regions from Transcriptomics Data. Sci. Rep. 7 (1), 4660 (2017).
  28. Pique-Regi, R., et al. Accurate inference of transcription factor binding from DNA sequence and chromatin accessibility data. Genome Res. 21 (3), 447-455 (2011).

Tags

Genetik spørgsmål 134 kromatin tilgængelighed FAIRE regulerende elementer nucleosomes fenol: chloroform udvinding protein-DNA bitmapgenkendelse
Formaldehyd-assisteret Isolation af regulerende elementer til foranstaltning kromatin tilgængelighed i pattedyrceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodríguez-Gil, A., Riedlinger,… More

Rodríguez-Gil, A., Riedlinger, T., Ritter, O., Saul, V. V., Schmitz, M. L. Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57272, doi:10.3791/57272 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter